家蚕脂肪体组织基因表达谱的研究I．家蚕5龄中期幼虫脂肪体组织基因表达分析

以大规模EST测序为基础，用生物信息学方法分析了家蚕5龄3d脂肪体组织基因表达的特征，共获取脂肪体组织EST 12 721个。经Plarap程序拼接得到2316个非冗余序列，其中包括824个contigs，l492个singletons。在鉴定出的已知基因中，基因表达频率有明显差异：物质代谢相关基因表达量最高，占总量的58．2％；其次为转录翻译调节相关基因和酶类基因，分别占15．5％和14．5％。在高量表达基因中，有贮藏蛋白、蛋白酶抑制剂、类IDGF蛋白、抗菌蛋白、谷胱甘肽-S转移酶等。结果表明，脂肪体组织基因表达的种类很多，特征明显，与脂肪体在蚕体内的贮藏功能、蛋白质合成功能、代谢调节功能以及变态发育有密切关系。     

家蚕5龄幼虫后部丝腺细胞酶基因表达的比较分析

基于了解家蚕后部丝腺细胞分泌丝素蛋白基因的表达调控信息,阐明蚕茧高产的机理,根据EST分析结果,分析了家蚕5龄幼虫不同发育时期后部丝腺细胞中酶基因的表达谱特征。发现家蚕5龄幼虫第1天和第5天的生理生化反应涉及氧化还原酶的数量最多,达到30个,转移酶数量达28个,水解酶数量达22个,合成酶数量达12个,裂合酶数量达6个,异构酶数量最少,只有4个。这6种酶基因在家蚕5龄第1天和第5天之间表达差异不大,表达频率超过10次的酶只有细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ、细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ、S腺苷甲硫氨酸合成酶和肽基脯氨酸顺反异构酶。上述结果暗示家蚕5龄不同时期,丝素蛋白合成能力的差异与酶分子的数量关系不密切。     

家蚕EST数据库的应用现状及展望

家蚕是重要的经济昆虫,也是鳞翅目昆虫的主要模式生物。表达序列标签(EST)在家蚕研究中的应用越来越受到关注。本文主要介绍了EST数据库的建立及其在家蚕研究中的应用现状,展望了EST在家蚕中的研究趋势。     

家蚕幼虫性腺表达序列标签分析(英文)

分别以5龄幼虫的精巢和卵巢构建了2个家蚕cDNA文库.利用表达序列标签方法分析参与家蚕性腺发育的基因,通过测序获得 16 737条ESTs(精巢 8 407条,卵巢 8 330条),拼接这些ESTs共得到 2 107个重叠群(contig)和 3 532个单拷贝(singlet).将这些转录物与GenBank非冗余蛋白质库比较,结果显示约34.3%的基因与数据库中蛋白质具有相似性.功能注释表明蛋白质合成相关基因、精巢特异基因等在文库中大量存在.基因本体(gene ontology)功能分类显示精巢与卵巢基因表达谱差异较大.研究结果为理解家蚕性腺发育提供了信息.     

家蚕幼虫性腺表达序列标签分析（英文）

分别以5龄幼虫的精巢和卵巢构建了2个家蚕cDNA文库。利用表达序列标签方法分析参与家蚕性腺发育的基因,通过测序获得16 737条ESTs（精巢8 407条,卵巢8 330条）,拼接这些ESTs共得到2 107个重叠群（con-tig）和3 532个单拷贝（singlet）。将这些转录物与GenBank非冗余蛋白质库比较,结果显示约34.3%的基因与数据库中蛋白质具有相似性。功能注释表明蛋白质合成相关基因、精巢特异基因等在文库中大量存在。基因本体（gene ontology）功能分类显示精巢与卵巢基因表达谱差异较大。研究结果为理解家蚕性腺发育提供了信息。     

