犬细小病毒的分离与鉴定

<正> 犬细小病毒(CPV)是引起犬急性出血性胃肠炎和幼犬心肌炎的主要病原。1977年首次由Eugster和Nairn从患腹泻的病犬粪便中分离出病毒,随后许多国家陆续报道。1980年秋以来,在我国警犬中发生疑似本病的流行,对养犬业造成了极大的威胁,严重影响了我国警(军)犬事业的发展。1982年开始使用国外引进疫苗,但仍未控制流行。为查清病原,确定病性,以便提供有效地诊断和     

犬细小病毒四川株的分离与鉴定

采集5份患出血性肠炎犬的粪便,通过猫肾细胞(F81)传代培养后,成功分离到2株病毒。对2株病毒进行病毒形态学、理化学、血凝试验、PCR鉴定与分子生物学系统鉴定后,证实分离株是犬细小病毒,通过VP2结构蛋白测序分析表明,新分离到的2株细小病毒抗原型分别属于CPV-2a和CPV-2b。     

犬细小病毒四川株的分离与鉴定

为更好地了解我国细小病毒流行情况,笔者从四川农大动物医院采集5份患出血性肠炎犬的粪便,通过猫肾细胞(F81)传代培养后,成功分离到两株犬细小病毒。对两株病毒进行病毒形态学、理化学、血凝试验、PCR鉴定与分子生物学系统鉴定后,证实分离株是犬细小病毒,通过VP2结构蛋白测序分析表明,新分离到的两株细小病毒抗原型分别属于CPV-2a和CPV-2b。     

犬细小病毒的分离鉴定

用猫肾(F81)细胞从沈阳某养犬场病死犬的肠内容物中,分离到1株细小病毒.根据犬细小病毒(CPV)VP2基因的核苷酸序列设计合成了两对特异性引物,对分离的病毒株进行PCR扩增,分别得到846 bp和815 bp的2个片段,PCR产物经纯化后测序,测序结果与GenBank中已发表的CPV参考株PLI-IV(typeFPV)、CPV-b(type2)、V154(type2a)、LCPV-V204(type2b)、LCPV-V139(type2c(a))和LCPV-V203(type2c(b))的VP2基因序列相比较,根据分析比较的数据结果,确定此株细小病毒为CPV-2a亚型.     

犬细小病毒YZ分离株的鉴定

对1999年冬季江苏省实验动物Beagle犬基地暴发的以拉稀、便血、高死亡率的病犬作流行病学调查、病理和实验室诊断。粪便血凝价高达2^14以上，并用HI加以验证，初步诊断为犬细小病毒感染引起的出血性肠炎。用FK81细胞（胎猎肾传代细胞）分离病毒，细胞上清HA试验阳性；负染电镜观察到在小为20nm左右的病毒粒子；接种病料的细胞IFA检测可见特异性的亮绿色荧光。在小肠的病理切片中见到典型的嗜酸性核内包涵体。以此确诊为犬细小病毒感染引起的出血性肠炎。利用双琼脂空斑技术克隆一株犬细小病毒，命名为CPV－YZ株，其核酸型是单链DNA，对甲醛敏感，对氯仿、酸、胰蛋白酶不敏感，80℃ 60分钟失去活力，0．1ml TCID50是10^-6.8,SDS-PAGE电泳两条清晰的条带分别为：76kD的VP1，64kD的VP2。     

犬细小病毒TZ2#株的分离与鉴定

采集疑似犬细小病毒(CPV)感染犬的粪便,采用同步培养法接种胎猫肾细胞(FK81)进行病毒分离鉴定。通过PCR检测、HA试验、PEG纯化,获得1株犬细小病毒,并命名为TZ2#株。感染的F81细胞48h后出现明显的细胞病变;在感染的FK81细胞中扩增出CPV基因的特异性片段;病毒液可凝集猪红细胞,血凝价为1∶64,其血凝性能被特异性抗体抑制。     

犬细小病毒敦化株的分离与鉴定

为了丰富我国延边地区犬细小病毒流行病学研究资料,为进一步研究有效的疫苗及诊断试剂做前期基础工作。采集延边州敦化市地区疑似犬细小病毒感染病犬的粪便样品,经过预处理后同步接种猫肾细胞(F81),盲传至细胞出现明显病变,经形态学、分子生物学、免疫学等方法进行分析鉴定。结果:分离到的病毒可使F81细胞出现特异性病变、电镜下可见清晰的病毒粒子、其培养物可使红细胞发生凝集且能被特异性阳性血清所抑制、用特异性引物进行PCR检测结果呈阳性、免疫荧光试验可见培养物出现特异性绿色荧光,针对其VP2序列建立的进化树显示其与new CPV-2b型犬细小病毒有较高的同源性。结论:通过上述试验确定分离出1株犬细小病毒,分离的病毒为new CPV-2b型,命名CPV-DH-3株。     

