BmNPV对家蚕海藻糖酶活性及其基因表达的影响

为了明确家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrovirus,BmNPV)对家蚕不同组织海藻糖酶活性及其基因BmTre表达水平的影响,以五龄起蚕为试验材料,经口喂食BmNPV,分析血淋巴、脂肪体和中肠BmTre基因及海藻糖酶活性的变化情况.结果显示,家蚕血淋巴、脂肪体和中肠BmTre...     

BmNPV对家蚕抗氧化酶基因表达及其酶活性的影响

[目的]探究喂食家蚕核型多角体病毒(BmNPV)后家蚕血淋巴和中肠组织抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)]的活性及其基因表达变化规律,明确BmNPV侵染对家蚕抗氧化系统的影响,为解析BmNPV的致病机理提供理论依据.[方法]以五龄家蚕为研究对象,经口喂食BmNPV,分别于添食后6、12、18、24、30、36、42和48 h采集家蚕的血淋巴和中肠组织,采用实时荧光定量PCR检测两种抗氧化酶基因(Bmsod和Bmcat)的表达水平,同时以抗氧化酶活性测试盒测定SOD和CAT的活性变化情况.[结果]BmNPV侵染五龄家蚕能引起典型的血液型脓病,主要表现为蚕体环节肿胀,狂躁爬行,体壁易破,体液呈乳白色等.家蚕血淋巴和中肠组织中Bmsod和Bmcat基因均在感染BmNPV中期开始上调表达,在感染后期呈下调表达趋势,其相对表达量也呈先增加后急剧减少的变化趋势.添食BmNPV后,家蚕血淋巴和中肠组织的SOD活性在感染18和24 h时极显著高于对照组(添食等量灭菌水)家蚕(P<0.01,下同),但从感染30 h起SOD活性开始急剧下降,至感染48 h时降至最低值.家蚕血淋巴和中肠组织的CAT活性在感染早期(6 h)略有下降,从感染12 h起CAT活性开始呈上升趋势,血淋巴CAT活性在感染18~30 h极显著高于对照组,随后急剧下降且显著低于对照组家蚕(P<0.05,下同);中肠组织CAT活性仅在感染18和24 h时显著或极显著高于对照组家蚕,从感染30 h起开始持续下降,至感染48 h时降至最低值,约为对照组家蚕的18%.[结论]BmNPV侵染能影响家蚕机体相关保护酶活性及其基因转录水平,SOD和CAT活性及其基因表达量在感染中期增加,感染后期则急剧降低,提示抗氧化酶SOD和CAT在家蚕的抗病毒过程中发挥重要作用.     

云南不同地区BmNPV对家蚕致病力的研究

为研究家蚕病毒弱毒株系对强毒株系的交互保护作用,探索利用弱毒苗添食防治家蚕病毒病,试验收集了8种云南不同地区的BmNPV多角体,经纯化后,配制成102~108个/ML7种浓度多角体悬浮液,分别添食3龄起蚕,每种病毒的每种浓度为1个处理,每个处理3个重复小区,每小区30头蚕,调查记录各区蚕死亡头数,连续调查至供试蚕上蔟,累计死亡头数,计算各区蚕死亡率。参照吉田的方法计算其LC。结果表明,8种云南不同地区家蚕核型多角体病毒对家蚕致死中浓度由大到小依次为BmNPV(Heqing)(BmNPV(Xiangyun)(BmNPV(Mengzi)(BmNPV(Qiaojia)(BmNPV(Luliang)(BmNPV(Mojiang)(BmNPV(Zhanyu)(BmNPV(Baoshan)。毒力最强的是保山株,其对3龄起蚕的致死中浓度为5.75×104个/mL,次强是沾益株和墨江株同在一个数量级,陆良株、巧家株和蒙自株中等在同一个数量级,其次是祥云株,最弱为鹤庆株,LC50为8.81×109个/mL,其与最强的保山株(LC50为5.75×104个/mL)相差5个数量级。     

家蚕热激蛋白Hsp25.4对BmNPV增殖的影响

【目的】探究家蚕热激蛋白（Hsp25.4）基因在家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrovirus,Bm NPV）侵染家蚕后的表达变化规律,明确敲低该基因表达后对BmNPV增殖复制的影响,为深入解析BmHsp25.4蛋白在BmNPV侵染家蚕过程中发挥的作用提供参考依据。【方法】以5龄家蚕幼虫为研究对象,经口添食10μL预先制备好的BmNPV-T3株病毒悬液（5×108个/mL）,对照组添食等量灭菌水,采用实时荧光定量PCR检测BmHsp25.4基因在BmNPV侵染6 h各组织的表达情况,并选择相对表达量较高的3个组织,分析BmHsp25.4基因时空表达图谱;注射双链RNA(dsRNA)检测BmHsp25.4基因在体内的干涉效果,采用实时荧光定量PCR检测BmHsp25.4基因干涉后对BmNPV增殖复制的影响。【结果】BmNPV侵染家蚕6 h,BmHsp25.4基因在家蚕血液、中肠和脂肪体组织中的相对表达量升高;时空表达谱结果显示,BmHsp25.4基因在3个组织中的表达谱均呈先升高后降低的变化趋势,其中血液和中肠组织的相对表达量均在6h达峰值,而脂...     