基于GC-MS技术分析感染BmNPV家蚕幼虫脂肪体组织的代谢特征

选择抗脓病家蚕品种白玉N和敏感品种白玉为研究对象,运用GC-MS技术对添食接种高浓度BmNPV前后2个品种5龄幼虫的4种脂肪体组织样品进行代谢组学研究,分析受到BmNPV胁迫后脂肪体组织在代谢组水平发生的变化,筛选差异代谢物,并进一步分析差异代谢通路。结果显示:抗性品种白玉N和敏感品种白玉的幼虫脂肪体中共检出各类差异代谢物407种,主要包括氨基酸、糖类、核苷酸、醛和酮等小分子物质,其中胱氨酸、正缬氨酸、香芹酮、岩藻糖等24种代谢物特异性地出现在某一个参比样品中。根据差异代谢物进行KEGG代谢通路富集分析,再对每个参比组中差异最显著的10条代谢通路进行功能聚类,获得可能造成不同品种间抗病性迥异的3条代谢通路,即嘌呤代谢、嘧啶代谢以及泛酸和辅酶A的生物合成,这些代谢通路与家蚕的能量代谢和供给、体内DNA和RNA合成以及氮代谢密切相关。     

家蚕微孢子虫cDNA文库的构建及部分EST同源性分析

以成熟的家蚕微孢子虫 (Nosemabombycis,N .b)为实验材料 ,以λTriplEx2为载体 ,构建了滴度为 1 86× 10 6pfu/mL ,插入片段平均在 5 0 0bp以上的较高质量的家蚕微孢子虫cDNA文库。从cDNA文库中随机挑取 180个克隆进行EST测序 ,得到了 130个有效序列。经BLASTn、BLASTx同源性分析后发现 ,7个ESTs编码基因在氨基酸水平上与脑孢虫有较高的同源性 ,推定为家蚕微孢子虫基因 (putativegene) ,同时获得了 2 7个未知序列。     

家蚕脂肪体合成蛋白质变化的研究

应用双向电泳、同位素标记、放射自显影及计算机蛋白质电泳图谱分析技术研究了家蚕 5龄期和变态期脂肪体合成蛋白质的变化。结果表明 ,在 5龄中期脂肪体合成蛋白质的种类、分泌蛋白质的量、合成蛋白质的速度都达到最大值 ,合成脂肪体组织蛋白质在 5龄中期也快速增加 ,显示在 5龄中期脂肪体的蛋白质合成水平达到最大值 ,而熟蚕期后脂肪体合成蛋白质种类、分泌量及合成速度都下降 ,表明脂肪体蛋白质合成水平下降 ,在蛋白质合成水平上证明了家蚕脂肪体从幼虫期的合成、代谢等主要功能向变态期的贮藏功能转变。     

利用SAGE方法分析家蚕基因表达数目的初探

SAGE(serial analysis of gene expression)是基因表达水平差异分析和大规模发现新基因的分子生物学技术。已构建了家蚕卵、幼虫、蛹、成虫等4个不同发育时期的SAGE表达库,经测序分别得到69 100、62 232、63 966和62 666个基因标签序列,其中特异标签数目依次为17 718、13 243、14 044和15 224。这些特异标签数目即为家蚕在这4个不同发育时期的基因转录本数量。根据测序数与获得标签的数量动态监测,发现测序的数目尚未达到饱和,因此基因转录本的数目还可能会有所增加。在上述研究的基础上,利用SAGE数据为基础,采用双倒数作图求最大值的方法,推测出了家蚕在4个不同发育时期的基因表达数目,同时也发现家蚕卵期的基因表达数目远远大于其它3个时期。     

