梨火疫病菌分子检测新靶标——EAsdiA基因的克隆与应用

SdiA属于与群体效应相关的luxR家族基因，目前已证实存在于Escherichia coli和Salmonella typhimurium基因组中。本研究从梨火疫病菌中克隆到了一个sdiA的同源基因，命名为EAsdiA，该基因与Es. coli和S. typhimurium的sdiA基因在氨基酸水平上分别有45.42%和43.33%的同源性，与其他细菌的luxR同源基因的同源性更低。根据梨火疫病菌EAsdiA和其它病原细菌的luxR基因的序列比对设计了一对特异引物F-EAluxR和R-EAluxR，该引物能够特异地检测梨火疫病菌，检测灵敏度为 10个菌体，在含有梨组织浸出液的情况下可检测到102个菌体。本研究是首次从梨火疫病菌中克隆SdiA基因并应用于该病菌分子检测的报道。     

梨火疫病菌luxR转录调节因子的克隆与功能分析

梨火疫病菌(Erwinia amylovora)是一种具有毁灭性的植物病原细菌,能够侵染梨、苹果和其他蔷薇科植物引起火疫病,造成严重的经济损失。luxR家族调控因子具有重要的生理生化作用,是细菌群体感应机制中研究较多的一类重要的转录调节基因。本研究采用PCR技术从梨火疫病菌中扩增出一个luxR同源基因,命名为EaluxR,应用同源重组的方法构建了突变株(EaΔluxR),并对其功能进行初步研究。实验结果表明,EaΔluxR与野生型菌株相比产生的多烯大环内酯类代谢产物在抗氧化压力和生长情况方面有明显差异,对梨幼苗及幼果的致病能力下降;但是EaΔluxR仍能引起烟草过敏性反应,并且在抗生素耐受水平和生物膜的生成方面与野生型菌株相比没有明显差异。研究表明,梨火疫病菌对病菌的生长、次级代谢产物、抗氧化压力以及致病性方面具有关键作用,为深入认识梨火疫的群体感应系统提供了科学依据。     

梨火疫病菌(Erwinia amylovora)双精氨酸运输系统基因(tatC)的功能分析

梨火疫病菌(Erwinia amylovora)可引起梨、苹果等蔷薇科植物的火疫病.双精氨酸运输系统(Tat)与致病相关蛋白的转运有特定的联系.本研究在梨火疫病菌全基因组中发现了同源基因,通过同源重组的方法,构建了梨火疫病菌的tatC基因突变体以及互补子.研究结果表明,tatC基因影响着梨火疫病菌的致病性、胞外多糖、鞭毛运动、游动性、趋化性、生长情况等多种生物学特性.然而,Ea△tatC仍能引起烟草过敏性反应,并且在胞外纤维素和生物膜的生成方面与野生型菌株相比没有明显差异.说明梨火疫病菌tatC基因对病菌的生长、游动性以及致病性方面具有关键作用.     

梨火疫菌(Erwinia amylovora)环腺苷酸受体蛋白基因(crp)的功能分析

梨火疫菌(Erwinia amylovora)可引起梨、苹果等蔷薇科(Rosaceae)植物的火疫病.在菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)中,由crp基因编码的环腺苷酸受体蛋白(cyclic adenosine monphosphate(cAMP)receptor protein,CRP)对果胶酶基因的表达调控和菌株致病性起着重要的作用.本研究首次鉴定并克隆出梨火疫菌中的crp同源基因,命名为Eacrp,并通过同源重组的方法,构建了梨火疫菌的crp基因突变体Ea△crp以及互补子,进行了致病性、过敏性反应、胞外多糖、鞭毛运动等一系列相关表型的鉴定.结果表明,crp基因影响着梨火疫菌的致病性、胞外多糖、游动性、生长情况等多种生物学特性,然而,Ea△crp仍能引起烟草过敏性反应,并且在过氧化氢敏感度以及沉降性、生物膜和AI-2信号分子的生成方面与野生型菌株相比差异明显.本研究结果说明,梨火疫菌crp基因对病菌的胞外多糖分泌、生长、游动性以及致病性方面具有关键作用.     

