芸芥果胶酸裂解酶基因的克隆及序列分析

采用RACE技术从芸芥自交亲和系花药中克隆出果胶酸裂解酶(Pectate lyases,PL)基因,全长1 657bp,其完整开放阅读框(Open Read Frame,ORF)为1 371bp,编码456个氨基酸,分子质量51.179ku,等电点9.42。序列比对结果表明,该蛋白与其他植物的PL蛋白具有较高的同源性,因此命名为EsPL。进化树分析表明,芸芥EsPL基因与十字花科芸薹属植物甘蓝型油菜、白菜型油菜的PL基因亲缘关系较近。实时荧光定量PCR结果显示,EsPL在芸芥开花后自交亲和系花药中的表达量显著高于自交不亲和系花药中表达量,该基因可能在芸芥自交亲和性状调控过程中发挥重要作用。     

大豆孢囊线虫果胶酸裂解酶基因Hg-pel-5的克隆与分析

【目的】克隆和分析与大豆孢囊线虫寄生密切相关的果胶酸裂解酶新基因,为研究大豆孢囊线虫寄生和致病的分子机理提供依据,并为探讨大豆孢囊线虫的防控新途径提供理论基础。【方法】通过EST分析结合RACE-PCR扩增方法,从大豆孢囊线虫中克隆出1个果胶酸裂解酶新基因;通过原位杂交和半定量PCR的方法确定基因的表达部位和分析不同发育阶段的基因表达;采用Southern杂交方法分析基因的拷贝数。【结果】 从大豆孢囊线虫中克隆出1个全长为957个碱基编码227个氨基酸残基的新果胶酸裂解酶基因Hg-pel-5（GenBank 登录号HQ123259）。Hg-pel-5 基因组由2个外显子和1个内含子组成。预测蛋白含有20个氨基酸残基的信号肽和4段细菌结构的果胶酸裂解酶第三家族的保守位点。原位杂交确定Hg-pel-5在大豆孢囊线虫亚腹食道腺中表达。半定量RT-PCR结果表明Hg-pel-5在寄生前和寄生过程早期的2龄幼虫大量表达。Southern杂交结果显示Hg-pel-5存在于大豆孢囊线虫基因组中并以多拷贝形式存在。【结论】对大豆孢囊线虫中1个新的果胶酸裂解酶基因Hg-pel-5进行克隆和分析,表明该基因在大豆孢囊线虫早期寄生过程中发挥重要作用。     

黑曲霉果胶裂解酶基因的克隆与原核表达

根据NCBI上果胶裂解酶(PL)基因在黑曲霉基因组上的分布特点设计特异引物,通过重组PCR扩增出黑曲霉编码PL的结构基因。将PL基因连接到大肠杆菌表达载体pET-28a上,得到重组质粒pET-28a-PL,转化大肠杆菌(E.coli)BL21后,用IPTG进行诱导表达。结果表明,PL基因片段序列全长1 431bp,与已知PL基因(XM_001397206.2)核苷酸和氨基酸序列同源性均为99%。表达产物经12%SDS-PAGE电泳,得到了一条大小约为50kD的条带,与预期分子量相符,证明真菌PL基因在E.coli BL21中可以有效表达。     

果胶裂解酶、木聚糖酶及果胶裂解酶、木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

运用RT-PCR技术,从绿色木霉(AS3.3711)mRNA中扩增出木聚糖酶基因xyn2,并与质粒pPIC9K相连,构建了表达载体pPIC9K-xyn2,转化毕赤酵母GS115,并且将pPIC9K-xyn2和pPIC9K-PelC(果胶裂解酶)同时转化毕赤酵母GS115,通过组氨酸营养缺陷型筛选,G418高拷贝菌株筛选,以及摇瓶诱导表达筛选,分别得到一株高表达木聚糖酶毕赤酵母菌株X5和一株同时高表达木聚糖酶和果胶裂解酶毕赤酵母菌株PX6。同时,将一株高表达果胶裂解酶毕赤酵母菌株P2保存。重组酶酶学性质分析表明,P2和PX6分泌果胶裂解酶,X5和PX6分泌木聚糖酶最适温度均为50℃;P2分泌果胶裂解酶最适pH5.4,最大酶活为14.2U/mL;X5分泌木聚糖酶最适pH6.0,最大酶活为5.8U/mL;PX6分泌果胶裂解酶最适pH5.4,最大酶活为12.6U/mL,分泌木聚糖酶最适pH6.0,最大酶活为4.2U/mL。     

