利用CRISPR/Cpf1系统构建人ABCG1和ABCG4基因敲除的293T细胞株

【目的】基于CRISPR/Cpf1(AsCpf1/LbCpf1)技术构建人ABCG1和ABCG4基因敲除的人胚肾细胞(HEK293T)稳定细胞株,旨在研究ABCG1和ABCG4基因的生物学功能。【方法】针对ABCG1和ABCG4基因作用的功能域,设计2对靶向ABCG1和ABCG4基因前7个外显子的sgRNA序列,分别克隆到AsCpf1和LbCpf1的载体上。将测序验证正确的重组质粒转染到HEK293T细胞中,T7E1酶切和测序验证敲除效率,对敲除成功的293T细胞利用有限稀释法筛选获得基因双突变的敲除细胞株,对其基因组进行PCR扩增并双向测序验证编辑结果,选择有正确编辑结果的PCR产物进行TA克隆,进而测序验证单克隆细胞株编辑效率。【结果】结果获得敲除ABCG1和ABCG4基因的稳定细胞株各1株(AsCpf1-ABCG1-sgRNA 1-1和LbCpf1-ABCG4-sgRNA 2-1)。【结论】通过利用新型基因编辑技术CRISPR/Cpf1系统,获得了永久性敲除目的细胞靶基因的细胞株,可为进一步探索和证实ABCG1和ABCG4在细胞中胆固醇代谢和调节作用提供帮助。     

慢病毒载体介导稳定表达Cas9基因的293T细胞系构建及其基因编辑效率验证

为通过慢病毒感染细胞构建稳定表达CRISPR/Cas9的293T细胞系,实现高效率基因编辑, PCR扩增Cas9基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共感染293FT细胞, 48 h后收集病毒并浓缩纯化测定其病毒滴度,最后用纯化后的病毒感染293T细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达Cas9的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。针对ABCG4基因设计sgRNA并构建重组载体感染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。结果表明:成功构建了Cas9-pLent慢病毒载体,用构建成功的慢病毒载体对293FT细胞进行慢病毒包装(三质粒系统)并对包装成功的病毒进行了浓缩与纯化,最后通过病毒感染293T细胞,采用荧光观察的方式测定其病毒滴度均在10~6 TU·mL~(-1)之上。用纯化后的病毒感染293T细胞并通过加药(Puro)进行抗性筛选,筛选出3株能稳定表达Cas9的293T细胞系,目的基因ABCG4的基因编辑功能验证表明其中1株T7E1酶切掉带明显, sgRNA靶向敲除效率较高,该株命名为Cas9-293T-10A。该研究建立了稳定表达Cas9的293T细胞系,可用于目的基因的高效敲除。     

基于CRISPR/Cas9技术构建STING基因敲除猪肺泡巨噬细胞系及其对Ⅰ型干扰素转录的影响

【目的】阐明干扰素基因刺激因子(STING)在猪抗病原微生物感染中的作用机制,为猪传染性胃肠炎、流行性腹泻和猪伪狂犬病等病毒性疾病的科学防控提供参考依据。【方法】基于CRISPR/Cas9技术,在STING基因第4、第8外显子中寻找高分靶点并设计sgRNA序列,将退火的sgRNA与酶切的LentiCRISPRv2载体用T4 DNA连接酶连接以获得LentiCRISPRv2-STING-sgRNA慢病毒载体(STING-sgRNA);以不同的STING-sgRNA慢病毒载体组合及包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293T细胞,得到含sgRNA的慢病毒再转染3D4/21细胞;经嘌呤霉素筛选和有限稀释法获得单克隆细胞株,通过PCR、测序及Western blotting鉴定STING基因的敲除效果;并采用实时荧光定量PCR验证STING基因敲除对I型干扰素表达的影响。【结果】以不同的STING-sgRNA慢病毒载体组合与HA-STING过表达载体共同转染293T细胞,均能在细胞内对STING真核表达载体产生编辑效果,且以STING-sgRNA(1+5)慢病毒载体组合的编辑效率最高。以编辑效率最高的STING-sgRNA(1+5)慢病毒载体组合及包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293T细胞包装出慢病毒,再用慢病毒感染3D4/21细胞,结果获得1株STING基因大片段(4989 bp)缺失的3D4/21细胞株,Western blotting检测未发现STING蛋白,说明STING基因敲除3D4/21细胞(3D4/21-STING-/-)构建成功。与野生型3D4/21细胞相比,在转染副猪嗜血杆菌DNA刺激下,3D4/21-STING-/-细胞中的IFN-β基因转录水平显著降低(P<0.05)。【结论】采用CRISPR/Cas9技术能成功大片段敲除3D4/21细胞中的STING基因,而导致STING基因功能丧失;STING基因敲除会导致细胞在病原微生物DNA刺激时Ⅰ型干扰素转录障碍,也提示STING基因可能是猪抗病原微生物感染的关键因子。     