基于数字基因表达谱(DGE)分析异烟肼诱导家蚕脂肪体损伤的差异表达基因

以无脊椎动物家蚕为实验动物,采用高通量测序技术分析人结核病治疗药物异烟肼(INH)诱导蚕体脂肪体损伤状态下的相关基因信息。供试5龄第3天家蚕幼虫分别按照1、2 mg/头的剂量经口给予INH后8 h,解剖获取家蚕脂肪体组织并提取总RNA,利用RNA-Seq测序技术分别构建INH诱导组和CK对照组家蚕脂肪体的数字基因表达谱(digital gene expression,DGE)文库。比对2个DGE文库的差异表达基因,并进行GO功能分析和KEGG通路分析,结果显示:INH影响了家蚕脂肪体中功能基因的表达,其中下调表达的基因数目明显较多,这些差异表达基因的GO分类和所在的KEGG通路,均集中在核酸损伤、细胞外信号转导、细胞凋亡与氧化应激过程、蛋白质代谢、药物代谢过程和免疫毒性等几大通路中。选择4个分别与肝损伤、药物代谢、线粒体能量代谢有关的差异表达基因进行qRT-PCR检测,结果与DGE文库的表达一致。另外,家蚕脂肪体经HE和DAPI染色后亦可观察到INH对细胞的损伤;测定不同浓度INH及作用时间下家蚕脂肪体中与肝损伤有关的谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的活性显著提高,但2种酶的变化趋势不一样。推测INH造成机体组织损伤可能与其和机体内的大分子物质结合,从而影响到这些大分子发挥参与多种代谢通路调节机体正常生理活动的作用有关。     

一种家蚕胚胎发育因子的分子克隆及分析

利用表达序列标签（Expression sequence tag,EST）和电子克隆等技术,克隆家蚕BmEDF基因cDNA电子序列,经RT—PCR生物验证正确,登录GenBank（DQ443161）。BmEDF基因cDNA长1098bp,ORF全长810bp,编码产生269个氨基酸。BmEDF基因编码的蛋白分子量约为30．7kDa,等电点（PI）为9．16。本研究将对今后分子水平分析胚胎发育提供研究基础。     

化学感受蛋白家族基因在家蚕5龄幼虫表皮中的表达分析

化学感受蛋白(chemosensory protein,CSPs)在昆虫的免疫反应、生长发育及信号传递过程中起重要作用。以耐高温家蚕品种为材料,研究高温饲养环境下,作为家蚕物理屏障及感觉器官的表皮中化学感受蛋白基因的表达变化。依据从家蚕基因组数据库获得的15个家蚕CSPs基因(Bm CSPs)的序列设计引物,通过RT-PCR检测正常饲育温度(28℃±0.5℃)下,Bm CSP1、Bm CSP4、Bm CSP6、Bm CSP7、Bm CSP8、Bm CSP9、Bm CSP11和Bm CSP15等8个基因在家蚕5龄第2天幼虫的表皮中有表达;通过半定量RT-PCR和qRT-PCR检测在高温(35℃±0.5℃)饲育环境下,5龄第2天幼虫表皮中Bm CSP8和Bm CSP15的表达水平显著上调,其他6个Bm CSPs基因的表达水平未见显著变化。初步推测Bm CSP8和Bm CSP15可能与家蚕幼虫对高温环境的应激反应有关。     

家蚕经菊酯类农药诱导后脂肪体蛋白的表达谱及烯醇酶基因的组织转录活性

为了从蛋白质水平探讨家蚕对菊酯类农药的抗性机制,采用双向电泳结合基质辅助质量飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术,分析家蚕5龄幼虫经氯氰菊酯诱导前后脂肪体蛋白的表达特征。采用ImageMaster6.0软件分析表明,对照组共检测到432个蛋白点,诱导实验组检测到369个蛋白点,其中能匹配的蛋白点有342对,匹配率为76.68%。对特征蛋白进行MALDI-TOF-MS分析鉴定的蛋白包括烯醇酶、线粒体醛脱氢酶、伴侣素、肌动蛋白、gag-like蛋白。烯醇酶(enolase)是糖酵解过程中极为重要的酶类。采用半定量RT-PCR对经氯氰菊酯诱导后的家蚕脑、中肠、丝腺、脂肪体、精巢、马氏管、血液等7个组织器官的烯醇酶基因进行表达分析,结果表明,烯醇酶基因转录水平在7个组织器官中都呈现下调趋势,分别下调了13.79%、10.71%、22.48%、7.40%、27.00%、11.50%、14.52%,其中脂肪体的烯醇酶基因表达和蛋白的表达下调一致。受菊酯类农药诱导的影响,家蚕5龄幼虫脂肪体蛋白的数目减少,烯醇酶基因在各组织器官减量表达,提示可能与蚕体的基础生理代谢受到抑制有关。     

