以cosmid质粒为载体的稻瘟病菌转化体系的建立及病菌基因文库的构建

 用潮霉素B（ hygromycin B）抗性基因和λ噬菌体的cos位点组建了一种cosmid质粒pSVhygB，以此质粒建立了稻瘟病菌的转化体系，并且构建了病菌的基因组文库。结果表明，pSVhygB质粒可用于稳定地转化稻瘟病菌，转化频率约为15个转化子／μg DNA，电击法转化并不能有效地提高稻瘟病菌的转化频率。构建的稻瘟病基因文库中包含将近10000个重组子克隆，随机挑取12个重组子的鉴定表明，都包含有外源插入片段，说明所建文库已达要求。     

稻瘟病菌大片段DNA转化载体的构建

构建能够转化大片段DNA的载体是进行基因簇功能分析的重要手段。利用cosmid载体和pBHt2载体构建了一个可以在稻瘟病菌中转化大片段DNA的载体,通过农杆菌介导的转化方法,成功地将超过30kb的大片段DNA转化到稻瘟病菌中。研究结果将促进稻瘟病菌基因簇的功能分析。     

提高稻瘟病菌转化频率的研究

 为提高pAN7-1质粒导入稻瘟病菌建立的遗传转化体系的转化率，进行了对转化效率影响因子的研究。稻瘟病菌转化溶液中使用50 mmol/L CaCl₂浓度，PEG4000 40%或PEG80000 40%多聚物，添加30 μg鲱鱼精DNA，供体质粒DNA呈直线状都有利转化频率的提高。其中鲱鱼精DNA作用尤为显著，由于添加30 μg鲱鱼精DNA，转化频率高达71.6转化子/μg DNA。42℃热冲击对稻瘟病菌转化并非必需，转化溶液中添加受体菌2539w DNA后，反而引起转化频率的明显下降。     

利用显性选择标记基因转化稻瘟病菌（英文）

 利用抗药性标记基因(Hygromycin B, hygB)建立稻瘟病菌的转化系统。结果表明， Aspergillus的TrpC转录信号与细菌的hygB抗性结构基因重组的质粒pCSN43可取在稻瘟病菌中表达，该质粒与受体菌无同源顺序，因而有利于对转化菌株进行筛选和分析。 电激法和PEG/Ca^2＋ 法均适用于转化稻瘟病菌，但后者的转化效率比前者高。     

稻瘟病菌基因组中微卫星序列的频率和分布

 利用已经公布的稻瘟病菌基因组测序结果，对该植物病原真菌基因组中的微卫星（SSR）的类型、大小及分布进行了系统分析。在已经公布的37.89 Mb的基因组序列中，共有16 398个由1~6个核苷酸为基序的SSR序列（匹配值为80％），其总长度占整个基因组碱基数的0.87％，平均2.31 kb碱基中就分布有1个大于15 bp的SSR。其中数量最多的是单碱基重复，达到4 392个，其次为三碱基重复序列 （3 586个），五碱基重复序列（3 442个），这3种SSR总数达11 420个，占SSR的 69.7%。数量最少的是二碱基重复序列，只有680个。在整个基因组中的主要基序有A，AG，AC，ACG，AGC，AAG，GGC，ACCT，ATCC，AAAG，AAAAG，AAAAT，AAAAC，AAAAAG， AAAAAT和AACTAG。有的基序类型则完全没有出现。对不同超级连锁群的分析结果表明，各连锁群之间的SSR分布有一定差异，但总体上仍是较为均衡的。这些结果为稻瘟病菌的基因标记、群体结构研究、非编码区DNA序列的结构及功能研究提供了一个较好的基础。     

