桃PGIP蛋白基因片段的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达

【目的】克隆桃（Prunus persica）多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturonase-inhibiting protein,PGIP）基因,并进行原核表达研究。【方法】根据李属植物pgip保守区域设计1对特异引物,以桃叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约1 kb的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建融合表达质粒,转化到Escherichia coli Rosetta-gami（DE3）pLysS中进行表达。【结果】测序结果显示,桃多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白cDNA编码区长993 bp,编码330个氨基酸残基,命名为Pppgip。PpPGIP分子量为36.4 kD,等电点为7.42,信号肽为N端24个氨基酸残基,具有7个潜在的N-糖基化位点。Pppgip与李属其它pgip核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为93.2%～94.6%和89.7%～92.7%。同源树分析表明,该基因明显区别于其它pgip,与马哈利樱桃pgip的关系较近,与寿星桃、桃栽培品种‘久保’等pgip的关系都较远。该基因所编码的蛋白质的三维结构含11个α-螺旋和21个β-折叠,中心LRR结构域由10个串联的LRRs基序组成。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,重组蛋白主要以包涵体形式出现。【结论】克隆了桃PGIP基因,并可在大肠杆菌中表达。     

玉木耳漆酶基因Aclac的克隆及原核表达

【目的】对玉木耳漆酶基因Aclac进行克隆及原核表达分析,为深入研究漆酶基因在玉木耳子实体发育中的生物学功能提供理论依据。【方法】克隆Aclac基因的cDNA和DNA全长序列,对其进行生物信息学分析,并将目的基因连接至pET-28a质粒上以构建原核表达载体pET28a-Aclac,将其转化大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。【结果】克隆获得的Aclac基因cDNA序列长度为1734 bp,编码577个氨基酸残基;Aclac基因DNA序列长度为2521 bp,含14个内含子。AcLAC蛋白理论分子量为64.75 kD,理论等电点为5.70,不稳定指数为34.01,无跨膜区域,存在1个信号肽,在4个铜离子结合区高度保守,且含有Cupredoxin超家族蛋白保守功能域。AcLAC蛋白与真菌的漆酶蛋白聚为一支,其中,AcLAC蛋白与木耳属真菌的漆酶蛋白亲缘关系最近。AcLAC融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）表达宿主中成功表达,分子量为67 kD。【结论】克隆获得的Aclac基因属于Cupredoxin超家族基因,可在原核表达系统中异源表达,推测其与其他真菌漆酶基因在生物学功能上具有一致性,丰富了真菌漆酶资源。     

甘蓝型油菜BnClo1基因克隆、表达载体的构建及原核表达

【目的】克隆甘蓝型油菜(Brassica napus)油体钙蛋白(caleosin)基因BnClo1,并进行原核表达研究。【方法】在获得甘蓝型油菜BnClo1基因全长cDNA的基础上,根据BnClo1基因编码区设计1对特异引物,以甘蓝型油菜种子总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约750bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pTYB12中,构建融合表达载体pTYB12-BnClo1,转化到Escherichia coli ER2566(DE3)中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长768bp,包含完整的开放阅读框738bp,编码245个氨基酸残基,caleosin分子量为28.1kD。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,以20℃、4mmol·L-1IPTG诱导该基因表达效果最好,诱导产物为一个与理论值相符的83.1kD的融合蛋白intein-caleosin。【结论】克隆了油菜BnClo1基因,并在大肠杆菌中进行了优化表达。为进一步纯化和鉴定目的蛋白,及研究其功能奠定了试验基础。     