家蚕细胞周期素E基因在5龄幼虫组织表达的剪切变体和表达谱特征

细胞周期素E(cyclinE)是调控细胞周期从G1期进入S期的关键因子。利用家蚕基因组数据库信息设计引物,克隆家蚕cyclinE在5龄幼虫不同组织表达的cDNA序列,获得该基因的6种不同剪切变体,这6种剪切变体前4个外显子和最后一个外显子都相同,变化主要集中在第5~7外显子处。同源性比对显示,不同物种来源的cyclinE周期蛋白盒区域具有较高的保守性,有35个氨基酸的共同保守序列,该区域可能也是家蚕cyclinE的特异识别并结合细胞周期素依赖蛋白激酶的功能区域。利用实时定量PCR分析显示,cyclinE在家蚕5龄第3天幼虫的中肠、脂肪体、丝腺、脑、马氏管、精巢、卵巢、血液等8种组织、器官中均有表达,并且在脂肪体中的表达相对较高,推测cyclinE基因在家蚕脂肪体细胞分裂过程中发挥重要作用。     

家蚕5龄幼虫蛋白质代谢研究初探

家蚕幼虫5龄期间蛋白质含量的变化约为体重变化的3倍,整个蚕体的蛋白质含量在第3和第4天之间有一个明显的突增。分析相应的蛋白水解酶活力变化,发现酶活力呈现先升后降的变化趋势,在第4和第5天时活力达到峰值。进一步提取血液、消化液以及脂肪体蛋白水解酶进行研究,结果表明血液和消化液蛋白水解酶的活力变化与蚕体消化、吸收和转化桑叶蛋白的生理进程基本一致。     

杀虫剂辛硫磷诱导家蚕脂肪体蛋白的表达特征及SerB基因的组织转录活性分析

为了从蛋白质水平探讨家蚕对有机磷杀虫剂的抗性机制,采用双向电泳结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术,分析家蚕5龄中期幼虫在添食杀虫剂辛硫磷前后脂肪体蛋白的表达特征。经ImageMaster6.0软件分析表明,对照组共检测到465个蛋白点,实验组检测到396个蛋白点,其中能匹配的蛋白点有348对,匹配率为73.54%。对特征蛋白进行质谱分析,已鉴定的蛋白包括磷酸丝氨酸转氨酶(SerB)和5'-甲硫腺苷磷酸化酶(MTAP)。采用半定量RT-PCR分析家蚕5龄幼虫添食辛硫磷后脑、中肠、丝腺、脂肪体、精巢、马氏管等6个组织器官中SerB基因mRNA的转录水平,结果与对照组相比均呈现上调趋势,其中在脑组织的转录水平上调尤为明显,在脂肪体中的转录水平上调与其蛋白的表达上调一致。受辛硫磷诱导的影响,家蚕5龄中期幼虫脂肪体的蛋白数目减少,SerB基因在各组织器官增量表达,推测可能与蚕体对农药的代谢解毒作用有关。     