广东珠三角地区犬细小病毒分离与鉴定

为了解珠三角地区犬细小病毒(CPV)的流行情况及研制有效的疫苗,本研究开展了CPV流行病学调查,并将32份疑似CPV感染犬的粪便样品处理后接种F81细胞进行病毒分离,并对分离株进行鉴定。鉴定结果显示:32份样品中有19份样品提取液在F81细胞上可以产生明显的细胞病变;HA效价可达到1∶256。回归动物试验显示分离株可以导致犬出现明显的CPV感染症状,PCR鉴定也进一步确定所分离的病毒为CPV。通过VP2基因同源性分析显示分离株与国内主要的流行基因亚型CPV-2a的同源性达98%以上。     

犬细小病毒宁夏株的分离与鉴定

本试验采集宁夏地区疑似犬细小病毒感染病犬的粪便拭子,经过预处理后同步接种胎猫肾细胞(FK81),盲传3代后发现FK81细胞出现明显的细胞毒性改变(CPE)。冻融收获病毒后,对分离出来的病毒进行电镜观察、间接免疫荧光试验(IFA)检测、特异性PCR鉴定及VP2全基因序列扩增分析,成功分离培养出1株犬细小病毒(CPV)。     

鹅细小病毒HG5/82株的分离鉴定及生物学特性的研究

本研究通过对1982年黑龙江某鹅场发生的鹅细小病毒病疑似病例的肝病变组织病毒分离,进行回顾性研究.将肝脏加PBS研磨后,-70℃/37℃反复冻融三次,除菌过滤后接种12日龄鹅胚.发现病毒对鹅胚的致死时间为5～6 d,胚体体表有轻微出血点.鹅胚尿囊液经磷钨酸染色,可见具有典型特征的细小病毒粒子.将该病毒尿囊液在12日龄鹅胚中连续传16代,随着传代次数的增加,胚体多集中在3～4 d死亡.病毒传至第三代时死亡胚体头、颈、背部出现较为严重的出血点,体表有水肿.第五代病毒尿囊液(命名为HG5/82)对12日龄鹅胚的ELD50为10-5.92/0.1 mL.将20只12日龄雏鹅分为三个试验组和一个阴性对照组,各组分别接种鹅胚尿囊液104.92ELDso、103.92ELD50、102.92ELD50及生理盐水,发现雏鹅接种HG5/82后4 d出现轻微腹泻,随后恢复正常.用套式PCR检测雏鹅肛拭子病毒的体外排放情况.发现三个试验组在接种病毒后1～20 d用套式PCR均可检测到病毒.对照组及试验组接种后20～56d没有检测到病毒.将套式PCR产物进行序列测定并于参考毒株进行比较,表明该序列具有GPV相应区域的共同分子特征,与GPV参考毒株B的相应序列同源性达93.6%.本研究结果表明,该分离毒株为典型的鹅细小病毒(Goose Parvovirus,GPV),对雏鹅的致病力较弱.     

南京地区犬细小病毒基因型鉴定

为调查南京地区犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)基因型分布情况,采集南京市某宠物医院2012-2019年犬细小病毒病患犬粪便43份作为检测病料,通过PCR扩增犬细小病毒VP2基因片段,并将扩增产物测序,分析CPV基因型.结果显示,43份病料皆扩增出目的片段,经测序后使用MegAlign软件与Gen...     

致病性犬瘟热病毒CDV-JT1株的分离与鉴定

应用MDCK细胞从吉林某地犬瘟热(Canine distemper,CD)疑似发病犬肺脏组织中分离出1株病毒,该分离毒株经MDCK细胞传至第6代时出现典型的合胞体细胞病变(CPE)。经病毒形态观察、理化特性鉴定、RT-PCR和直接免疫荧光鉴定可知该分离毒株为犬瘟热病毒(CDV),命名为CDV-JT1;动物试验表明,试验犬接种CDV-JT1后21 d内都出现典型的犬瘟热症状;H基因序列分析表明,CDV-JT1株的H基因与中国分离株CDTaiChung株、TN株、SHLJ(07)1株、日本Hamamatsu株、Ueno株、Yanaka株和KDK-1株在基因型上同属于Asia-1型。CDV-JT1株含有包括CDV野毒株特有的309~311位在内的8个潜在的N-连接天冬酰氨糖基化位点。CDV-JT1强毒株的分离成功,对进一步开展疫苗研发、流行病学调查以及致病机理等方面的研究具有重要意义。     