禾谷孢囊线虫果胶酸裂解酶新基因Ha-pel-1的鉴定与表达特征分析

【目的】禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)是一种严重危害麦类作物的重要植物病原线虫,对农业生产造成巨大的经济损失,然而其致病机制和有效防控方法还有待进一步研究。通过克隆禾谷孢囊线虫的果胶酸裂解酶新基因Ha-pel-1,并对其表达特性进行分析,为后续探究Ha-pel-1的基因功能及其与寄主的互作提供理论依据,并为探讨禾谷孢囊线虫防控途径提供新思路。【方法】采用同源克隆结合RACE技术从禾谷孢囊线虫中克隆出一个新的果胶酸裂解酶基因;采用DNAMAN、Clustal、Signal P 4.0 Server和GSDS等相关生物信息学软件和在线工具分析该基因的核苷酸和氨基酸序列,并使用MEGA 5.0构建系统进化树;采用原位杂交和半定量PCR方法确定该基因的在禾谷孢囊线虫中的表达部位及其在线虫不同龄期中的表达情况。【结果】从禾谷孢囊线虫中成功克隆出一个果胶酸裂解酶基因Ha-pel-1(Gen Bank登录号GQ998895),该基因c DNA全长1 717 bp,包含一个长度为1 563 bp的开放阅读框,编码一个长度为521个氨基酸残基的蛋白,其理论分子量为57.5 k D,理论等电点为8.52。从线虫基因组DNA中扩增获得长度为7 199 bp的Ha-pel-1基因组全长,基因结构显示分析发现,Ha-pel-1基因组包含14个外显子和13个内含子,除第3个内含子剪接位点是GC-AG外,其余12个内含子都符合真核生物基因剪接位点GT-AG规则。同源比对结果表明,预测蛋白Ha-PEL-1的C端与大豆孢囊线虫果胶酸裂解酶HG-PEL-1、甜菜孢囊线虫果胶酸裂解酶HS-PEL-1均有67%的一致性和83%的相似性;此外,其N端信号肽后比报道的其他植物寄生线虫果胶酸裂解酶多出一段长度为254个氨基酸残基的序列,这段序列中,靠近N端的184个氨基酸残基与数据库中的蛋白均无相似性,而靠近C端有70个氨基酸残基(Lys205—Glu274)与韦塞尔斯布朗病毒NS5蛋白(注册号3ELD)的甲基转移酶区域有32%的一致性和47%的相似性。氨基酸序列分析发现,预测蛋白Ha-PEL-1包含一个长度为20个氨基酸残基的信号肽和4个果胶酸裂解酶第3家族(PL3)的高度保守区域以及多个保守的半胱氨酸残基;系统进化分析发现,Ha-pel-1及其他已报道的线虫果胶酸裂解酶基因与细菌和真菌来源的PEL聚在一个大的分支中;原位杂交结果显示Ha-pel-1主要在禾谷孢囊线虫亚腹食道腺中表达;半定量RT-PCR确定Ha-pel-1在寄生前和寄生后的2龄幼虫中大量表达。【结论】通过对禾谷孢囊线虫中一个新果胶酸裂解酶基因Ha-pel-1的克隆和表达特征分析,揭示该基因与禾谷孢囊线虫的侵染和寄生过程密切相关。     

