抗对硫磷基因工程四价抗体在大肠杆菌中高效表达与鉴定

为提高抗对硫磷基因工程四价抗体在大肠杆菌中可溶性表达量,本研究利用克隆技术得到四价抗体基因sc-sa,将该融合基因连接至表达载体pTO-T7的Ω序列和T7启动子下游,构建成功的表达质粒导入大肠杆菌OrigamiB(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot鉴定表达产物,Ni亲和层析纯化蛋白,间接非竞争ELISA法测定该四价抗体的亲和力。结果表明在大肠杆菌OrigamiB(DE3)中表达分子量约为46kDa的四价抗体,0.1mmol/L的IPTG在30℃条件下诱导原核表达,外源蛋白占菌体总蛋白含量近50%,纯化后可溶性蛋白纯度在90%以上,ELISA结果显示该抗体与对硫磷结合呈阳性,抗体效价在1∶1×106以上,亲和常数为6.84×108L/mol。与母源抗体和相应单链抗体相比,利用pTO-T7载体四价抗体在大肠杆菌OrigamiB(DE3) 中可实现高效表达,且抗体效价和亲和力均得到进一步提高。     

抗人红细胞单链抗体（ScFv）-伪狂犬病毒（PRV）gE蛋白双功能融合蛋白的构建及生物学活性检测

利用特异性引物从重组质粒pMD-2E8ScFv和pMD-gE中PCR扩增出2E8基因(抗人红细胞H抗原单链抗体基因)和kgE基因(PRVgE主要抗原编码区),采用重叠延伸(SOE)PCR法拼接成融合的双功能分子2E8kgE,经BamH I和EcoR I双酶切,纯化后,克隆至BamH I和EcoR I双酶切的表达载体pET-Trx中,构建了原核表达载体pET-Trx-2E8kgE;将pET-Trx-2E8kgE转化至BL21plysS中,在IPTG诱导下表达具有双功能的融合蛋白,经过SDS-PAGE和Western-blot检测;结果表明,重组菌BL21plysS表达出约60.1 kD的目的蛋白,与猪伪狂犬标准阳性血清发生特异性反应.红细胞凝集试验证实,2E8kgE融合蛋白既能够与人红细胞结合,又能够与PRV抗体反应,具有双功能特性.     

抗氯霉素多克隆抗体的制备

用重氮化和CDI两种方法合成了CAP全抗原 ,紫外分析和商业试剂盒ELISA鉴定表明合成成功 ;动物免疫 4次后采血检测 ,多克隆抗体 50 %抑制率探测限可达1 0ng/ml,效价可达 1 0万以上稀释倍数 ,特异性较好。     

拟南芥质膜水通道蛋白RD28保守区段在大肠杆菌中的表达及其抗体的制备

实验利用ＰＣＲ技术,从拟南芥原膜水旧白ＲＤ２８的ｃＤＮＡ中扩增了所有植物细胞质膜水通道蛋白保守区段（４２０ｂｐ）,并将其构入ｐＧＥＸ－ＫＧ。酶切、测序分析表明重组质粒ｐＧＥＸ－ＲＤ２８结构正确。０．１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ可诱导表达分子量约４０ｋＤ融合蛋白ＧＳＴ－ＲＤ２８,该蛋白主要以非包涵体的形式存在。诱导表达后的菌体超声裂解液经谷胱甘肽活化的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ亲和层析柱纯化得到了高纯度Ｇ     

猪转录因子Nanog高效表达、多克隆抗体制备及其应用

多能转录因子Nanog可维持干细胞的自我更新和多向分化潜能.为深入研究猪(Sus scrofa)Nanog在多能性调控网络的作用,本研究制备了鼠抗猪源Nanog多克隆抗体.首先,从猪肾脏中克隆Nanog基因CDS,再将CDS连接到pET32a质粒上,构建重组表达载体pET32a-Nanog.将重组载体转化大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta (DE3),经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,优化最佳诱导时间、温度和IPTG浓度等表达条件,获得分子量为57 kD的Nanog重组蛋白.将纯化的Nanog蛋白,免疫C57BL/6小鼠(Mus musculus),6周后获得阳性抗血清,通过Western blot和免疫荧光检测其抗体效价及其特异性.结果显示,在28℃、8 mmol/L IPTG、诱导2.5 h的条件下,可获得高效Nanog重组表达;制备的鼠抗猪Nanog多克隆抗体能特异性识别猪诱导多能干细胞表达的Nanog蛋白.研究结果为猪多能性干细胞的研究提供了有力工具.     