步双重PCR法检测梨火疫病原细菌(Erwinia amylovora)

由梨火疫病原细菌（Erwinia amylovora）导致的火疫病（fire blight）是梨、苹果及其它蔷薇科植物上的毁灭性病害,我国将其定为对外一类检疫性有害生物。该病随种苗、果实及包装材料传播。目前国际上所建立的E.amylovora分子检测技术主要基于该病菌所含有的pEA29质粒序列,研究发现失去质粒的人工突变菌株的致病力下降，认为质粒对于梨火疫病菌的致病力是至关重要的。虽然带有pEA29质粒的梨火疫病菌菌株在自然界中占有绝对的数量，但Llop et al．（2006）报道了自然侵染的植物中存在具有致病力但不含pEA29质粒的梨火疫病菌（IVIA1614-2a菌株）。     

梨火疫病菌的免疫检测技术（简报）

首次采用免疫分离和免疫鉴定相结合的方法对梨火疫病菌进行检测,检测样本中的目的的菌检测灵敏度达１０＾１－１０＾２ｃｆｕ／ｍＬ,回收率达３０％以上。检测人工接种材料,进口或国产的苹果,梨以及在江苏省内定点采集样品的结果,除实验室人工接种材料阳性外,所检测样品中均不带梨火疫病菌。     

瓜类细菌性果斑病菌luxR基因的功能分析

luxR基因作为信号分子受体蛋白的编码基因,在革兰氏阴性菌群体感应(quorum sensing,QS)LuxI/LuxR环路中起重要作用.本研究采用PCR技术从瓜类细菌性果斑病菌(Acidovgorax avenae subsp.citrulli)xjL12中扩增出luxR同源基因,应用同源重组的方法构建了突变株(△luxR),并对其功能进行初步研究.实验结果表明,△luxR与野生型菌株相比产生的群体感应信号分子浓度降低,抗生素耐受水平有所提高,对哈密瓜(Cucuumis melo var.cantalupensis))幼苗的致病能力下降;RT-PCR实验表明,luxR基因的缺失对luxI基因的表达有抑制作用.本研究为今后对以luxR基因为靶标,利用信号干扰技术综合防治瓜类细菌性果斑病提供基础资料.     

巴西固氮螺菌Yu62glnZ基因及其相邻基因的克隆和序列分析

通过原位杂交从巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense)Yu62的基因组文库中获得glnZ基因的阳性克隆，对该阳性克隆进行亚克隆和序列分析，结果表明glnZ基因位于3.7kb的SaLI片段上，glnZ基因编码区长336bp，编码的产物是Pz蛋白，由112个氨基酸组成，分子量为1.12kD。用Blastax软件对Pz蛋白的氨基酸序列在GenBank数据库中进行同源比较，结果表明Pz蛋白与其它几种固氮菌及大肠杆菌的GlnK蛋白的同源性（identities）达66％以上；与PⅡ蛋白的同源性达64％以上。glnZ基因上游是部分ubiH-like基因，与E.coli ubjH基因（编码辅酶Q，ubiquinone)N－端有31％的同源性（identity）和50％相似性（similarity)；glnZ基因下游是aat-like基因，与E.coli和Bacillus subtilis aat基因（编码天冬氨酸氨基转移酶，aspartate aminotransferase)有同源性和相似性都为26％和42％；aat-like基因下游是部分ftsK-like基因，与E.coli ftsK基因（编码肽聚糖，peptidoglycan)N-端有42％同源性和56％相似性，这几个基因在GenBank中的登录呈是AF279917。     

利用cryparin基因的启动子构建板栗疫病菌高效表达载体

低毒病毒／板栗疫病菌是研究植物病原菌致病机理和病毒与宿主相互作用的一个优秀模式系统。本研究克隆了板栗疫病菌转录水平最高的crypari凡基因的启动子,并构建了由该启动子控制的表达载体。构建的载体能成功表达GFP蛋白。利用该载体表达积累量较高的CHV1-Eur07病毒的病毒量控制基因,能提高细胞内CHV1-EP721的积累量,反式互补效率从常用的gpd启动子控制的低于10％提高至67％和80％。高效表达载体的成功构建,为研究板栗疫病菌功能基因以及低毒病毒与宿主板栗疫病菌的相互作用提供了新的工具。     

壳聚糖酶基因的克隆与序列分析

本研究采用一对引物从巨大芽孢杆菌BS-0409中成功地克隆了壳聚糖酶基因（Csn） 全基因序列,大小为516bp,将其在NCBI网站上用BLAST程序进行在线检索分析,结果与多种芽孢杆菌同源性均为96%。同时,利用DNAMAN软件比较巨大芽孢杆菌BS-0409与其它13种不同细菌Csn编码基因的氨基酸序列,结果显示不同细菌Csn氨基酸序列之间有比较高的同源性,且与多种芽孢杆菌具有较高的同源性。     