慢病毒介导稳定表达 Cas9 蛋白的鸡成纤维细胞系构建及其活性验证

【目的】筛选稳定表达 Cas9 蛋白的鸡成纤维细胞系（DF-1）,并基于单链退火修复机制（Single Strand Annealing, SSA）的报告载体系统,检测 DF-1 细胞系中的 Cas9 核酸酶活性。【方法】将携带 Cas9 蛋白的慢病毒载体质粒与辅助质粒一起转染 293T 细胞包装慢病毒,收集慢病毒 Cas9 上清液感染 DF-1 细胞,经抗生素筛选得到稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞,分别用 PCR 和 Western blot 验证阳性 DF-1 细胞表达 Cas9 蛋白的情况;选择鸡卵清白蛋白（OVA）基因的 sgRNA 序列,将 sgRNA 退火产物克隆至 pYP152 构建 sgRNA 表达载体,并在 sgRNA 靶位点两端设计引物扩增 OVA 基因靶片段,将靶片段克隆至报告载体 pCMV-SSA-mCherry-Hind Ⅲ,以破坏 mCherry 蛋白的表达,之后再将 sgRNA 表达载体与 SSA 报告载体共同转染稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞,最后在荧光显微镜下分析不同稳转株对 mCherry 蛋白表达的修复情况。【结果】经抗生素筛选得到 27 株稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞系,采用 PCR 扩增稳转细胞基因组,结果显示这些细胞具有 Cas9 蛋白基因序列,Western blots 试验结果显示上述稳转细胞株均表达 Cas9 蛋白;sgRNA 表达载体与 mCherry-SSA 报告载体共转后,通过荧光显微镜观察发现筛选到的稳转细胞株均可恢复报告载体中 mCherry 蛋白的表达。【结论】成功构建了具有切割活性的稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞系,可为后续在稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞系上开展鸡相关功能基因研究提供基础材料。     

绵羊IGF1基因慢病毒表达载体的构建及其促肌细胞生长作用研究

【目的】克隆绵羊IGF-1基因CDS区,构建绵羊IGF-1基因慢病毒表达载体,分析IGF-1基因在绵羊成肌细胞增殖过程中的作用。【方法】提取绵羊肝组织总RNA,通过RT-PCR方法获得IGF-1全长CDS序列,经测序鉴定后与慢病毒载体pLEX-mcs连接,构建pLEX-IGF-1慢病毒重组表达质粒,并在293T细胞中进行病毒包装和生产。分离培养绵羊原代成肌细胞,并用重组慢病毒使其感染,建立稳定转染pLEX-IGF-1的绵羊成肌细胞系。通过绘制细胞生长曲线,分析过表达IGF-1对绵羊成肌细胞生长的影响;采用流式细胞仪检测细胞周期变化。【结果】克隆获得长518bp的IGF-1CDS区序列。成功构建了pLEX-IGF-1载体,其可在绵羊细胞系中进行稳定表达。通过Western blotting检测显示,IGF-1在293T细胞以及绵羊原代成肌细胞中获得表达,细胞生长曲线显示,稳定表达IGF-1的成肌细胞比对照细胞生长速度显著加快(第1天差异显著(P0.05),第2~6天差异极显著(P0.01));细胞周期测定结果显示,稳定表达IGF-1的成肌细胞比对照细胞较早进入S期,且在S期的细胞数目比对照细胞多29.35%。【结论】绵羊IGF-1能够有效促进绵羊成肌细胞的生长。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向敲除奶山羊胎儿成纤维细胞SCD1基因

