三疣梭子蟹微卫星标记的筛选及特征分析

微卫星序列包含有多种重复单元,在其两碱基重复的类型当中,CT／GA重复类型在功能基因组中比例较高。三疣梭子蟹是重要的养殖品种,对遗传种质的分析需要开发大量的分子标记,本文利用5’锚定引物PCT筛选三疣梭子蟹的CT／AG微卫星分子标记,测序的41个克隆子中,35条序列含有微卫星DNA序列,阳性克隆比率达到85．4％,共检测到55个微卫星位点,分布于20条序列中,其中19条序列检测到2个或2个以上微卫星位点。对所有筛选到的微卫星位点进行分类统计后表明,核心序列为（CT／AG）的有27个（50％1,27个位点为其他类型的重复。结果表明三疣梭子蟹CT／AG微卫星标记在三疣梭子蟹基因组中含量较丰富,5’锚定引物法在筛选特定标记的同时,还筛选了其他类型的微卫星标记,具有较强的筛选效率。     

三疣梭子蟹养殖技术

介绍了适合莆田地区的三疣梭子蟹养殖技术,包括池塘条件、养殖前准备、苗种放养、养殖管理等方面内容,以期为当地三疣梭子蟹养殖提供参考。     

CuO-ENPs在三疣梭子蟹不同组织中的积累效应研究

为研究CuO-ENPs在三疣梭子蟹不同组织中的积累效应,选择三疣梭子蟹的鳃、血淋巴、肌肉、肝胰腺、心脏和胃作为研究对象,开展了CuO-ENPs在20、40 mg/L浓度下对三疣梭子蟹的慢性毒性试验,探讨了CuO-ENPs在不同组织内的积累效应。结果表明:CuO-ENPs的富集含量从高到低的顺序为鳃血淋巴肌肉肝胰腺心脏和胃,三疣梭子蟹暴露于不同CuO-ENPs浓度的条件下,体内CuO-ENPs的积累量具有一定差异,除血淋巴外,随着CuO-ENPs浓度的增高,不同组织的CuO-ENPs残留量有一定程度的增加,表现出明显的浓度效应。三疣梭子蟹鳃对CuO-ENPs的富集能力较强,在20、40 mg/L浓度下富集系数分别高达76.35和58.15,血淋巴对CuO-ENPs的富集系数分别为2.6和1.4,肌肉对CuO-ENPs的富集系数分别为1.77和1.43,肝胰腺对CuO-ENPs的富集系数分别为1.3和0.8,心脏和胃对CuO-ENPs的富集系数分别为1.30和0.65。三疣梭子蟹鳃对CuO-ENPs的富集作用远高于三疣梭子蟹的血淋巴、肌肉、肝胰腺和心脏及胃等组织。     

三疣梭子蟹呼吸器管的组织学研究

三疣梭子蟹的呼吸器官主要是鳃，两侧对称排列，每侧八枚。除第二枚关节鳃的鳃轴在一侧外，其余几枚的组织结构均相似，最外层为薄层角质膜，其深层为单层上皮。从鳃的横切面观察，背面血管为人鳃血管，腹面的为出鳃血管，连接这两条血管的结缔组织为鳃轴。鳃轴向两侧（或一侧）生出数条鳃丝。鳃丝主要由柱细胞和上皮细胞构成。扫描电镜观察发现，入鳃血管的侧壁上有成列的卵圆形孔，这些孔与鳃丝相通。采用汞溴酚蓝等４种方法，对上     

三疣梭子蟹土池育苗技术

介绍了三疣梭子蟹土池育苗技术,包括培育前准备工作、幼体排放及培育、病害防治和起捕4个方面内容,以为三疣梭子蟹养殖提供参考。     

浙江近海三疣梭子蟹4个群体的控制区序列分析

以浙江近海三疣梭子蟹大螯肌肉的线粒体DNA作为模板,对4群体共67个个体的控制区（D-loop）序列进行了PCR扩增。通过对PCR产物进行双向测序,最终得到了控制区3’端的rRNA部分序列（64 bp）、D-loop全序列（1179 bp）及控制区5’端tRNA-Ile部分序列（73 bp）。经DNASP软件分析得知,67个D-loop序列定义了65个单倍型,在65个单倍型中,除去插入/缺失位点,所有单倍型共检测到344个多态位点,主要发生在D-loop序列的中间区域;D-loop序列检测到26个插入或缺失位点,碱基插入主要发生在中央后端区域,以13 bp重复片断插入的形式进行。每个个体含有0～3个连续重复片断。通过对三疣梭子蟹的遗传多样性分析发现,D-loop序列的单倍型多样性为0.982～1.000,核苷酸多样性指数为0.02770～0.03633,平均核苷酸差异数为31.790～43.304。综合分析,三个成蟹群体的遗传多样性相近,都低于仔蟹的遗传多样性,说明经过遗传育种,可以提高三疣梭子蟹的种质情况,真正实现对三疣梭子蟹的科学利用。     

