鸡传染性支气管炎病毒（IBV）结构蛋白的研究

应用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ对病毒的结构蛋白研究结果显示：Ｔ珠病毒与Ｍ４１和Ｈ５２的结构蛋白存在一定的相似性,均具有分子量为９０ＫＤ、８４ＫＤ、６７ＫＤ和４３ＫＤ的蛋白带,但Ｔ株病毒还具有一定分子量为６１ＫＤ的条带,而且它相对含量很高,肾型传支上海地区野毒株与Ｔ株相似,也主要具有这条６１ＫＤ的条带,应用兔抗ＩＢＶ－Ｔ血清转印,显示６４ＫＤ结构蛋白均具有较高的免疫反应怀,推测在肾型传支中该结构蛋白与诱导保护     

鸡肾型传染性支气管炎病毒(IBV)的分离和某些生物学特性研究

用鸡胚传代方法从肾脏肿大的病死雏鸡分离到了两株鸡肾型传染性支气管炎病毒,命名为ＭＫ和ＭＧ,并对其某些生物学特性进行了研究。结果分离的两株病毒在电镜下表现为典型的冠状病毒形态;接种易感雏鸡能引起明显的肾脏病变;含病毒的鸡胚尿囊液经１％胰酶处理后能凝集鸡红细胞,且于接种后７２～９６ｈ的活胚尿囊液血凝价较高;能干扰新城疫在鸡胚中的增殖;鸡胚半数感染量ＭＫ－６为１０７７５／ｍｌ、ＭＧ－６为１０７５／ｍｌ。     

鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白基因的克隆及序列测定

根据IBV病毒的已报道基因序列设计了用于扩增鸡传染性支气管炎病毒M41株S1基因和T株核衣壳蛋白基因(N)的引物。经RT-PCR得到了预期大小的扩增产物；将目的条带纯化并回收以后，克隆到pMD18-T质粒载体中，对插入片段进行序列测定。并与已发表的IBV S1、N基因序列进行了比较和分析，表明具有高度同源性。证明我们克隆了IBV S1和N结构蛋白基因。     

siRNA对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)复制的影响

RNA干涉(RNAi)可以通过短双链RNA(siRNA)介导,特异地降解相应的mRNA,从而抑制基因表达,导致转录后水平的基因沉默(PTGS)。本研究利用这种技术,将鸡传染性支气管炎病毒(IBV)感染体外培养的Vero-E6,使其适应Vero-E6,然后用体外转录合成的针对IBV部分基因的siRNA,对其复制进行RNAi。结果显示,针对IBVM蛋白的siRNA能有效地抑制IBV在Vero-E6细胞中的复制。     

肾炎型鸡传染性支气管炎研究现状

本文对近几年来关于鸡肾炎型传染性支气管炎的研究报告进行了综述。     

传染性支气管炎病毒(IBV)小囊膜蛋白基因的原核表达

以传染性支气管炎病毒(IBV)M41毒株为材料,克隆该毒株的小囊膜蛋白(E)基因,并将其连接到表达载体pGEX-6P-1中,转化到大肠杆菌BL21中。经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析目的蛋白与谷胱苷肽硫转移酶(GST,大小约为26ku)融合后大小约为38ku,表明目的蛋白相对分子质量约为12.4。这一结论为E蛋白的进一步研究提供了条件。     

斑点免疫金检测鸡传染性支气管炎病毒的研究

通过胶体金标记提纯后的兔抗ＩＢＶＩｇＧ，建立了一种以微孔滤膜为固相载体，以红色胶体金为标记物，检测鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）的斑点免疫金测定法（ＤＩＧＦＡ）。ＤＩＧＦＡ对ＩＢＶ的最小检出量为２０．３×１０￣（－８）ｇ，在１０份自然病例样品中检出８份。鸡胚培养法以育传３～５代，出现侏儒胚者为阳性，从上述样品中检出６份。对接种ＩＢＶ的鸡胚尿囊液，ＤＩＧＦＡ法检出率为１００％。实验结果表明，ＤＩＧＦＡ法对鸡传染性支气管炎的早期诊断具有简便、灵敏、快速、特异性强和重复性好等优点。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定与防治

[目的]对新疆疑似肾型传染性支气管炎发病鸡病料进行病毒分离和鉴定.[方法]采用3种不同的治疗方案对发病鸡群进行治疗.[结果]经过处理的病料组织在SPF鸡胚上盲传至第3～4代后,鸡胚出现尿囊绒毛膜增厚,鸡胚卷缩变小、侏儒胚等鸡传染性支气管炎的特征性病变.将收获的病毒液进行电镜观察、病毒中和试验、病毒干扰试验、动物回归试验等证实,分离的3株病毒均属于鸡肾型传染性支气管炎病毒.[结论]电解多维+肾肿散(中药)+阿莫西林组合的治疗效果最好,治愈率达到80;～90;.     