一步双重PCR法检测梨火疫病原细菌（Erwinia amylovora）

由格兰氏阴性菌 Erwinia amylovora引起的梨火疫病对梨树、苹果树以及一些观赏性植物具有极大的破坏性。研究表明自然界中存在不含有pEA29质粒的E. amylovora菌株,基于质粒pEA29序列设计的分子检测方法则不能检测出该菌株。本研究采用两对引物,分别来自染色体和pEA29质粒,同时在一个反应体系中进行PCR反应,扩增片段长度分别为1.6 kb和1.0 kb,可特异性检测不含有pEA29质粒的菌株。该方法可以简单、快速、准确地检测梨火疫病原细菌。     

水稻白叶枯病菌蛋白质激发子HarpinXoo诱导植物的防卫反应

摘要：含质粒pHRF4的表达菌株BLHR4在培养基中经IPTG诱导，16 h Harpin表达接近最高量。用不同浓度的HarpinXoo喷雾处理烟草(Nicotiana tabacum L.)、油菜(Brassica campestris L.)和番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)，对烟草花叶病毒(TMV)、油菜菌核病(Sclerotinia sclerotiorum (lib.) de Bary)和番茄灰霉病(Botrytis cinerea Pers.)均表现较好的诱导抗病效果。以浓度为100μg/mL的HarpinXoo处理烟草后，分别测定叶片中与防卫反应相关的一些生理指标的变化，结果表明，处理叶片中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（PO）和多酚氧化酶（PPO）活性都有不同程度的增强。三种酶活性高峰分别在处理后24、12和3 h出现，分别比清水对照增加110.1%、211.2%和273.0%；同时，两个病程相关蛋白（pathogenesis-related protein，PR）基因PR-1b和PR-1a在HarpinXoo处理24 h后被诱导显著表达，36 h时达到最高表达水平。这表明HarpinXoo与HarpinEa一样能够诱导烟草不同抗病信号通路的启动，从而使植株获得抗病性。     

产过敏素的耐氨固氮工程菌的构建

阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae)E26(pMC73A）是带有耐氨质粒的固氮工程菌。本研究通过三亲杂交的方法将带有梨火疫病菌hrp基因簇的重组粘粒pCPP430导入E26(pMC73A)。接合子在番茄叶片上出现也对照DH5（pCPP430）一样典型的过敏反应症状，而出发菌E26(pMC73A)测 没有过敏反应；从接合子抽提到2条质粒DNA带，一条与pCPP430位置相同，大小约50kb，另一条与pMC73A位置相同，大小约7kb；接合子质粒DNA的酶切图谱正好是pCPP430和pMC73A酶切图谱的叠加；用地高辛标亡的hrpN DNA上进行Southerm hybridization分析，在接合子的质粒酶切产物中得到预期的杂交带，而出发菌E26（pMC73A）无任何杂交信号。通过质粒抽提、酶切验证、Southern hybridization分析以及在番茄叶片上的过敏反应测定、均表明生产植物抗性诱导蛋白的耐氨固氮工程菌构建成功。     

Erwinia chrysanthemi 分离株CSCL006 hrpN 基因的克隆与高效表达

通过构建Erwinia chrysanthemi分离株 CSCL006的DNA文库，克隆出hrpN CSCL006基因，测序结果显示该基因编码区长1 020 bp; 推导的harpinCSCL006与Erwinia chrysanthemi EC16和3937编码的harpin蛋白同源性高，但与其它软腐菌 的harpin蛋白同源性较低; 在大肠杆菌中(Escherichia coli) 高效表达了hrpN CSCL006基因，重组harpinCSCL006蛋白分子量为34 kD。以抗harpinEcc 的抗体为探针,Western blot 证实该蛋白确为harpin; 纯化的harpinCSCL006, 能引起烟叶的过敏反应。     