【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除奶山羊胎儿成纤维细胞(GFFs)中硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)基因,旨在为奶山羊敲入外源性基因奠定理论基础以及构建动物模型提供生物材料.【方法】根据"20N+NGG"原则在SCD1第4外显子和第6外显子分别设计6个靶向SCD1基因sgRNA(F1、F2、F3、S1、S2、S3),构建PX330-eGFP-sgRNA敲除载体,通过脂质体转染到GFFs中,PCR扩增阳性细胞SCD1外显子4和外显子6的核苷酸序列,连接到pEASY-Blunt载体上,测序评估不同sgRNA的敲除效率;分别在第4外显子和第6外显子选择敲除效率高的sgRNA共同转染GFFs,经流式分选获得敲除SCD1基因的GFFs.【结果】设计的6个sgRNA均能够连入PX330-eGFP载体中,单克隆菌测序试验表明sgRNA F2、sgRNA F3、sgRNA S1和sgRNA S2具有敲除作用,其敲除效率分别为41.67%、30.77%、6.67%和28.57%;实时荧光定量PCR检测结果表明sgRNA-F2-S2与sgRNA-F3-S2转染组均能显著降低阳性细胞中SCD1的mRNA水平(P0.05);Western Blot检测结果表明在阳性细胞中均未表达SCD1蛋白.【结论】获得两株敲除SCD1基因的GFFs,为制备敲除SCD1基因奶山羊核供体提供了生物材料.     

口蹄疫病毒VP1基因重组慢病毒载体的构建及VP1基因稳定表达细胞系的建立

【目的】构建口蹄疫病毒VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1,并建立稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。【方法】采用RT-PCR技术从口蹄疫病毒材料中扩增出VP1基因,并将其连入慢病毒载体FG9中,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,转染BHK-21细胞,96h后经流式细胞分选筛选GFP阳性细胞,细胞增殖后经WB检测VP1基因的表达。【结果】VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1测序正确,转染BHK-21细胞经流式细胞仪筛选的GFP阳性细胞后可稳定表达VP1基因。【结论】VP1基因重组慢病毒载体构建成功并获得了稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。     

慢羽鸡成纤维细胞内源性白血病病毒ev21基因敲除

【目的】探索在慢羽鸡成纤维细胞中敲除ev21基因的可行性,净化鸡群内源性逆转录病毒,同时为快速培育缺失ev21基因的慢羽鸡配套系打下基础。【方法】根据ev21基因序列（KY235336）特点,分别在其5'和3'端各设计2个sgRNA,用于构建4种不同sgRNA的打靶质粒,筛选出在5'和3'端打靶效率较高的sgRNA。然后基于CRISPR/Cas9基因编辑技术对ev21基因进行剪切,并通过同源重组方式以红色荧光蛋白（mCherry）的DNA片段（CAG-mCherry）替换ev21基因,实现对慢羽鸡成纤维细胞内源性白血病病毒ev21基因定点敲除。【结果】在慢羽鸡成纤维细胞中能检测到ev21基因,构建的4种sgRNA（sgRNA1~sgRNA4）均能成功插入对应的打靶质粒中,经嘌呤霉素筛选及T7E1酶切检测,发现转染4种不同sgRNA打靶质粒后慢羽鸡成纤维细胞均有不同程度的死亡,其中又以sgRNA1和sgRNA3的基因敲除效率较高。同时针对同源位点左右同源臂构建表达mCherry的供体质粒,以其转染293T细胞12 h后均能表达出mCherry。以sgRNA1和sgRNA3打靶质粒及供体质粒共同转染慢羽鸡成纤维细胞,观察发现成纤维细胞内的mCherry持续表达,至转染后第30 d通过流式细胞仪分选收集红色荧光阳性成纤维细胞,并提取其总DNA进行PCR鉴定与基因测序,结果显示红色荧光阳性成纤维细胞中有目的片段（CAG-mCherry）插入,即以插入替换方式能实现对ev21基因的敲除。【结论】基于crispr/cas9基因编辑技术的基因敲除方法能成功敲除慢羽鸡成纤维细胞内源性白血病病毒ev21基因,为培育缺失ev21基因的慢羽鸡品系提供技术支持。     

AAV-SaCas9敲除MSTN基因病毒的构建及鉴定

为了研究肌肉生长抑制素(MSTN)的相关功能,应用分子生物学方法构建敲除MSTN的AAVSaCas9载体,通过转染293T细胞提取基因组后进行T7酶切鉴定、TA克隆及测序确定该基因的敲除效果;将鉴定正确的AAV-SaCas9重组质粒与pHelper质粒共转染AAV-293细胞3 d后,分离纯化病毒并用实时荧光定量PCR法检测病毒滴度。结果显示,成功构建了敲除MSTN基因的AAV-SaCas9重组载体,T7酶切和测序鉴定出sgRNA2位点可以对MSTN进行编辑,并成功将其包装成病毒,经荧光定量PCR鉴定病毒滴度为2.73×10~(12)vg/mL。     