鸡肾型传染性支气管炎(IB)疫苗的研制

用鸡传染性支气管炎病毒X株接种10日龄鸡胚尿囊腔,收集尿囊液,经甲醛灭活后,按一定的比例,以矿物油为佐剂制成油乳剂灭活苗,免疫鸡30d后,保护率达100％,并呈现良好的体液免疫应答,血凝抑制抗体效价达2     

鸡传染性支气管炎病毒的分型新进展

鸡传染性支气管炎是危害养殖业的重要疫病之一,由于IBV血清型众多,加之IBV基因极易发生变异,因此临床上对于该病的预防常常出现免疫失败。对于IBV的分型目前没有统一的标准,笔者阐述了国内外对IBV的分型新进展,为研究鸡传染性支气管炎病的病原学和疫苗学提供重要的理论依据。     

鸡传染性支气管炎病毒上海地方分离株的RT—PCR快速检测

根据已报道的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）基因序列设计了1对可用于扩增不同病毒株N基因片段的引物，得到了预期的438bp长的产物，并将此RT－PCR方法与鸡胚盲传法结合用于分离、检测IBV。分离病毒的扩增条带经纯化和回收以后，克隆到pMD18-T质粒载体中。在对插入片段进行序列测定后，我们将测序结果与已发表的IBV N基因序列进行了比较，证实具有极高的同源性，表明分离的是IBV。据此建立起一种更加快速、有效的分离、鉴定IBV的方法。     

IBV陕西分离株M基因的克隆与遗传变异分析

为了研究IBV陕西分离株M基因的遗传变异情况及分子特征,参照NCBI所登录的IBVM基因序列设计了1对引物,应用RT-PCR方法对陕西8株IBV分离株的M基因进行扩增,并构建克隆载体,对阳性质粒测序后进行核苷酸序列及氨基酸序列同源性和进化发生关系分析,并对M蛋白的二级结构和跨膜区进行预测。结果表明,8个IBV分离株间的M基因核苷酸和M蛋白氨基酸同源性分别为92.3%~99.8%和95.4%~100%,分离毒株与参考毒株的M基因核苷酸和M蛋白氨基酸序列同源性分别为87.4%~99.5%和89.4%~99.5%;分离毒株与参考毒株M蛋白的α-螺旋结构主要分布在N端前100氨基酸肽段区,其他的部分主要是β-折叠和无规则卷曲结构;分离毒株的M蛋白均包含有3个跨膜区。表明IBV分离株M蛋白在基因序列和二级结构上相对保守。     

鸡传染性支气管炎病毒上海地方分离株的RT-PCR快速检测

根据已报道的鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)基因序列设计了 1对可用于扩增不同病毒株N基因片段的引物 ,得到了预期的 438bp长的产物 ,并将此RT PCR方法与鸡胚盲传法结合用于分离、检测IBV。分离病毒的扩增条带经纯化和回收以后 ,克隆到pMD18 T质粒载体中。在对插入片段进行序列测定后 ,我们将测序结果与已发表的IBVN基因序列进行了比较 ,证实具有极高的同源性 ,表明分离的是IBV。据此建立起一种更加快速、有效的分离、鉴定IBV的方法。     

鸡体内传染性支气管炎病毒的分布及消长

对两周龄SPF鸡用鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M41株攻击时,以0．3ml／羽(100EID50)滴鼻人工感染发病,试验鸡出现气管哆音等典型的IBV临床症状,以及气管、肺、肾脏等器官的组织学病变。经nested RT-PCR全程跟踪检测,掌握了IBV M41株经呼吸道感染后动物带毒、排毒的时间规律,从而为控制和降低IB的发生提供参考。     

中国禽肾病变IBV分离株S1基因的RT-PCR/RFLP特性

对中国１３个省市分离到的２９个肾病变ＩＢＶ毒株作了Ｓ１基因的ＲＴ－ＰＣＲ／ＲＦＬＰ特性鉴定．用相同的一对引物,８个毒株———广东／０１／８３,河南／０４／９４,河南／０５／９４,内蒙／０１／９３,江苏／０１／９３,河南／０１／９３,天津／０２／９３,内蒙／０２／９３,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增获得了包含有Ｓ１基因ｃＤＮＡ的１７３４ｂｐ的片段;河南／０６／９５的为一１０００ｂｐ左右的片段;其它２０个毒株没有结果．经ＲＦＬＰ分析,广东／０１／８３,河南／０４／９４,河南／０５／９４,内蒙／０１／９３归类于Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｓ血清型,江苏／０１／９３归于Ｇｒａｙ血清型,河南／０１／９３,天津／０２／９３,内蒙／０２／９３是新的变异株．研究结果表明,国内禽肾病变ＩＢ的致病毒株,在不同的地区有其特异的变异株,也有一个共同的血清型———Ｍａｓａｃｈｕｓｅｔｓ型的毒株     