三疣梭子蟹与日本对虾混养技术

虾蟹混养可以缓解虾病发生,提高经济效益。从池塘选择、苗种放养、日常管理、病害防治等方面,总结了三疣梭子蟹与日本对虾混养技术。     

三疣梭子蟹呼吸器管的组织学研究

三疣梭子蟹（Ｐｏｒｔｕｎｕｓｔｒｉｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓ）的呼吸器官主要是鳃,两侧对称排列,每侧八枚,除第二枚关节鳃的鳃轴在一侧外,其余几枚的组织结构均相似,最外层为薄层角质膜,其深层为单层上皮。从鳃的横切面观察,背面血管为入鳃血管,腹面的为出鳃血管,连接这两条血管的结缔组织为鳃轴。鳃轴向两侧（或一侧）生出数条鳃丝。鳃丝主要由在细胞和上皮细胞构成,扫描电镜观察发现,入鳃血管的侧壁上有成列的卵圆形孔,这些孔与鳃丝相通。采用汞溴酚蓝等４种方法,对上述几种结构分别进行了组织化学研究。     

三疣梭子蟹雌雄个体遗传差异的SRAP分析

应用三疣梭子蟹SRAP-PCR优化体系,从88个SRAP引物组合中筛选出17个组合对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)雌、雄个体遗传差异进行分析,共获得146个位点,雌性个体获得139个位点,多态位点比例为69.78;雄性个体检测到129个位点,多态位点比例达79.07。雌性和雄性的Nei''s基因多样性分别为0.2315和0.2682,Shannon''s信息指数为0.3478和0.4026,雌雄个体间的相似系数为0.5959~0.8417,遗传距离为0.1583~0.4041。用TFPGA软件绘制了个体间的聚类图。另外在5个SRAP选择扩增组合中发现了6个位点在雌雄个体间扩增差异较大,其中4个位点显性条带个体为雄性的比例为12.5%~20%;2个位点显性条带个体为雌性的比例为100%。     

三疣梭子蟹雌激素相关受体基因在蜕皮过程中的表达分析

雌激素相关受体(ERR)在甲壳动物蜕皮过程中可能起着重要的调节作用,但是尚不清楚该基因在三疣梭子蟹不同组织和不同蜕皮阶段的表达模式。本文采用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术研究了三疣梭子蟹雌激素相关受体(Pt ERR)基因在不同组织和不同蜕皮阶段的表达情况。结果表明,Pt ERR-mRNA在C期三疣梭子蟹的Y器官和鳃中表达水平最高,其次眼柄和胃中表达水平也相对较高,在3种肌肉组织和三角膜中表达水平较低。在不同蜕皮阶段,13种组织中的Pt ERR-mRNA表达水平均差异显著。Y器官中Pt ERR-mRNA从AB期到E期呈显著上升趋势;胸神经节和眼柄中的Pt ERR-mRNA变化模式均为先上升后下降趋势,大颚器中的Pt ERR-mRNA变化趋势为先下降后上升;大螯肌肉、附肢肌肉和三角膜中的Pt ERR-mRNA表达水平均呈显著升高趋势,而腹部肌肉中Pt ERR-mRNA为先下降后上升趋势;就消化代谢器官而言,胃、肝胰腺和鳃中Pt ERR-mRNA在整个蜕皮周期中均为先升高后降低的趋势,其中D期达最高值;肠道中Pt ERR-mRNA相对表达量在D期最高,C期和E期较低;从AB期至E期,心脏中Pt ERR-mRNA表达水平一直显著增加,每期增加1倍左右。综上,Pt ERR主要在Y器官、鳃、眼柄和胃中表达,可能参与调控蜕皮过程、细胞增殖和能量代谢等。     