Mmu-miR-34c慢病毒表达载体构建及在奶山羊雄性生殖干细胞的表达

【目的】用两种方法构建miR-34c的慢病毒表达载体,并包装成慢病毒颗粒,为经济、高效的进行miR-34c超表达提供方案,为进一步研究miR-34c的作用奠定基础。【方法】 从小鼠基因组中扩增miR-34c前体,分别插入pLL3.7的CMV启动子起始的GFP之后或U6启动子后,构建成载体pLL3.7-CMV-34c及pLL3.7-U6-34c。将重组慢病毒载体和包装质粒混合物转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,测定病毒滴度。感染293T细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞,用293T细胞与奶山羊雄性生殖干细胞的GFP表达程度测定转染效率,用定量PCR方法测定miR-34c的表达效率。【结果】重组质粒酶切及PCR分析及转化菌液测序,证明插入序列正确,qPCR检测显示：miR-34c的表达在慢病毒载体感染的293T细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞均显著上调。【结论】用 pLL3.7慢病毒载体中的CMV和U6两种启动子均可经济高效地进行miR-34c超表达,且由U6启动子启动的miR-34c慢病毒表达载体可以成功高效感染关中奶山羊雄性生殖干细胞。     

慢病毒介导稳定表达禽β-防御素9的 DF-1细胞系的建立及初步应用

【目的】为建立能够稳定表达禽β-防御素9(AvBD9)的DF-1细胞系,并检测其表达产物对耐药大肠杆菌的抗菌活性。【方法】将AvBD9基因克隆至慢病毒载体pLOV-eGFP中,将重组质粒与psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞,包装成含AvBD9基因的重组慢病毒,并将其感染DF-1细胞,通过嘌呤霉素筛选和纯化,获得稳定表达AvBD9蛋白的DF-1细胞系。利用RT-PCR和Western blot验证AvBD9基因在DF-1中的转录和表达;将细胞培养上清液与耐药大肠杆菌混合培养,检测其抗菌效果,并用扫描电镜观察其对菌体的损伤情况。【结果】筛选出了稳定表达AvBD9的DF-1细胞系,且AvBD9在转录水平和蛋白水平均有表达;细胞培养上清使耐药大肠杆菌的存活率低于55%,电镜观察显示菌体皱缩,损伤严重。【结论】成功建立能够稳定表达AvBD9的DF-1细胞系,为抗生素替代品的生产制备提供了借鉴思路,为进一步开展AvBD9的抗菌研究提供依据。     

猪Jiv90基因打靶载体的构建与细胞转染试验

【目的】构建猪Jiv90基因的同源打靶载体,并转染猪血管内皮细胞系(SUVEC),对Jiv90基因的敲除效果进行初步验证。【方法】根据NCBI中公布的Jiv90基因序列,克隆得到Jiv90基因核心区两侧的基因序列,并以此为长短臂,构建了可定点敲除Jiv90基因的打靶载体。用该载体转染SUVEC,通过新霉素(G418)和丙氧鸟苷(GANC)的筛选得到稳定的细胞株,再利用PCR检测neo基因在细胞基因组上的整合情况,最后对筛选得到的neo阳性细胞进行猪瘟病毒(CSFV)感染试验,并用实时定量PCR(Real-time PCR)检测CSFV的增殖情况。【结果】以提取所得品质良好的SUVEC全基因组DNA为模板,克隆得到了针对Jiv90基因打靶的核心区两侧基因序列,基因片段长度分别为4 522bp和1 944bp。将长短臂与打靶骨架载体pA2T相连后,构建了关于猪Jiv90基因的同源打靶载体JKS。用JKS载体转染SUVEC,通过1 500μg/mL G418和200nmol/mL GANC正负筛选,得到了稳定转染JKS载体的SUVEC。对于稳定筛选后的试验组细胞,感染CSFV并进行Real-time PCR,结果表明,正常细胞中的CSFV核酸含量是转染JKS载体细胞的3.65倍。【结论】成功扩增了针对猪Jiv90基因的同源长短臂,并构建了猪Jiv90基因的打靶载体JKS,敲除Jiv90基因细胞中的CSFV核酸片段含量显著降低,说明Jiv90基因的敲除可降低细胞中猪瘟病毒的增殖量。     