核盘菌多聚半乳糖醛酸酶基因克隆及诱饵蛋白表达载体构建

真菌多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)能够特异性识别真菌分泌的降解植物细胞壁的主要物质多聚半乳糖醛酸酶(PG)并抑制其活性.目前,酵母双杂交技术是快速、有效获取植物PGIP的主要途径,而其前提是要获得真菌PG的酵母诱饵载体.本研究以核盘菌的PG cDNA为模板,经PCR扩增获得1 125 bp片断,进一步将其克隆到pEASY-T1载体上.以克隆了目的基因的pEASY-T1质粒为模板,用含NdeⅠ和SalⅠ位点的引物对PG-F2/PG-R2扩增获得1 125 bp大小的目的片段,将其连接到pEASY-T1上生成pEASY-PG.用NdeⅠ和SalⅠ双酶切pEASY-PG,回收1 125 bp片段并连接到诱饵载体pGBKT7相应的酶切位点上,转化大肠杆菌菌株DH5α.在含有卡那青霉素的LB平板上筛选获得重组质粒.经NdeⅠ和SalⅠ双酶切后获得预期的1 125 bp DNA片段,表明诱饵蛋白载体pGBKT7-PG6构建成功.应用醋酸锂介导法将pGBKT7-PG6转化酵母菌株Y187,经激活培养基上培养检测,未发现蓝色菌落,表明酵母转化子自身不具有自激活功能,可用于大规模筛选经核盘菌诱导的cDNA表达文库.     

小菜蛾磷酸丝氨酸磷酸酶基因的克隆与原核异源表达

【目的】克隆小菜蛾磷酸丝氨酸磷酸酶基因(Plutella xylostellaphosphoserine phosphatase,PxPP),并进行原核异源表达,为小菜蛾抗性机理研究奠定基础。【方法】提取小菜蛾的总RNA,反转录获得总cDNA,采用RT-PCR方法扩增目的基因,将其克隆进T载体并测序,然后将目的基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)中表达。【结果】目的基因序列分析结果表明,PxPP阅读框全长693 bp,编码230个氨基酸,预测编码蛋白分子质量和等电点分别为25.6 ku和5.82,表达的融合蛋白分子质量为26.9 ku。【结论】成功克隆和表达了小菜蛾磷酸丝氨酸磷酸酶基因。     

鸡白痢沙门氏菌invA基因的克隆与原核表达

【目的】克隆鸡白痢沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因并进行原核表达,分析重组蛋白invA的抗原性,为沙门氏菌快速诊断试纸条和新型表位疫苗的研发提供理论依据。【方法】以鸡白痢沙门氏菌野毒株为供试菌,克隆其invA基因,对invA基因编码的蛋白进行生物信息学分析。将invA基因克隆到pET-30a原核表达载体上,构建原核重组表达质粒pET-30a-invA,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析,检测其目的蛋白的表达情况和免疫反应特性。【结果】成功获得了1 143bp的完整的invA基因,编码381个氨基酸。生物信息学分析结果表明,invA基因编码的蛋白有17个抗原决定簇,其跨膜区域明显,92-105位氨基酸为low complexity典型结构域。构建获得了原核重组表达质粒pET-30a-invA,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了约51ku的invA融合蛋白;Western-blot检测结果显示,该融合蛋白具有良好的免疫反应性。【结论】成功克隆出了1 143bp大小invA基因,明确了其编码蛋白的生物信息,其诱导表达后获得免疫反应性良好的重组蛋白。     

欧李八氢番茄红素合成酶cDNA克隆、序列分析及在大肠杆菌中的功能表达

 【目的】克隆、分析欧李[Cerasus humilis（Bge）Sok]八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase,PSY）基因,并利用大肠杆菌异源表达体系验证其功能。【方法】以欧李果实中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增到PSY cDNA中间片段,再利用RACE技术获得该基因cDNA全长并分析其序列;然后利用PCR技术获得欧李PSY cDNA编码区全长,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+),获得重组质粒pET-ChPSY,转化大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达,并利用工程菌株验证融合蛋白6×His-PSY的催化活性。【结果】欧李PSY cDNA全长1 559 bp,最大开放读码框为1 194 bp,可编码398个氨基酸,命名为ChPSY。核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物PSY核酸、氨基酸序列之间的相似性分别在70%和65%以上,并且发现欧李PSY的N末端存在1—55个氨基酸残基组成的转运肽信号序列,在37—58和219—240氨基酸区域包含2个跨膜结构域。SDS-PAGE分析表明,原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His-PSY,相对分子量约为45.8 kD。通过大肠杆菌异源表达证实ChPSY可编码一个功能蛋白,促进工程菌株中β-胡萝卜素含量增加。【结论】该研究成功地克隆了欧李PSY cDNA全长并在大肠杆菌中功能表达,为进一步研究该酶蛋白特性和欧李果实类胡萝卜素的合成机制奠定了基础。     