Kombucha fermentation and its antimicrobial activity

Kombucha was prepared in a tea broth (0.5% w/v) supplemented with sucrose (10% w/v) by using a commercially available starter culture. The pH decreased steadily from 5 to 2.5 during the fermentation while the weight of the "tea fungus" and the OD of the tea broth increased through 4 days of the fermentation and remained fairly constant thereafter. The counts of acetic acid-producing bacteria and yeasts in the broth increased up to 4 days of fermentation and decreased afterward. The antimicrobial activity of Kombucha was investigated against a number of pathogenic microorganisms. Staphylococcus aureus, Shigella sonnei, Escherichia coli, Aeromonas hydrophila, Yersinia enterolitica, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Staphylococcus epidermis, Campylobacter jejuni, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Bacillus cereus, Helicobacterpylori, and Listeria monocytogenes were found to be sensitive to Kombucha. According to the literature on Kombucha, acetic acid is considered to be responsible for the inhibitory effect toward a number of microbes tested, and this is also valid in the present study. However, in this study, Kombucha proved to exert antimicrobial activities against E. coli, Sh. sonnei, Sal. typhimurium, Sal. enteritidis, and Cm. jejuni, even at neutral pH and after thermal denaturation. This finding suggests the presence of antimicrobial compounds other than acetic acid and large proteins in Kombucha.     

Glycopeptide derived from hen egg ovomucin has the ability to bind enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7

Ovomucin glycopeptide (OGP) was prepared by size exclusion chromatography after Pronase digestion of hen egg ovomucin, and the binding of OGP to foodborne pathogens (Bacillus cereus,Clostridium perfringens, Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, and Staphylococcus aureus) was investigaed. Binding assays with biotinylated bacteria as probes in microtiter plates showed that OGP bound to only E. coli O157:H7 among these foodborne pathogens. Periodate treatment markedly reduced the binding ability, indicating that E. coli O157:H7 bound to carbohydrate moieties of OGP. Lectin blot analysis with Maackia amurensis (MAA) and Sambucus nigra (SNA), which are specific for oligosaccharides containing sialic acid, revealed their binding sites in OGP were similar to the E. coli O157:H7 binding sites that were probed with biotinylated E. coli O157:H7 after Western blotting of OGP. Sialydase treatment of OGP abolished its ability to bind E. coli O157:H7, demonstrating that sialic acid played an important role in the binding. These results suggest that OGP has E. coli O157:H7-specific binding sites that consist of sialic acid. On the basis of these properties, OGP has the potential to be an ingredient with a protective effect against E. coli O157:H7 infection and to be a novel probe for the detection of E. coli O157:H7 in the food hygiene field.     

噬菌体靶向消减土壤生物污染的制约因素及提升策略

土壤中存在能够威胁植物、动物和人体健康的病原细菌，消减这类土壤生物污染是一体化健康（One Health）的重要任务。因具有宿主细菌专一性强、侵染效率高、环境扰动性小等特性，噬菌体成为生态消减土壤病原细菌生物污染的重要手段。然而，由于土壤生物和非生物环境的复杂性，提升噬菌体消减土壤生物污染的效果和稳定性仍是当前的重大挑战。本文从噬菌体在土壤中的生存以及与病原细菌互作等过程着手，分析总结影响噬菌体阻控土壤生物污染效果和稳定性的主要因素：1）噬菌体的宿主细菌谱和种群数量，2）土壤病原细菌的多态性，3）影响噬菌体与土壤病原细菌互作的环境因素。通过构建高效噬菌体鸡尾酒、改善噬菌体产品形式和优化噬菌体施用技术等措施，建立提升阻控土壤生物污染效果和稳定性的策略，为完善土壤生物污染噬菌体疗法提供科学支撑。     

养猪发酵床垫料微生物及其猪细菌性病原群落动态的研究

微生物发酵床养猪是一种新型环保养殖技术。开展了微生物发酵床垫料微生物及其猪细菌性病原群落动态的研究,通过分离不同使用时间和层次基质垫层中的细菌、真菌和放线菌,分析微生物发酵床垫料微生物群落动态;分离基质垫料中大肠杆菌和沙门氏菌,研究其在发酵床垫料中的时间、空间分布动态,分析微生物发酵床对这两种病原细菌的抑制效果。结果表明,微生物发酵床中细菌分布数量最大,在各使用时间和层次的分布量均达到10~7 cfu·g~(-1)数量级以上,放线菌分布数量次之,真菌分布数量最小;细菌的分布数量呈现随着垫料使用时间的增加先上升后下降的趋势,而真菌和放线菌分布量随着垫料使用时间的增加而减少。基质垫料有一定量大肠杆菌和沙门氏菌的分布,分布数量与细菌呈显著的负相关,与真菌和放线菌呈显著正相关,在垫料使用的后期(使用5个月)比使用前期(使用1个月)分布数量明显减少,减少幅度分别为95.34%和44.41%,说明微生物发酵床对猪舍大肠杆菌和沙门氏菌病原能起到显著的抑制作用,控制由大肠杆菌和沙门氏菌病原引起的猪病害。