湖南稻瘟病菌群体遗传多样性与病菌致病型的关系

用8对SSR引物对230个稻瘟病菌菌株进行遗传多样性分析。经UPGMA聚类分析,在相异系数为0.23水平上,供试菌株划分为7个遗传宗谱,其中Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ宗谱为优势宗谱,所占比例分别为23.9%、23.5%和23.0%,Ⅳ和Ⅶ宗谱中分别只有1个和5个菌株,其所占比例仅为0.43%和2.17%。用7个全国统一鉴别品种对从230个菌株中选出的77个菌株进行致病型鉴定,结果表明湖南稻瘟病菌分属ZA、ZB、ZC、ZD、ZE、ZF、ZG等共7群30个致病型。其中 ZA、ZB、ZC 3个种群的分化较强,分别含6、10、7个致病型,其中ZG1为优势致病型,出现频率为26.5%。SSR标记的遗传多样性分析结果以及以不同鉴别品种表型来划分的致病型结果表明,菌株遗传宗谱与致病型不存在一一对应关系。     

温州稻区稻瘟病菌生理小种演变及主栽品种的抗性分析

 1991～1993年从温州稻区11个县(市、区)55个不同品种上采集481份稻瘟病标样，分离到354个单孢菌株，经7个中国稻瘟病菌鉴别品种鉴定，共检出7群23个小种，ZB群小种的分离频率较高，为80.23%，优势小种为ZB1、ZB9和ZB1３。与1981～1984年的小种普查结果相比，小种类型和结构发生了较大的变化。从温州稻区主栽品种病标样上分离的小种看，不同品种上的小种组成有差异，品种和小种之间存在着特定的亲和性关系。对温州稻区11个主栽品种的抗谱测定结果表明，汕优10号和辐籼6号的抗性较优，总体抗谱在76%以上，其他品种的抗谱均较差；多数主栽品种对优势小种的抗谱低于总体抗谱水平，该稻区的优势小种ZB1、ZB9和ZB13对主栽品种具有较强的致病性。选育或引进抗ZB群，尤其是ZB1、ZB9和ZB13小种的品种显得非常迫切和重要。     

农杆菌介导的稻瘟病菌转化及致病缺陷突变体筛选

在构建了两个含有潮霉素B磷酸转移酶基因双元载体的基础上,成功地实现了农杆菌介导的稻瘟病菌转化,转化效率达每1×106个分生孢子>300个转化子,并得到了4000多个转化子。通过继代培养和PCR检测,证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮霉素抗性基因可稳定遗传。Southern杂交分析表明,大约有2/3转化子的T DNA插入是单拷贝的。用大麦叶片离体接种的方法快速测定部分稻瘟病菌转化子的致病性,发现一个致病缺陷突变体：A1 412。该突变体不能侵入水稻叶片及擦伤的大麦或水稻叶片,说明A1 412突变体在寄主组织中扩展进程被阻断。进一步的表型分析发现A1 412突变体的产孢量显著下降,仅为野生菌株的7%,在疏水表面不能形成附着胞,部分分生孢子萌发也略有延迟。Southern 杂交显示A1 412基因组中T DNA插入是单拷贝的。上述结果表明,A1 412突变体表型的改变可能是由于T DNA插入而使某一具有重要生物学功能的基因失活所致。     

稻瘟病抗性基因的克隆及应用研究进展

稻瘟病是水稻三大病害之一,每年都给水稻生产造成巨大损失,挖掘并合理利用品种自身抗性是解决稻瘟病危害的最有效途径。本文综述了水稻稻瘟病抗性基因克隆、功能标记开发以及稻瘟病抗性分子标记辅助选择育种研究进展,为进一步克隆、研究、应用稻瘟病抗性基因提供理论指导。     

以农杆菌为介导花生的遗传转化研究I.质粒载体的分子鉴定及农杆菌菌株的转换

以农杆菌为介导将外源基因转入花生是花生遗传转化的主要途径之一，本研究利用含几丁质酶和β-，3-葡聚糖酶基因的植物双价表达成体pCGⅡ进行花生的遗传转化研究。首先对质粒表达成体进行分子鉴定，对LBA4404菌株进行抗生素抗性试验，并针对原有菌株(HLBA4404)对抗生素的不敏感性将其换为另一菌株(NLBA4404)，为花生的遗传转化奠定物质基础。     

Recovery and Biological Properties of Nitrate Non-utilizing Mutants of Rice Blast, Magnaporthe grisea