BmNPV侵染后不同抗性家蚕品系中肠组织转录组学分析

家蚕核型多角体病毒（BmNPV）是造成蚕业严重经济损失的主要病原体之一,主要通过食下感染引发家蚕血液型脓病,中肠是免疫病原体的重要组织器官。研究比较了家蚕BmNPV抗性品系C9K和敏感性品系HYB感染BmNPV后中肠组织的基因表达差异,以期筛选家蚕BmNPV的抗性相关基因,为解析家蚕BmNPV抗性机制以及抗病毒育种提供数据支持。结果表明：BmNPV侵染能够诱导2个品系家蚕的全基因组转录水平发生较大变化,GO分析显示这些变化主要涉及到代谢过程、跨膜转运、膜结构、酶活性、信号传导、结合功能等,KEGG分析显示这些差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）主要参与能量代谢、氨基酸代谢、糖类代谢、次级产物代谢等;BmNPV感染后,一些免疫相关基因的表达发生了变化,许多与黑化和细胞凋亡等相关的DEGs可能参与宿主对BmNPV感染的反应。     

氟化物对家蚕不同组织酯酶同工酶的影响

为了探讨氟化物对家蚕代谢机制的影响,以家蚕耐氟品种 T6和氟化物敏感品种734为研究材料,从5龄起蚕开始分别添食经200,400mg/kgNaF溶液浸泡后的新鲜桑叶,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法,检测家蚕头、血液和中肠组织中酯酶同工酶的变化.结果表明,T6头部和中肠的酯酶同工酶活性大于734,而且酶带数多于734.NaF会扰乱734血液酯酶同工酶系统.推测血液可能是酯酶同工酶和 NaF作用的主要组织,且酯酶同工酶与蚕体的耐氟性能有一定的相关性.     

家蚕IAP互作蛋白的筛选、鉴定及其对BmNPV增殖的影响

目的 细胞凋亡作为昆虫免疫应答的重要组成部分,在病毒与宿主相互作用的过程中扮演着重要角色,以细胞凋亡相关基因为研究对象对阐明其在病毒感染过程中的作用具有重要的参考价值。本研究旨在筛选家蚕凋亡抑制蛋白（Bombyx mori inhibitor of apoptosis protein,BmIAP）的相互作用蛋白,并验证其在家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV）侵染过程中与Bmiap的相互调控关系及在BmNPV增殖过程中的作用,为探明宿主与BmNPV相互作用的分子机制提供理论依据。方法 利用免疫共沉淀技术筛选在BmNPV侵染家蚕细胞过程中与BmIAP相互作用的蛋白,对获得的特异性差异条带进行LC-MS/MS蛋白质谱分析,根据蛋白分子量大小并利用生物信息学方法对获得的蛋白进行鉴定,确定候选基因;通过分子克隆技术对候选基因进行克隆,利用SMART在线工具及BioEdit分别对候选基因的结构域进行预测及多序列比对分析;通过免疫荧光试验验证BmIAP和候选蛋白的细胞共定位情况,并进一步利用免疫共沉淀验证它们的相互作用;分别通过真核表达和基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统对候选基因进行过表达和敲除,利用qRT-PCR技术检测相应基因的表达情况,以确定Bmiap和Bmpp5在BmNPV侵染过程中的调控关系;同样,在过表达和敲除Bmpp5后检测杆状病毒Vp39的表达量,以确定Bmpp5对BmNPV增殖的影响。结果 通过免疫共沉淀获得7个可能与BmIAP相互作用的宿主蛋白和1个BmNPV蛋白,进一步分析确定1个与凋亡相关的候选基因Bmpp5;Bmpp5的开放阅读框为1 473 bp,编码490个氨基酸,预测的蛋白分子量约为56 kD,含3个TRP结构域和1个PP2Ac结构域,在昆虫间具有较高的保守性;免疫荧光检测证明BmIAP和BmPP5共定位于细胞质中,免疫共沉淀结果表明两者可以相互作用;在BmNPV侵染过程中,过表达Bmiap后,Bmpp5的表达量显著上调,而敲除Bmiap后,Bmpp5的表达量显著下调,表明Bmiap能够促进Bmpp5的表达;同时,过表达Bmpp5后,Bmiap显著上调表达,而敲除Bmpp5后,Bmiap显著下调表达,表明Bmpp5同样能够促进Bmiap的表达;过表达Bmpp5能够促进BmNPV的增殖,敲除Bmpp5能够抑制BmNPV的增殖,表明Bmpp5的表达利于BmNPV的增殖。结论 鉴定了1个能够与BmIAP相互作用的蛋白BmPP5,且该蛋白在昆虫中高度保守;在BmNPV侵染过程中,Bmiap和Bmpp5能够相互促进,且Bmpp5能够促进BmNPV的复制增殖。     