‘红肉脐橙’八氢番茄红素合成酶基因的克隆与原核表达

【目的】克隆、分析‘红肉脐橙’（Citrus sinensis Osbeck cv. Cara Cara）八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase,PSY）基因,并进行原核表达。【方法】以‘红肉脐橙’果实中分离的mRNA为模板,通过RT-PCR扩增到PSY cDNA片段,并分析其序列;利用PCR技术获得‘红肉脐橙’PSY cDNA的编码区全长,并将其克隆到原核表达载体pET28a(+),获得重组质粒pET-CitPSY转化大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达。【结果】‘红肉脐橙’PSY cDNA长1 520 bp,最大开放读码框为1 308 bp,可编码436个氨基酸,核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物PSY核酸、氨基酸序列之间的相似性分别在75%和70%以上,并且发现‘红肉脐橙’PSY的N末端存在转运肽信号序列,成熟的PSY包含1个跨膜结构域。原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His-PSY,Western-blot试验证实表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应,分子量约为52 kD。【结论】该研究为进一步开展柑橘果实色泽分子改良奠定了基础。     

用于筛选植物PGIP的酵母双杂交PGase诱饵载体

对真菌抗性较强的植物能利用自身的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturonase—inhibiting protein，PGIP）来抑制真菌分泌的、降解植物细胞壁的主要物质——多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PGase）的活性,目前，快速、有效的获取植物PGIP的方法是通过酵母双杂交技术来进行的，而这首先要获得真菌PGase的酵母诱饵载体．以真菌——互格链格孢PGase的cDNA的为基础，将其克隆到MATCHMAKER LexA Two—Hybrid System的诱饵载体中，并将诱饵载体（pLexA—PGase）成功转化酵母菌株EGY478[p8op-lacZ]，经检测无自激活作用，可直接用于快速、大量地筛选植物PGIP．     

茶树类黄酮O-甲基转移酶基因的克隆及原核表达分析

【目的】克隆茶树（Camellia sinensis） 的一个类黄酮O-甲基转移酶基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为进一步研究其酶学特性和调控茶树中甲基化类黄酮物质的代谢机理奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以从茶树叶片中提取的总RNA为模板,结合RT-PCR与RACE克隆技术获得该基因cDNA全长,测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。【结果】该基因cDNA全长为1 246 bp,其开放阅读框为1 077 bp,编码358个氨基酸,推测的蛋白分子量为40.2 kD,理论等电点为5.62;其核苷酸编码序列与葡萄和毛果杨的类黄酮O-甲基转移酶基因相似性分别为80%和81%;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白相符合。【结论】利用RT-PCR与RACE克隆技术从茶树叶片中克隆得到了一个类黄酮O-甲基转移酶基因,成功构建了原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到了高效表达。     

条形柄锈菌赖草专化型和披碱草专化型

通过显微镜观察和人工接种方法,对我国西北地区普遍发生的赖草(Leymus secalinus)条锈病和麦(艹宾)草(Elymus tangutorum)条锈病的病菌进行了系统鉴定。结果发现,赖草条锈病菌和麦(艹宾)草条锈病菌均不能侵染所有小麦条锈菌鉴别寄主及感病品种,它们和小麦条锈菌各有不同的寄主范围和主要寄主,在孢子尺度、夏孢子芽孔数目、有无一室冬孢子等方面的一些差异尚不足以达到变种级别。因此,赖草条锈病菌和麦(艹宾)草条锈病菌应分别属于条形柄锈菌的两个新专化型,即赖草专化型(Puccinia striiformisWest.f.sp.leymi)和披碱草专化型(P.striiformis West.f.sp.elymi)。     

兰州百合和有斑百合的核型研究

【目的】研究兰州百合及有斑百合的染色体核型。【方法】利用染色体常规压片的方法,对兰州百合和有斑百合的染色体数目及核型进行了研究和分析。【结果】兰州百合的核型公式为2n=2x=24=2m+2sm+6st+14t,相对长度为6.35%～12.07%,核型不对称系数为83.25%,染色体相对差异较大。有斑百合的核型公式为2n=2x=24=4m+12st+8t,相对长度为6.11%～12.90%,核型不对称系数为80.11%。【结论】兰州百合的核型类型属于3A型,有斑百合的核型类型为3B型,以有斑百合核型的进化较高,可见不同居群的百合间核型存在差异。     