表达sFat-1基因慢病毒载体的构建及病毒生产

为了建立有效地用于转基因动物生产的慢病毒表达系统,以线虫C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因(sFat-1)为目的基因构建了慢病毒表达载体,通过与慢病毒包装载体PLP1、PLP2和PLP/VSVG一起共转染293FT细胞系生产了慢病毒颗粒,并对其感染哺乳动物细胞NIH3T3细胞系的能力进行了检测。结果表明,该系统所生产的病毒滴度约为5.0×106TU/mL,这种病毒能够感染哺乳动物细胞,说明构建的慢病毒表达系统是有效的,应用其可以生产感染力良好的慢病毒颗粒,并高效地进行sFat-1基因转移。     

基于CRISPR/Cas9系统的MDCK细胞IFN-β1编码序列的敲除

为了建立高品质的犬肾(MDCK)单克隆细胞系,使用CRISPR/Cas9技术实现MDCK细胞IFN-β1基因的敲除,构建细胞培养禽流感病毒(AIV)增殖体系。首先,根据CRISPR/Cas9系统的技术要求构建了Cas9表达载体和sgRNA载体;然后,用3种载体共转染MDCK细胞,通过GFP阳性特征分选单细胞克隆,单细胞克隆培养在96孔板中。通过PCR扩增和对IFN-β1靶序列进行测序,确定了阳性MDCK单细胞克隆中IFN-β1的敲除。结果成功构建了具有IFN-β1敲除的MDCK单细胞克隆细胞系,与原始细胞相比,该细胞系的病毒增殖能力提高。     

NTE基因ShRNA慢病毒载体的构建与鉴定

【目的】构建神经病靶酯酶(NTE)蛋白低表达的ShRNA重组慢病毒表达系统。【方法】依照ShRNA序列设计原则设计带酶切位点的NTE ShRNA序列,与表达载体pLL3.7连接构建NTE ShRNA重组表达质粒,转染DH5α菌观察重组表达状况,与pCVM-VSV-G包膜质粒和pCMV-dr8.2dvpr表达质粒共转染293T细胞,包装得到重组慢病毒。用病毒稀释法以绿色荧光蛋白(GFP)为标记,确定转染效率及病毒含量。【结果】经酶切及测序鉴定结果显示成功构建pLL3.7-NTE ShRNA慢病毒载体。重组慢病毒质粒与辅助质粒共转染293T细胞后获得高表达的细胞,共转染48h后,收集病毒液检测病毒滴度达4.5×10~4/mL。【结论】成功构建NTE ShRNA慢病毒重组表达系统。     

利用CRISPR/Cas9系统构建可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系

目的 将Tet-on系统与CRISPR/Cas9系统相结合建立诱导敲除猪Sohlh1基因的细胞系。方法 分离培养猪胎儿成纤维细胞(PFF),进行慢病毒载体PCW-eSpCas9(1.1)侵染并通过1 μg/mL嘌呤霉素筛选及强力霉素(Dox)诱导;改造pLV-sgRNA载体,进行293FT细胞转染验证;构建含Sohlh1基因目标靶点的pLV-sgRNA-2A-GFP特异性载体,进行慢病毒包装检测;利用包装病毒侵染稳转PCW-eSpCas9(1.1)的PFF细胞,3 μg/mL灭稻瘟菌素进行筛选,随后添加Dox诱导进行表达分析和敲除效率检测。结果 建立了受Dox调控可诱导eSpCas9(1.1)蛋白表达的PFF细胞系,不添加Dox,eSpCas9(1.1)蛋白不表达;293FT细胞表达绿色荧光,表明pLV-sgRNA-2A-GFP载体改造成功。3、4、6号Sohlh1基因靶点具有敲除活性,利用最优的2个靶点构建了pLV-sgRNA-2A-GFP特异性载体,荧光表达显示载体慢病毒包装成功。构建稳转PCW-eSpCas9(1.1)和pLV-sgRNA-2A-GFP的PFF,经Dox诱导72 h后,Sohlh1基因的敲除效率为85%。结论 利用Tet-on系统和CRISPR/Cas9系统成功构建了可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系,为研究Sohlh1基因的功能以及制备条件性敲除Sohlh1基因去除生殖细胞的模型猪奠定了基础。     