家蚕肌钙蛋白CⅢ基因的原核表达及其抗体的制备

家蚕肌钙蛋白CⅢ(TnCⅢ)是肌钙蛋白C(TnC)的一种亚型结构,本研究利用大肠杆菌表达TnCⅢ融合蛋白,并制备其多克隆抗体.从本实验室的家蚕(Bombyx mori)蛹cDNA文库中搜索到1条编码家蚕肌钙蛋白CⅢ亚型的cDNA序列,将其命名为BmTnCⅢ(Bombyx mori TnCⅢ).该cDNA序列含有完整的ORF,可编码153个氨基酸残基组成的TnCⅢ蛋白.根据该cDNA序列,设计带有BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点的引物,通过RT-PCR的方法从家蚕蛹总RNA中扩增到BmTnCⅢ亚型基因的完整的ORF序列(GenBank登录号为DQ889211),并将其重组到原核表达载体pET-28a相应的酶切位点上.将获得的重组质粒pET-28a-BmTnCⅢ转化大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3),经1 mmol/L IPTG诱导表达重组蛋白后,在分子量约21 kD处出现融合蛋白条带.用亲和层析的方法纯化目的蛋白His-Tag BmTnCⅢ,并以此为抗原免疫雄性新西兰白兔(Oryctolagus cuniculus),制各了该融合蛋白的多克隆抗体.Western blot结果表明,该多克隆抗体具有较高的特异性,可用于后续的组织分布与定位研究.     

水稻PDK2基因原核表达和多克隆抗体制备

本研究以水稻幼苗为材料,通过RT-PCR扩增得到1.1kb的编码PDK2(登录号:AK100033)基因的片段,成功构建重组表达载体pET-23d-PDK2并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。研究结果表明,重组蛋白以包涵体的形式存在,且PDK2的最佳表达条件为:28℃,120r/min,0.5mmol/L IPTG诱导60min。经纯化后免疫新西兰大白兔以制备PDK2多克隆抗体。Western blot检测表明该抗体的特异性和效价较好,这为进一步研究水稻PDK2的生物学功能奠定了基础。     

生长抑素噬菌体展示鼠源单链抗体库的构建与鉴定

应用噬菌体表面展示技术,从生长抑素免疫的小鼠脾脏中提取总RNA,用RT-PCR技术反转录成cDNA,通过PCR扩增出抗体重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因,再用编码(G1y4Ser)3的Linker在体外将VH和VL连接成单链抗体(ScFv)基因,克降到噬菌粒载体pCANTAB5E中,电转化至感受态的大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07超感染,形成噬菌体单链抗体库,有效库容为9.3×107。为利用亲和富集筛选技术,获得具有与SS结合活性的完整重组噬菌粒克隆奠定了基础。     

苦荞黄酮醇合酶FtFLS2的重组表达及多克隆抗体制备

黄酮醇合酶催化二氢黄酮醇生成黄酮醇,是黄酮类物质代谢途径中的关键酶。为深入研究苦荞黄酮醇合酶在苦荞黄酮类物质代谢中的功能,本研究采用同源克隆技术获得苦荞黄酮醇合酶基因Ft FLS2,并构建原核表达载体p ET47b-Ft FLS2;对经钴离子螯合层析柱纯化的重组蛋白进行活性分析并制备多克隆抗体。结果表明,Ft FLS2在大肠杆菌BL21 Star(DE3)中以可溶性形式高效表达,重组蛋白具有将二氢槲皮素转化为槲皮素的催化活性;Western blotting结果显示,Ft FLS2主要在苦荞未成熟种子中表达。多克隆抗体的制备为从蛋白表达水平上分析Ft FLS2与苦养黄酮类化合物累积的关系奠定了基础。     

抗链霉素单克隆抗体的制备和鉴定

用CDI法合成链霉素全抗原 ,免疫BALB c小鼠 ,采用杂交瘤技术得到了一株能稳定分泌抗链霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞。经ELISA鉴定 ,SM McAb为IgG1类 ;细胞培养上清的效价达 1 0 4以上 ,腹水的达 1 0 8以上 ;与双氢链霉素交叉反应率为 2 0 0 % ,与庆大霉素、卡那霉素无交叉反应。     

莱克多巴胺单克隆抗体的制备与初步鉴定

为了对莱克多巴胺进行酶联免疫法测定,经由混合酸酐法合成莱克多巴胺免疫原,免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤单克隆化技术最终得到了1株名为3E1-C9-E10的能稳定分泌抗莱克多巴胺的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经ELISA测定,细胞培养上清的效价为1×105,腹水的效价达1×107以上,与多巴酚丁胺有24%的交叉反应率,与沙丁胺醇、克伦特罗没有交叉反应率。     