黄芽白与红菜薹杂种后代的细胞遗传学特征

将白菜型油菜不同栽培种‘红菜薹’和‘黄芽白’进行正反交获得杂种一代,再经过多代自交获得高世代杂种。观察杂种后代形态学特征(叶型、株高、分枝数等）、育性特征（花粉育性、自交结实率）和花粉母细胞减数分裂染色体行为特征。结果表明经过多代自交,杂种后代各性状趋于稳定,正反交杂种形态有较大差异,而高世代杂种与杂种一代相比,形态没有明显变化。杂种后代花粉育性和自交结实率都比较高,花粉可育率均达到90%以上,但与双亲相比仍然稍差。杂种后代花粉母细胞减数分裂比较正常,但仍有少数细胞出现异常染色体行为。杂种后代减数分裂终变期染色体联会主要以形成环状和棒状的二价体为主,但也形成四价体等其他染色体构型。杂种后代中平均形成二价体的数目在6.7～8.2,最多全部20条染色体形成10个二价体,其中形成环状二价体和棒状二价体的比例相差不大。除了形成二价体外,部分花粉母细胞还形成少数四价体。与亲本相比,杂种后代染色体联会出现较多的非同源联会,平均每个细胞形成二价体的数目比亲本少,而形成四价体的数目比亲本多。在减数分裂后期Ⅰ,同源染色体分开并移向细胞两极,减数分裂后期Ⅱ,染色单体分开最终形成四分体。在此过程中,绝大多细胞染色体行为正常,但有个别细胞出现后期Ⅰ染色体不均等分离,有些细胞同源染色体分开时形成染色体桥;有些细胞在减数分裂Ⅱ中期和后期出现落后染色体。此杂种后代减数分裂过程较正常,探明杂种后代的减数分裂特征可为白菜型油菜杂交育种提供理论依据。     

青梗白菜细胞核雄性不育基因向乌塌菜中的转育

为解决乌塌菜杂交种生产中的杂交制种手段问题。以大白菜核不育"复等位基因遗传"假说为指导,以青梗小白菜核基因雄性不育系08S02作不育源,采用杂交、自交、兄妹交方法,向乌塌菜可育品系08S05中转育不育基因。选育出具有50%乌塌菜遗传性状、不育株率为100%的核基因雄性不育系,拓宽了青梗白菜核不育基因的应用范围。     

Identification of QTLs Related to Bolting in Brassica rapa ssp. pekinensis （syn. Brassica campestris ssp. pekinensis）

A genetic linkage map of Brassica rapa ssp. pekinensis was constructed with 186 AFLP （amplified fragment length polymorphism） markers by using a doubled-haploid （DH） population with 183 individuals. The individuals were derived from F1 which was developed by crossing a bolting resistant DH line Y-177-12 and an easy bolting DH line Y195-93a. AFLPs were generated by the use of restriction enzymes EcoR Ⅰ and Mse Ⅰ . The segregation of each marker and linkage was analyzed by using JoinMap version 3.0. Mapped markers were aligned in ten linkage groups which covered 887.8 cM with an average marker interval of 4.47 cM. Markers showing skewed segregation ratio were clustered in six LGs. Quantitative trait loci （QTL） were mapped for bolting resistance by using MAPQTL 4.0 package. Four QTLs explaining from 7.0 to 9.4% of the total variation were detected, all of them increase bolting resistance. These mapped QTLs could be used to develop a marker assisted selection programme for bolting resistance breeding.     