应用基因表达系列分析(SAGE)技术研究高温处理前后家蚕的基因表达差异

高温对家蚕的生理和免疫能力有明显影响。为从分子水平上探究家蚕抗高温机制,应用基因表达系列分析(SAGE)技术获得家蚕5龄雌蚕高温处理前后中肠、丝腺和脂肪体组织的基因表达谱,构建高温组(34℃)和常温组(26℃)2个家蚕SAGE文库。2个家蚕SAGE文库分别包含3555107和3580976个原始标签,其中的标签种类分别为113684和131 296个,清洁标签的种类分别为45972和49467。比较2个文库清洁标签获得65 535种差异标签,共注释4249个基因,其中有1 062个差异表达的基因(P<0.05,错误检测率FDR≤0.001并且拷贝数的差异在2倍以上)。经GO分析发现2个文库中基因的分布极其相似,表明这些基因在不同的环境温度下有类似的生物学功能并参与类似的生理代谢过程。KEGG pathway分析显示有732个基因涉及176个KEGG路径,其中有40个为差异表达基因显著富集的路径(P<0.05),超过一半的路径与代谢、生物合成和信号传导有关。上述结果有助于对家蚕抗高温基因的鉴定以及探究基因调控的网络关系。     

家蚕谷胱甘肽-S-转移酶E4基因的组织表达和序列特征及重组蛋白的酶活性分析

昆虫体内的谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)主要行使对异生或内源有毒物质进行代谢解毒的功能。选择家蚕谷胱甘肽-S-转移酶E4的编码基因Bmgste4为靶标,研究其组织表达谱、序列结构特征及原核表达重组蛋白的酶活性。RT-PCR检测不同组织表达特征的结果显示,Bmgste4基因在家蚕5龄第3天幼虫的头部、触角、下颚须、表皮、脂肪体、丝腺以及雄性个体的马氏管和雌性个体的卵巢中均有表达,而在血细胞、中肠以及雄性个体的精巢和雌性个体的马氏管中不表达。多序列比对结果显示BmGSTE4具有完整和保守的GST二级结构特征,N端氨基酸残基保守,特别是谷胱甘肽结合位点。构建插入Bmgste4基因开放阅读框片段的重组表达质粒p28-Bmgste4,并转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞进行原核表达后,利用分光光度法测定重组蛋白对通用底物1-氯-2,4-二硝基苯的酶活参数:Km=0.58 mmol/L,Vmax=24.55μmol/(mg.min)。这些结果为进一步研究家蚕体内解毒和抗药性机制以及开发鳞翅目害虫新型生物防治药剂提供了基础信息。     

家蚕氨肽酶N家族基因在5龄幼虫中肠组织的表达分析

氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)是一种偏好水解蛋白质或寡肽N端中性氨基酸的酶,在鳞翅目昆虫中主要分布于中肠上皮细胞的刷状缘囊膜上,是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)伴孢晶体(Cry)毒素的重要受体蛋白。为了研究家蚕APN家族基因的表达特征,运用Real-time PCR技术检测分析该家族基因在不同家蚕品种幼虫中肠组织的表达差异以及同一家蚕品种幼虫中肠组织中该家族基因各个成员的表达丰度。在所有供试家蚕品种的幼虫中肠组织均可检测到APN家族基因的表达,但不同化性家蚕品种间APN基因的表达水平存在显著差异(P<0.05),而相同化性品种间的差异较小(P>0.05);在同一家蚕品种幼虫中肠组织中,APN2、APN4、APN5基因的表达量较高,而APN1及APN3基因的表达量较低。研究结果有助于进一步研究家蚕APN家族基因的作用机制,并为家蚕抗Bt品种的选育提供理论依据。     

家蚕伴性温敏基因表达的分析

在家蚕一些特殊品种中,存在着一种伴性温敏性性状,该性状在蚕卵胚胎的发育阶段,当用30℃左右的高温和特殊的干燥环境条件催青时,便可以明显地从表现型上观察出来。敏感性认为是由位于Z性染色体上的一个主基因控制的,暂称为伴性温敏基因。该基因的敏感性表达发生在胚胎发育的后期。当用带有温敏基因的品种为父本与非温敏性的品种为母本杂交,组成杂种一代,可利用高温干燥的催青条件控制雌蚕基本不孵化,而雄蚕正常孵化。雌雄的孵出比率为5∶95左右。