BmNPV对家蚕BmN细胞周期及周期蛋白基因表达水平的影响

【目的】研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedroviruses,BmNPV)对家蚕卵巢细胞系(BmN)细胞周期及细胞周期蛋白基因转录水平的影响。【方法】用BmNPV感染家蚕BmN细胞,分别在病毒感染后的不同时间(12,24,36,48h),应用实时荧光定量PCR方法检测细胞周期蛋白基因CyclinA、CyclinB、CyclinE的表达情况,用流式细胞仪检测细胞周期的变化。【结果】BmNPV感染24h后,BmN细胞出现明显感染症状,变为圆形;48h后细胞核内出现多角体。随着感染时间的延长,CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表达量均下降,分别在感染12,24,36h后,表达量降低为0。流式细胞仪检测结果显示,在BmNPV感染后24h左右,抑制于G2/M期的BmN细胞达到68%。【结论】BmNPV感染家蚕BmN细胞后,导致CyclinB、CyclinE基因表达量降低,对CyclinA基因表达量的影响较小;同时BmNPV感染可以将BmN细胞发育抑制于G2/M期。     

家蚕抗BmNPV细胞因子的筛选和分析

【目的】探讨家蚕NF-kB类转录因子BmRelish在抗核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)感染的免疫应答中的作用,筛选和分析抗病毒细胞因子,完善对家蚕抗病毒免疫机制的认识。【方法】通过Western blot检测当BmNPV感染家蚕BmE细胞后BmRelish全长形式（BmRelish-FL）是否转变成其活性形式（BmRelish_act）;利用荧光定量PCR检测过表达BmRelish_act的细胞在感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平,观测在被荧光标记的BmNPV（BmNPV-EGFP）感染后呈现EGFP荧光的细胞数,并与作为对照的未表达BmRelish_act的细胞相比较,以确定BmRelish是否参与抗病毒免疫;将新鲜细胞通过Transwell细胞共培养体系经过表达BmRelish_act的细胞上清培养液孵育后,定量检测在感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平,以探讨过表达BmRelish_act的细胞是否产生并分泌抗病毒细胞因子;通过超滤等方法对过表达BmRelish_act的细胞上清培养液予以初步分离,将滤过液和截留液分别孵育新鲜细胞,定量检测感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平,从而确定抗病毒细胞因子的分子量范围;用高温处理滤过液和截留液后再孵育新鲜细胞,定量检测感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平以确定抗病毒细胞因子的属性;利用LC-MS/MS对滤过液中的多肽做进一步鉴定和分析。【结果】BmE细胞被BmNPV感染后,部分BmRelish-FL转变成其活性形式BmRelish_act;过表达BmRelish_act的细胞被BmNPV感染后,胞内病毒DNA的相对水平显著低于对照细胞,且呈现EGFP荧光的细胞数也较对照少;新鲜细胞经过表达BmRelish_act的细胞上清培养液孵育后,胞内病毒DNA的相对水平显著低于用对照细胞上清培养液孵育的细胞;用100和3 kD超滤管超滤过表达BmRelish_act的细胞上清培养液后,滤过液仍然具有显著降低所孵育细胞的胞内病毒DNA的相对水平,而截留液无此活性;经高温处理后,该细胞上清培养液不再具有降低所孵育细胞的胞内病毒DNA相对水平的作用;在滤过液中通过质谱鉴定到67个肽段,长度为9-45个氨基酸,富集到32个蛋白质,分子量均＞3 kD,其中9个蛋白质含有信号肽。【结论】BmNPV感染导致BmRelish的激活;活化的BmRelish促进细胞产生抗病毒细胞因子并分泌到上清培养液中;该细胞因子具有增强细胞抗病毒能力的活性,为分子量＜3 kD的多肽。     

家蚕对BmNPV抗病性与中肠消化酶活性的关系

对6个现行家蚕品种中肠消化酶活性与家蚕对BmNPV病毒抗性比较与分析,以期寻找现行家蚕品种消化酶的活性与抗性的关系,为辅助家蚕育种及品种推广奠定基础.以DNS法测定不同品种海藻糖酶活性,以Fo-lion-酚法测定不同品种蛋白酶活性.以及以铜皂法测定脂肪酶活性,同时对不同品种家蚕4龄起蚕经口添加BmN-PV病毒进行抗性调查分析.结果表明,蛋白酶、脂肪酶酶活顺序为664×663较低,667×668相对较高,其他品种处于中间层次,对应抗性测定结果的相关分析表明,活性越强抗性越强,呈显著正相关关系;而海藻糖酶的活性与抗性的关系没有较好的相关性.因此,家蚕中肠消化液的蛋白酶、脂肪酶可能与家蚕对BmNPV病毒抗性有关.     