不同木霉菌株对黄瓜枯萎病菌的拮抗作用

比较不同木霉菌株对黄瓜枯萎病菌的竞争作用、重寄生作用、抗生作用和防病作用的差异,筛选出高效菌株,为利用木霉菌防治土传病害提供理论依据。通过与致病菌对峙培养,研究竞争作用。结果表明:供试木霉菌能限制黄瓜枯萎病菌的菌丝扩展,哈茨木霉(Trichoderma harzianum)TH菌株竞争作用最强,菌丝扩展抑制率为67.70%。试验发现木霉菌株能够通过紧贴、缠绕、穿透等方式寄生于黄瓜枯萎病菌的菌丝上,最后引起菌丝断裂,细胞内容物外泄。通过无菌滤膜过滤获得的不同木霉菌代谢产物抗生作用明显,TH菌株代谢产物的抑菌圈直径达到3.9cm,对黄瓜枯萎病菌的菌丝生长和孢子萌发的抑制率分别为57.19%和68.35%。盆栽试验结果显示,育苗时施加木霉菌株不同程度控制苗期黄瓜枯萎病的发生,TH菌株防病作用最强,防效为64.34%,绿色木霉(Trichoderma viride)TV菌株促进黄瓜生长作用最强,地上部分和地下部分鲜质量分别增加42.81%和86.92%。     

柔软滨麦草及其杂交后代抗条锈性的研究

对柔软滨麦草及其杂交后代生物学特性及抗锈性的关系进行了初步研究，结果认为，亲本的叶表皮毛密度和气孔密度与侵入前的抗锈性有极高的相关性，而其杂交后代无此种关系，表明亲本的物理抗锈因素没有传递给后代，其抗锈性由其他因素决定。     

小麦条锈菌果胶酶基因PsPL1的克隆与功能分析

【目的】研究小麦条锈菌果胶酶基因PsPL1的功能,确定其在小麦条锈菌侵染过程中的作用,为揭示小麦与病原菌互作的分子机理奠定理论基础。【方法】利用RACE技术扩增PsPL1基因全长,通过qRT-PCR对PsPL1的表达特征进行分析,并在酵母系统中验证其编码蛋白信号肽的分泌功能,最后通过HIGS技术沉默PsPL1基因,确定其在条锈菌侵染小麦过程中的作用。【结果】克隆得到PsPL1基因全长,其ORF长471bp,编码157个氨基酸;经预测PsPL1蛋白包含一个果胶酶保守结构域,N端含有一段由21个氨基酸组成的信号肽序列;经酵母系统验证,确定PsPL1蛋白信号肽具有分泌功能;qRT-PCR分析发现,PsPL1在条锈菌侵染早期表达上调;利用HIGS技术沉默PsPL1基因后,条锈菌的产孢量没有发生明显变化。【结论】成功克隆了小麦条锈菌果胶酶基因PsPL1,明确了其分泌特性及表达特征。     

分蘖洋葱和普通洋葱营养品质的比较

【目的】对分蘖洋葱和普通洋葱的营养品质进行对比分析,为分蘖洋葱营养价值的进一步研究提供科学依据。【方法】测定紫皮和黄皮普通洋葱及褐皮和黄皮分蘖洋葱不同部位的基本营养成分和特殊风味物质含量,比较种类和品种间各营养成分含量的差异。【结果】分蘖洋葱干物质质量分数为9.37%~19.20%,可溶性糖含量为89.34~132.99mg/g,可溶性蛋白含量为1.54~2.46 mg/g,游离氨基酸含量为1.56~2.85μg/g,丙酮酸浓度为62.31~123.67μmol/mL,黄酮类化合物含量为2 193.4~2 648.2mg/kg;基本营养成分和丙酮酸含量均为内层鳞茎高于外层鳞茎,黄酮类化合物含量为外层鳞茎高于内层鳞茎;褐皮分蘖洋葱除可溶性糖和黄酮类化合物外,其他营养物质含量均低于黄皮分蘖洋葱。【结论】分蘖洋葱基本营养成分和特殊风味物质含量均显著高于普通洋葱;相同类型不同皮色间在营养成分含量上存在差异,且不同成分间的差异性不同;从各种营养物质的分布看,除黄酮类化合物外均表现为内层鳞茎高于外层鳞茎。     

MutL调控水稻黄单胞菌的致病力

为了了解水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo)中 的MutL/MutS系统是否参与DNA修复以及是否调控病原菌的致病力,构建了mutL突变体,比较了野生型与mutL突变体的突变率差异,野生型、mutL突变体及其互补菌株侵染水稻的能力。结果显示,mutL突变导致Xoo在H₂O₂胁迫下的突变率显著升高,mutL突变导致Xoo致病力下降,表明DNA错配修复蛋白MutL参与Xoo的DNA修复并正调控Xoo致病力。