Eleven nitrate non-utilizing (nit) mutants were recovered from six isolates of Magnaporthe grisea cultured on MM media amended with 60 g/L potassium chlorate, with a frequency of 1.42 %. Some biological properties, such as growth rate, growth biomass, cultural characters, conidial production, sexual reproduction ability, and pathogenicity were compared between nit mutants and their parent isolates. Results showed that all the nit mutants were resistant to chlorate. Some important biological properties such as the growth rate on YPSA, conidial production ability on TPSA, pathogenicity, had no significant differences between nit mutants and their parent isolates. Mating type didn‘t change, but perithecia production ability of fertile isolates changed significantly as compared with that of their parent isolates. Therefore, the nit can be used as a genetic marker to study the genetics such as pathogenicity, fungicide resistance in Magnaporthe grisea.     

稻瘟病菌nit突变体的诱导及其生物学性状

将6个稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）菌株分别在含60 g/L氯酸钾的MM培养基上培养40 d后,共得到11个硝酸盐利用缺陷突变体（Nitrate nonutilizing mutants,简称nit突变体）,频率为1.42 %。比较了各nit突变体与亲本之间在无性和有性阶段的主要生物学性状,结果表明,所有的nit突变体均对氯酸钾产生了抗性。在YPSA平板上的生长速率、在TPSA平板上的产孢量和致病能力等重要的生物学性状都与亲本没有显著差异,交配型没有发生改变,但可交配菌株产子囊壳的能力与亲本有显著差异。因此,可以用nit作为遗传标记研究稻瘟病菌有关性状的遗传学。     

我国稻瘟病菌群体多样性研究

利用Pot2-rep-PCR技术对收集自我国14个省水稻产区的324个稻瘟病菌株进行了DNA指纹分析。稻瘟病菌在DNA水平上的变异比较高,具有很丰富的多态性;在20%的遗传距离水平上,170个单型被划分成20个遗传系谱,其中CL20是绝对优势系谱;对病菌系谱的地区分布分析发现,不同地区之间稻瘟菌的群体结构差异是明显的,但是也有部分菌株属于相同的系谱甚至是同一单型;14个省稻区的菌株指纹图谱可以分为明显的两类,江浙、北方等省稻区菌株的DNA指纹相似程度比较高,南方9省稻区菌株DNA指纹相似程度比较高,这可能与两类地区的主栽品种类型不同有关。     

Recovery and Biological Properties of Nitrate Non-utilizing Mutants of Rice Blast, Magnaporthe grisea

Eleven nitrate non-utilizing (nit) mutants were recovered from six isolates of Magnaporthe grisea cultured on MM media -amended with 60 g/L potassium chlorate, with a frequency of 1.42 %. Some biological properties, such as growth rate, growth biomass, cultural characters, conidial production, sexual reproduction ability, and pathogenicity were compared between nit mutants and their parent isolates. Results showed that all the nit mutants were resistant to chlorate. Some important biological properties such as the growth rate on YPSA, conidial production ability on TPSA, pathogenicity, had no significant differences between nit mutants and their parent isolates. Mating type didn't change, but perithecia production ability of fertile isolates changed significantly as compared with that of their parent isolates. Therefore, the nit can be used as a genetic marker to study the genetics such as pathogenicity, fungicide resistance in Magnaporthe grisea.     

稻瘟病菌T-DNA插入突变体库构建及致病相关突变体筛选

利用农杆菌T-DNA介导的遗传转化体系转化稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)Y34菌株,平均每转化1.0×106个稻瘟病菌分生孢子可得到约300个抗潮霉素菌株。用该转化体系转化和筛选,获得抗潮霉素菌株6855个。PCR检测结果表明,所有表现抗潮霉素菌株均含抗潮霉素基因,说明抗潮霉素特性是T-DNA携带潮霉素基因插入Y34基因组的表型效应,即抗潮霉素菌株是T-DNA插入突变体。对56个突变体DNASouthern检测结果表明,有27个突变体是单拷贝插入,突变体T-DNA插入拷贝数平均为1.43。随机取1600个突变体进行致病力测定,结果发现23个突变体完全丧失致病能力。