miR-505慢病毒表达载体的构建

目的:构建携带增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和miR-505基因的慢病毒载体。方法:采用PCR方法从pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-505表达载体质粒扩增出miR-505 shRNA基因编码区173bp、175、171bp片段,通过限制性酶切、T4DNA连接酶连接,分别将miR-505 shRNA基因插入慢病毒表达载体FUGW与L26Fsy(1.1)GW中,构建成重组载体FUGW-miR-505-3p/5p/nc与Fsy-miR-505-3p/5p/nc。脂质体介导下将慢病毒重组载体转染至HEK 293T细胞,通过EGFP观察转染效率,RT-PCR方法检测miR-505的表达量。结果:荧光显微镜下观测到HEK 293T细胞转染后有较强绿色荧光;RT-PCR显示转染FUGW-miR-505-3p/5p与Fsy-miR-505-3p/5p的HEK 293T细胞中对应miR-505-3p/5p明显升高。结论:成功构建带有EGFP和miR-505-3p/5p/nc shRNA基因的慢病毒表达载体。     

CRISPR/Cas9系统介导大鼠Inhba基因的编辑

利用chopchop网站对大鼠Inhba基因的第二外显子设计sgRNA位点,通过合成sgRNA寡核苷酸、酶切连接构建到px330载体,再转染px330–Inhba–sgRNA载体到大鼠L6细胞,通过T7E1酶切、T载体克隆测序来验证sgRNA编辑Inhba基因的效率。结果表明：转染pX330–Inbha–sgRNA载体后,Inhba基因的编辑区域的PCR产物能被T7E1酶切割预期条带;T载体克隆测序显示,随机选取的20个单克隆中有5个克隆在预期切割位点附近出现不同长度的碱基缺失,估测编辑效率为25%。可见,本研究设计的sgRNA能够有效利用CRISPR/Cas9系统对Inhba基因进行编辑。     

利用CRISPR/Cas9技术敲除RNA甲基化酶TRDMT1基因及其功能初探

为构建TRDMT1基因敲除的HEK293细胞系,利用CRISPR/Cas9系统在TRDMT1基因第1个外显子前插入BGH Ploy(A)转录终止序列,终止TRDMT1基因表达。利用重叠PCR方法合成sgRNA序列,构建TRDMT1-gRNA载体及含不同抗生素基因的同源重组载体TRDMT1-LOXN-Puro和TRDMT1-LOXP-Neo;将同源重组载体TRDMT1-LOXN-Puro、TRDMT1-LOXP-Neo及TRDMT1-gRNA、Cas9表达载体MLM3613共转染HEK293细胞;利用Puromycin和Neomycin抗生素筛选细胞,通过RT-qPCR检测TRDMT1基因转录终止效率。通过细胞生长曲线和划痕试验检测TRDMT1基因敲除对HEK293细胞增殖和迁移能力的影响。结果表明:成功构建了TRDMT1-gRNA载体及TRDMT1-LOXN-Puro、TRDMT1-LOXP-Neo同源重组载体;与正常HEK293细胞相比,试验组TRDMT1表达量仅为1%;TRDMT1基因敲除后显著影响HEK293细胞增殖和迁移。这一研究通过CRISPR/Cas9技术成功构建了TRDMT1基因敲除的HEK293细胞系(HEK293-TKO),为RNA甲基化研究提供了一种有效的工具;TRDMT1基因可能与细胞的增殖和迁移有关。     

eIF5A基因敲除MARC-145多克隆细胞系的建立及其对PRRSV增殖的影响

旨在利用CRISPR/Cas9系统构建敲除真核翻译起始因子5A(Eukaryotic translation initiation factor 5A,eIF5A)的MARC-145多克隆细胞系，并验证该细胞系对PRRSV感染的影响。针对eIF5A基因构建并筛选成功获得重组慢病毒，用重组慢病毒感染MARC-145细胞，嘌呤霉素及有限稀释法进行筛选，获得敲除eIF5A的MARC-145多克隆细胞系。对构建细胞系进行活力检测，T7E1核酸内切酶、Real-time PCR以及Western blot验证eIF5A体外敲除效率，病毒增殖试验验证该细胞系对PRRSV复制的影响。结果表明：1)细胞活性检测结果显示敲除eIF5A基因对细胞活性无显著影响；2)通过T7E1核酸内切酶、Real-time PCR以及Western blot表明eIF5A表达显著降低，并将此细胞系命名为MARC-145-△eIF5A细胞系；3)使用PRRSV HN07-1感染MARC-145-△eIF5A,体外试验证明敲除eIF5A对PRRSV的增殖有抑制作用。综上，本研究成功构建eIF5A基因敲除的MARC-145多克...