三疣梭子蟹对蟹笼网目和刚性矩形逃逸口的逃逸行为比较

为了解东海近海蟹笼逃逸口类型对三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）逃逸行为的影响,本研究使用红外水下摄像装备,对入笼的三疣梭子蟹在不同行为阶段对安装于侧网靠近笼底一侧的刚性矩形逃逸口（40mm高×200mm宽）和网目逃逸口（由2个位置较低的40mm×60mm和1个位置较高的60mm×60mm破目构成）的行为反应进行了观察。根据三疣梭子蟹探索、发现并接近、穿越企图和穿越逃逸口个体连续行为的4个阶段观察结果显示：相比刚性矩形逃逸口,三疣梭子蟹在网目逃逸口实验蟹笼中的探索行为持续时间更长;在笼底探索的个体能定位、发现并接近2种不同类型逃逸口,但发现并接近网目逃逸口时距离入笼的平均时间（P<0.01）和平均次数（P=0.061）均大于刚性矩形逃逸口;约85%发现并接近逃逸口的三疣梭子蟹企图穿越逃逸口,且在逃逸口类型之间没有显著差异;三疣梭子蟹在网目逃逸口前停留了更长的时间（P=0.006）,且这一时间显著影响着个体是否企图逃逸的行为。所有个体均采用侧身姿态穿越逃逸口,对于刚性矩形逃逸口,个体甲高与逃逸口高度的关系是决定个体能否成功逃逸的关键因素;对于网目逃逸口,个体优先尝试穿越较低逃逸口,并最终全部逃逸。实验结果表明网目逃逸口可以作为蟹笼渔具逃逸装置,生物可降解材料应用可成为缓解蟹笼幽灵捕捞问题的技术手段之一。     

水体Cu2+对三疣梭子蟹主要组织ROS含量和抗氧化能力的影响

为探究水体Cu2+对三疣梭子蟹主要组织氧自由基水平和抗氧化能力的影响,采用生态学单因子梯度试验方法,研究了不同浓度水体Cu2+(0.04、0.4、2、4 mg·L-1)胁迫下三疣梭子蟹鳃、肝胰腺、肌肉组织中的活性氧(ROS)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和总抗氧化能力(T-AOC)的变化。结果表明:与对照组相比,低浓度水体Cu2+(0.04、0.4 mg·L-1)对三疣梭子蟹鳃、肝胰腺和肌肉组织ROS含量没有显著影响,而高浓度水体Cu2+(2、4 mg·L-1)会导致鳃、肝胰腺和肌肉组织ROS含量显著升高,且升高的幅度与Cu2+浓度成正比。低浓度水体Cu2+(0.04、0.4 mg·L-1)对三疣梭子蟹鳃、肝胰腺和肌肉组织的SOD活性和T-AOC均具有诱导作用,随实验时间的延长,SOD活性和T-AOC呈峰值变化;而高浓度水体Cu2+(2、4 mg·L-1)短时间内对梭子蟹的鳃、肝胰腺、肌肉组织的SOD活性及鳃T-AOC具有诱导作用,但对肝胰腺和肌肉T-AOC却有明显的抑制作用,在实验时间内两种组织T-AOC始终低于对照组,并呈逐渐下降趋势。由此说明低于0.4 mg·L-1的水体Cu2+在三疣梭子蟹抗氧化解毒能力的可控范围,但高于2 mg·L-1的水体Cu2+会对三疣梭子蟹主要组织细胞造成损伤,使之抗氧化解毒能力下降。抗氧化酶和非酶抗氧化物在三疣梭子蟹抵御Cu2+胁迫中共同发挥作用,三种组织SOD和T-AOC表现出明显的时间和剂量效应。     

许氏平鲉微卫星标记的开发及评价

采用磁珠富集法筛选具多态性的许氏平鲉微卫星标记,并用一个野生群体对其多态性进行了评价。三引物PCR法筛选出58个阳性克隆进行了测序,共得到47个含微卫星核心的DNA序列,筛选出15对具有多态性的微卫星引物。所有位点上共得到66个等位基因片段,每个位点的观测等位基因数(A)为2~14个,平均等位基因数为4.4,观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)范围分别为0.062 5~0.968 8、0.061 5~0.929 1。每个位点的多态信息含量(PIC)显示,有6个位点表现出高度或中度多态。经Bonferroni校正后,HJ2-32、HJ4-27、HJ4-45和HJ4-47四个位点的等位基因频率显著偏离了Hardy-Weinberg平衡。连锁不平衡检测表明,各位点间无连锁不平衡现象。     