贵州犬瘟热病毒的分离鉴定

对流行病学调查、临床症状检查和ELISA检测为犬瘟热阳性的自然发病犬,取肠内容物为病料,采用同步培养方法接种于犬肾细胞系(MDCK)进行病毒的分离,并对分离株进行了形态学特征、血凝特性、动物感染及RT-PCR鉴定。结果表明:病料接种MDCK细胞产生明显的细胞病变(CPE),电镜负染观察接毒细胞培养物见有典型的犬瘟热病毒粒子。分离株不凝集鸡及人“O”型红细胞,接种犬出现明显的临床症状和病理变化。用RT-PCR技术检测病毒细胞培养液,扩增出的片段长为760 bp,与预期设计的长度相同,由此确证分离株为犬瘟热病毒,命名为CDV-GZ2株。     

犬瘟热病毒强毒株HBF-1株的培育及致病性研究

为研究从北极狐病料样品中分离的一株强毒的致病性,本实验采用病例复制、RT-PCR检测、间接免疫荧光检测(IFA)和电镜观察等方法证实分离得到犬瘟热病毒(CDV),并命名为HBF-1。对该分离株H基因的核苷酸序列比对显示,HBF-1与疫苗株的同源性为91.0%～91.5%,与国内外分离株的同源性为93.5%～99.9%。病毒传代培育试验结果显示HBF-1已适应在北极狐、貉、水貂和犬体内繁殖,具有较广的感染范围。但各种动物的临床症状和剖检病理变化存在不同程度的差异,表明HBF-1分离株对北极狐、貉、水貂和犬的致病力不同;毒力测定结果显示其半数感染量分别为102.46 ID50/mL、102.95 ID50/mL、102.46 ID50/mL和102.58 ID50/mL,表明HBF-1为一株CDV强毒株,可以在不同的经济动物间进行水平传播。本研究结果为开发新的CDV疫苗提供了实验基础。     

同时检测犬瘟热病毒和犬细小病毒双重PCR方法的建立

为建立可以同时检测犬瘟热病毒(CDV)和犬细小病毒(CPV)的双重PCR方法,本研究根据GenBank登录的CDV N蛋白序列和CPV NS基因保守序列,设计合成2对特异性引物。通过优化反应条件,对CDV阳性病毒株反转录后的cDNA模板和CPV的DNA模板进行双重PCR扩增,同时得到2条与试验设计相符的669 bp(CDV)和392 bp(CPV)特异性条带,建立了同时检测CDV和CPV的双重PCR方法。实验结果表明:在同一PCR反应体系中可以同时检测这2种病毒,而对犬腺病毒Ⅰ型、犬腺病毒Ⅱ型、狂犬病毒检测均为阴性;CDV和CPV的最低检出限分别为101.8TCID50和101.4TCID50。采用该方法对在黑龙江省不同地区所采集的30份犬病料样品进行检测,CDV阳性率为30%;CPV阳性率为23.33%,表明建立的PCR方法可以用于临床诊断。     

貉源犬瘟热病毒CDV-ZC株分离鉴定、全基因测序与分析

应用非洲绿猴肾细胞(Vero)从山东省诸城市疑似犬瘟热(canine distemper,CD)感染貉的肝脏、脾脏、肺脏等组织病料的研磨上清液中分离出1株病毒。分离株经Vero细胞传至第4代出现典型的细胞病变效应(CPE),经毒力测定、血清学、RT-PCR检测及测序、回归动物试验证明为犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV),命名为CDV诸城分离株(CDV-ZC)。采用RT-PCR方法分段克隆分离株的全基因序列并测序,测序成功的各序列依次拼接得到全基因序列并进行序列比对。结果表明,CDV-ZC株全基因(KJ994343)与标准美洲型犬瘟热强毒株A75/17核苷酸同源性高达96.5%,而与疫苗株Onderstepoort、CDV3等亲缘关系较远,同源性为91.6%~92.0%。血凝素(H)基因序列分析表明,CDV-ZC株与国内野毒株LN(13)2、GP株等以及日本野毒株UENO、HAMA等共同归属于Asia-1型,在H蛋白信号淋巴细胞激活因子(SLAM)受体结合区即542~544位增加了1个潜在N-连接糖基化位点(N-X-S/T)。致病性强毒株CDV-ZC的成功分离及全基因序列测定加深了我们对当前中国CDV流行株遗传变异情况的了解,为CD的有效预防、诊断及控制提供理论依据。