东莨菪内酯对家蚕中肠组织GSTs活性的影响

[目的]探讨东莨菪内酯对家蚕中肠组织谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）活性的影响,为桑园使用东莨菪内酯防治虫害的安全性及家蚕抗性品系选育提供理论依据.[方法]采用毒叶法对家蚕进行添毒,测定东莨菪内酯对家蚕中肠组织GSTs活性的影响,并通过离体抑制试验求出东莨菪内酯对GSTs的抑制中浓度（IC50）.[结果]摄食不同浓度东莨菪内酯（0.026～0.104 mol/L）处理桑叶的家蚕表现出相似的中毒症状（吐液和拒食）,但在添毒36h后中毒症状完全消失.相对于正常的家蚕,摄食东莨菪内酯处理桑叶后家蚕中肠组织的GSTs比活力呈前期降低、中期升高、后期降低的变化趋势.不同浓度（0.001～0.016 mol/L）的东莨菪内酯均显著抑制家蚕中肠组织离体GSTs活性,且抑制率随东莨菪内酯浓度的增加而增加.东莨菪内酯对家蚕中肠组织GSTs的IC50为0.00474 mol/L.[结论]东莨菪内酯可抑制家蚕中肠组织GSTs活性.     

家蚕丝氨酸蛋白酶基因BmSPH33对BmNPV诱导的免疫响应

[目的]了解BmSPH33基因在家蚕免疫应答方面的作用.[方法]BmSPH33基因进行生物信息学分析;利用GeneDoc与MEGA 5.0软件对BmSPH33与其它物种SPH33进行多序列比对和系统进化分析;利用半定量RT-PCR对其组织转录情况进行分析;qRT-PCR检测家蚕添食BmNPV后BmSPH33基因的表达情...     

冷冻保存对家蚕精液乳酸脱氢酶活性的影响

对家蚕冷冻精液乳酸脱氢酶活性进行了研究,结果表明：家蚕精液LDH测定过程中的最适底物浓度在0．5—0．8mmol／L之间;LDH抽提液在4℃存放随时间延长其酶活性下降,应在抽提后的15h内测定其活性;家蚕精液经过冷冻后精子受损严重,精子中的LDH向精清中溢出,导致精子中LDH活性下降及精清中LDH活性上升;-80℃保存的精液在90d后其精子中的酶活性仅为冷冻前的23％,而液氮保存的精液虽然在冷冻1d后酶活性下降为冷冻前的43％,但是在其后的90d中酶活性下降很少,可作为家蚕精液长期保存的冷存方式。     

冷冻保存对家蚕精液乳酸脱氢酶活性的影响

时家蚕冷冻精液乳酸脱氢酶活性进行了研究,结果表明:家蚕精液LDH测定过程中的最适底物浓度在0.5～0.8 mmol/L之间;LDH抽提液在4℃存放随时间延长其酶活性下降,应在抽提后的15 h内测定其活性;家蚕精液经过冷冻后精子受损严重,精子中的LDH向精清中溢出,导致精子中LDH活性下降及精清中LDH活性上升;-80℃保存的精液在90d后其精子中的酶活性仅为冷冻前的23%,而液氮保存的精液虽然在冷冻1 d后酶活性下降为冷冻前的43%,但是在其后的90d中酶活性下降很少,可作为家蚕精液长期保存的冷存方式.     

大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对家蚕不同组织碱性磷酸酶活性的影响

[目的]研究喂食不同细菌后,家蚕不同组织ALP酶活性变化规律,明确ALP在家蚕抵御细菌侵染过程中发挥的功能和作用,为揭示ALP在昆虫体内的生理功能及选育抗细菌病蚕品种提供借鉴和思考.[方法]分别经口喂食大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,采用微量酶标法检测家蚕血淋巴、中肠、马氏管和脂肪体ALP酶活性变化情况.[结果]中肠组织AL...     

家蚕品种871C×872C对BmNPV抗性鉴定研究

对中国蚕业研究所选育的家蚕品种871C ×872C进行了BmNPV攻毒饲养试验.结果表明,871C ×872C在同浓度添食病毒条件下,全龄死亡率明显小于对照品种,其半致死浓度(LC50)为109,较对照品种提高了4,5个数量级,抗BmNPV能力显著.