磁珠富集法分离柿微卫星标记

【目的】分离柿属植物的微卫星标记,为柿种质资源的分类、进化等遗传研究奠定基础。【方法】提取磨盘柿(Diospyros kaki)基因组DNA后,用EcoRⅠ和MesⅠ2种内切酶酶切并连接接头,再用接头特异引物进行PCR扩增。扩增产物与生物素标记的(GA)15和(AC)15探针杂交,杂交复合物用链亲和素包裹磁珠进行结合,得到单链DNA目标片段,经PCR扩增,连接pGEM-T载体,转化入感受态大肠杆菌,得到微卫星富集小插入片段DNA文库。用Colony-PCR法筛选阳性克隆,进行测序分析。【结果】测序96个克隆,54个含微卫星序列,24个为有效微卫星序列,其中完美型(perfect)9个,占37.5%;非完美型(imperfect)7个,占29.2%;混合型(compound)8个,占33.3%(。GA)n重复最为常见。21条含微卫星序列已登录GenBank(Accession Number:EF567396~EF567416)。成功设计21对引物,经初步筛选,14对表现出多态性。【结论】试验方法分离柿基因组微卫星简便有效,得到的多态性引物可用于柿种质资源的遗传研究。     

中华绒螯蟹部分基因组文库构建和微卫星位点的筛选

利用磁珠富集和放射性杂交相结合构建了中华绒螯蟹基因组微卫星文库.并利用生物素标记的(GA)12探针进行微卫星片段的富集.将得到的片段与pGEM-T载体连接后转入DHSα大肠杆菌中,然后利用γ-32P同位素标记的(GA)12:探针进行第二次筛选.结果共获得微卫星基因组文库1 500个菌,杂交前菌落PCR检测阳性克隆率为62.5%;杂交后得到的阳性克隆为447个,占29.8%.经测序,有248个克隆含有重复次数大于5次的微卫星序列.在得到的微卫星序列中,重复单元除GA/CT外,还观察到三碱基、四碱基重复单元.根据侧翼序列没计引物164对,选择合成50对,通过优化PCR反应条件,结果有21对引物可扩增出清晰可重复的目的条带,15对具有多态性.本研究对中华绒螯蟹基因组资源的开发利用提供了相关资料.     

刺参微卫星DNA分子标记的分离及筛选

采用磁珠富集法分离刺参Apostichopus japonicus的微卫星分子标记,共获得阳性克隆123个,其中106个含微卫星DNA序列。分析结果表明:完美型有48个,占45.28%,非完美型有39个,占36.79%,复合型有19个,占17.92%;重复碱基数以双核苷酸重复最常见,占84.91%,双核苷酸中又以CA/GT重复所占比例最大;在重复次数方面,以重复数为3~10次、11~18次和≥35次最为常见,各占39.62%、26.42%和16.98%,重复数达100次以上的有5个,最多的达到148次,有28个微卫星序列微卫星含量丰富。筛选的22对引物中,可产生出扩增产物的有17对,其中16对引物的产物带在预测区域内出现;有7对引物在中国、俄罗斯刺参模板中表现出多态性。文中还对刺参微卫星的特点进行分析,对刺参微卫星引物的PCR筛选结果进行了探讨。     

微小隐孢子虫cDNA文库的构建与免疫学筛选

【目的】构建微小隐孢子虫cDNA文库,以筛选出可替代天然抗原用于诊断的重组抗原。【方法】首先纯化微小隐孢子虫卵囊,用Trizol Reagent提取总RNA,构建全长cDNA;分别用蛋白酶K与Sfi消化、酶切处理cDNA,采用Column Spin H-1000分离柱分离cDNA,连接λTriplEx2载体,构建cDNA文库。扩增cDNA文库,用兔抗微小隐孢子虫血清作探针对cDNA文库进行初筛和复筛,将复筛得到的阳性克隆连接PMD18-T载体,测序后进行序列比对。【结果】微小隐孢子虫cDNA文库噬菌斑插入片段长度为1.5kb左右,库容大于107。经过筛选共获得了20个微小隐孢子虫阳性克隆,测序后从中选出了4个主要免疫识别抗原蛋白,分别为MUCIN蛋白、乳酸脱氢酶、微管相关蛋白和子孢子抗原蛋白。【结论】成功构建了微小隐孢子虫cDNA文库,并筛选出了4个主要免疫识别抗原蛋白,为隐孢子虫的血清学诊断提供了重组抗原。     

西太公鱼微卫星的筛选与分析

利用磁珠富集法从西太公鱼（Hypomesus nipponensis）基因组中筛选到14对多态性微卫星引物,并对来自黑龙江镜泊湖的西太公鱼24个样本进行检测：扩增的等位基因数在3～25个之间,平均为8.4个;观察杂合度（H_O）和期望杂合度（H_E）分别为0.266 7～1.000 0和0.282 5～0.932 2;多态信息含量（PIC）为0.239 2～0.910 6;位点HN-075和位点HN-250显著偏离哈迪-温伯格平衡（P<0.05）,这些多态性微卫星位点可用于公鱼属鱼类种群遗传结构及其相关研究。