鸡传染性支气管炎病毒N基因片段的RT-PCR扩增及限制性内切酶分析

根据鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)的已报道基因序列设计了 1对可扩增 N基因片段的引物 ,并得到了预期的 438bp扩增产物 ;将目的条带纯化并回收后 ,克隆到 PMD18- T质粒载体中 ,对插入片段进行序列测定 ,并与已发表的 IBV N基因序列进行了比较 ,证实扩增和克隆的产物是正确的 ;根据扩增的 N基因的序列 ,选择了 Bst X 酶对 IBV进行分析 ,发现 M41和澳大利亚 T株 Bst X 酶切图谱存在明显的差异 ,从而建立了一种新的鉴定 IBV病毒的方法。     

基于荧光显色的IBV LAMP检测方法研究

【目的】建立基于荧光显色的可视化禽传染性支气管炎病毒（IBV）环介导等温扩增（LAMP）检测体系,为IBV的快速临床检测提供有力的技术支持。【方法】根据NCBI中收录的IBV 5a+5b基因的8个区域设计了3对LAMP引物,通过对反应体系各组分和条件的优化,建立IBV LAMP检测方法,并对该方法的特异性和敏感性进行验证。分别用SYBR Green I和一定浓度比的钙黄绿素/锰离子混合物作为显色剂,对IBV LAMP检测结果进行可视化判定。应用该检测体系和PCR方法对临床送检的60份样品同时进行检测,比较2种方法的阳性检出率。【结果】成功建立了IBV LAMP检测方法,该方法能够在等温（63 ℃）条件下1 h内完成反应,具有良好的敏感性和特异性,最低可以检出1拷贝/μL的阳性重组质粒,比普通PCR方法敏感100倍,而对其他病毒检测结果均为阴性。应用SYBR Green I和钙黄绿素/锰离子显色时,阴阳性样品均有强烈的颜色对比,其中0.05 mmol/L钙黄绿素与0.6 mmol/L锰离子混合液可以用于LAMP扩增产物的判断,其结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致。在对60份临床样本的检测中,LAMP和PCR方法检测出的阳性样本数量分别为49份和42份。【结论】建立了基于荧光显色的IBV LAMP检测方法,该方法具有在科研机构、基层实验室特别是检测现场推广和应用的潜力。     

IBV广东地方株D41 S1基因PCR产物的酶切分析及其意义

对广东肾变病型鸡中分离致弱的ＩＢＶ Ｄ４１株Ｓ１基因ＰＣＲ产物作了Ｈａｅ Ⅲ酶切分析，发现其酶切产物与ＩＢＶ Ｍ４１的一样，而与美国肾变型标准株Ｇｒａｙ、Ｈｏｌｔｅ不同。根据国外用ＲＦＬＰ区分ＩＢＶ血清型的判定标准，Ｄ４１株应归属于马萨诸塞血清型，综合此分离株的其它特性，说明华南地区存在着ＩＢＶ变异株的流行。     

IBV S1蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

采用RT-PCR方法,以IBVM41毒株的S1基因为模板扩增出了大小为468bp的目的片段(命名为poly156S1),该片断保守性、抗原性较好。将获得的目的基因定向克隆到表达载体pET-32a-c(+)中,获得了重组质粒pET-32a-c(+)-poly156S1。将该重组质粒转入表达菌Origami(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,获得了大小约为34KD的重组蛋白poly156S1。Western-blot证实该重组蛋白能与IBV阳性鸡血清发生特异性反应。用纯化好的重组蛋白poly156S1免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行单克隆抗体的制备,成功获得了针对M41S1蛋白的3株单克隆杂交瘤细胞8D2、8D6、10F9,其IgG亚类分别为IgG1、IgG2a、IgG2b,轻链均为κ型。按常规方法对各株单克隆杂交瘤细胞进行了小鼠腹水单抗的制备与纯化,并用以重组蛋白poly156S1为包被抗原的间接ELISA对纯化后的腹水单抗进行了效价测定,及其与重组蛋白poly156S1亲和力的分析。结果表明:腹水单抗8D2、8D6、10F9的ELISA效价分别达到1.78×218,1.37×221,1.31×216;单抗8D6与重组蛋白poly156S1的亲和力最高。Western-blot进一步证实单抗8D6与重组蛋白poly156S1具有良好的反应性。     

鸡气管上皮细胞分离培养及传支病毒在其培养特性研究

 【目的】探索鸡气管上皮细胞（chicken trachea epithelium,CTE）分离培养技术,并研究传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）在CTE中培养特性。【方法】利用气管灌注冷消化法分离培养CTE,对CTE特异性8/18角蛋白作免疫组化鉴定上皮细胞。培养的CTE分别接种IBV M41株和T株,分别在接种后第12～96小时观察接毒细胞形态学变化,应用电镜技术观察CTE细胞病变和病毒粒子结构,利用RT-PCR技术检测CTE中病毒核酸并对CTE中IBV的血凝性和鸡胚致病性进行检测。【结果】利用灌注冷消化法可以获得形态完整并带有纤毛的CTE,细胞活性高,经过3步纯化后的CTE均一性高、生长快。两株IBV感染的CTE分别在接毒72和84 h后产生明显的细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）,血凝性和致鸡胚病变检测结果呈阳性。【结论】本研究成功分离培养了CTE,可以为CTE相关研究提供技术支持,并为IBV基础研究和应用奠定基础。