人工雌性激素己烯雌酚单克隆抗体的制备及表征

合成了己烯雌酚的半抗原CP-DES,并将半抗原与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)共价偶联制备免疫原和包被原。将免疫好的Balb/c小鼠脾脏细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选出了1株能稳定分泌己烯雌酚单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D87C412C7。分析该杂交瘤细胞的染色体,并以间接酶联免疫吸附分析法(iELISA)检测了单克隆抗体免疫球蛋白的类型。获得的杂交瘤细胞的平均染色体数目为45-50对左右,它分泌IgG1亚类的单克隆抗体。该细胞株体外传代和冻存复苏后抗体分泌稳定,细胞上清效价大于640,诱导腹水效价大于108,该单克隆抗体的检测限IC20=2.3ng/ml,与己烯雌酚结构类似物存在一定的交叉反应,与两种载体蛋白(BSA,OVA)无交叉反应。本研究为己烯雌酚ELISA检测方法的建立提供了条件。     

EMS诱变水稻矮生资源的鉴定评价

用甲基磺酸乙酯(EMS)处理水稻优良籼型恢复系缙恢10号,获得了24份半矮化突变体,其中4份较为特别.与其他半矮化突变体相比,d11和d24的包穗程度较轻,分别为-2.7和-2.6cm,农艺性状变化较小,有效穗与原始材料相比无变化;缙恢10号对GA3敏感,d9和d18对GA3钝感,d9是全节间缩短型突变体,d18则为顶...     

印度芥菜BjJ10-2基因原核表达载体构建及抗盐功能的鉴定

利用RT-PCR技术克隆了印度芥菜核糖体相关膜蛋白RAMP4家族成员BjJ10-2基因的开放读码框,成功构建了pET32a-BjJ10-2原核表达栽体,通过热激法将其转化到原核表达菌株BL21(DE3)plysS中,得到重组大肠杆菌BL21(pET32a-BjJ10-2).SDS-PAGE凝胶电泳检测到在IPTG诱导下...     

鸡传染性支气管炎病毒肾致病株的分离和鉴定

从广西13个鸡场,有呼吸道症状及尿石症的病鸡中分离出 C、G、Z、Q4株病毒。病毒经电镜观察,其大小在94～108nm 之间,囊膜外有特征性疏松排列的刺突。敏感鸡接种16～36小时后出现呼吸道症状,剖检病鸡时大多数鸡肾肿大并有尿酸盐沉积。各毒株接种鸡胚都能产生体儒胚;被56℃1小时灭活;在鸡胚中均能干扰鸡新城疫病毒 LaSota 株的生长。C_(19)株可被鸡传染性支气管炎病毒标准阳性血清所中和。G_3不被 IUDR 所抑制,属 RNA 病毒;对乙醚敏感,证明属有囊膜病毒。从以上各项鉴定指标证明,所分离的4株病毒是引起鸡尿石症的传染性支气管炎病毒。据作者的经验,提出分离鸡传染性支气管炎病毒较为合理的模式。     

Expression of a single-chain antibody against GA24/19 in vascular tissues induces dwarf phenotype for rice plants

GA₁ and GA₄ are active gibberellis (GAs) in rice plants, which are synthesized from GA₁₉ and GA₂₄, respectively. However, the plant tissues where active GAs biosynthesis occurs and the route of their transport have not been fully elucidated. To study the importance of vascular tissues for the function of GAs, cDNA encoding anti-GA_24/19 single-chain variable fragment (scFv) was expressed under the control of the thioredoxin h promoter, which is active in companion cells of phloem tissues. Thetransgenic rice plants showed a dwarf phenotype with increased levels of GA₁₉. This indicated that the expression of the anti-GA_24/19 antibody in companion cells changed the synthesis and/or translocation of GAs in rice plants effectively, suggesting that the vascular tissues play an important role in the function of GAs in rice plants.     

烟草WRKY12基因的分离、表达与多克隆抗体的制备

在高等植物中,WRKY转录因子家族成员广泛参与植物的生长发育、代谢、生物胁迫和非生物胁迫等生理过程的调控.本研究采用同源序列克隆的方法获得烟草WRKY12基因,序列分析表明,该蛋白属于WRKY家族第2类成员,只有一个WRKY结构域,锌指结构为C-X4-C-X23-H-X1-H.构建系统发育树结果表明,它与大豆中GmWR...