桑青枯雷尔氏菌gsp C和gsp M基因的获取与序列分析

II型分泌系统广泛存在于革兰氏阴性细菌中,转膜蛋白基因簇是其分泌途径的中心。利用PCR扩增和测序,获得了桑青枯雷尔氏菌MR111的gsp C基因707 bp和gsp M基因575 bp的序列,SMART软件预测gsp C基因编码的7~29位氨基酸为跨膜结构域,羧基末端无PDZ结构,gsp M的胞质结构域有2个α螺旋和4个β折叠。使用gsp C和gsp M的保守序列组成的联合矩阵构建系统发育树,结果表明,桑青枯雷尔氏菌MR111与罗尔斯顿氏菌和雷尔氏菌属优先聚合在同一分支,伯克氏菌和伯克霍尔氏菌位于较远分支。     

柑桔炭疽菌果胶裂解酶pelB基因特异性引物的筛选

以柑桔炭疽菌为主要研究对象,根据已知的炭疽菌果胶裂解酶pelB基因序列,运用GenBank及Primer Premier 5共设计6对引物,其中编号为PB1/PB2、Cg1A/Cg1b及Cg2a/Cg2b的引物可扩增出pelB基因片段,经同源性分析,全序列与GenBank中登录号为GU478342.1 pelB基因的的同源性高达98%,PB1/PB2、Cg1A/Cg1b对柑桔胶孢炭疽菌果胶裂解酶pelB基因有较高特异性。     

肺炎克雷伯氏菌S001草甘膦靶标酶基因的克隆及其抗性验证

【目的】由于草甘膦在农业生产中的广泛使用,抗草甘膦转基因作物的研究一直是转基因作物研究的热点,其中草甘膦抗性功能新基因的挖掘是核心问题。自然界中微生物种类繁多,基因资源丰富,论文拟从广东地区农田土壤中筛选和鉴定出高抗草甘膦菌株,克隆其草甘膦靶标酶基因并进行抗性水平验证,以期获得高抗草甘膦新基因资源用于抗草甘膦转基因作物的研究。【方法】用含有浓度梯度草甘膦的选择培养基从备选土壤中筛选出具有高抗草甘膦特性的菌株;通过显微观察、革兰氏染色以及16S rDNA序列分析结果对菌株种类进行鉴定;利用RT-PCR技术克隆该菌株的草甘膦靶标酶基因aroAS001,并通过序列比对和系统发育树分析aroAS001序列的基本特征;利用重叠 PCR法对aroAS001变异位点进行定点突变获得aroAS001-mut序列后,将aroAS001和aroAS001-mut基因片段转入aroA基因缺陷型菌株DH5α/△aroA中进行基因功能互补和草甘膦抗性水平验证。【结果】分离出一株高抗草甘膦菌株,经形态学和分子生物学鉴定该菌株为肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）,命名为kpS001;克隆该菌株草甘膦靶标酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）基因aroAS001,序列分析结果显示由该基因所编码的氨基酸序列具有典型的Class I EPSPS特征,但与已报道肺炎克雷伯氏菌的aroA相比其第227位碱基发生突变,致使对应的氨基酸发生变异。对该基因差异位点进行核酸定点突变获得aroAS001-mut基因片段后,将aroAS001和aroAS001-mut基因片段分别转入缺陷型大肠杆菌菌株DH5α/△aroA进行功能互补验证,与对照菌株相比,转入aroAS001和aroAS001-mut的重组菌株均能在含200 mmol?L-1以下浓度草甘膦的培养基中能够正常生长,表现出良好的抗性,之后随着草甘膦浓度增加其生长状态开始受到抑制,当草甘膦浓度达到350 mmol?L-1时,菌株生长基本完全被抑制。【结论】肺炎克雷伯氏菌kpS001菌株是一株高抗草甘膦菌株,由aroAS001编码的草甘膦靶标酶EPSPS属于Class I EPSP合成酶,aroAS001对草甘膦具有优良抗性,能在含350 mmol?L-1以下浓度草甘膦的培养基中生长,该基因可以作为备选基因资源用于抗草甘膦转基因作物的研究。     

产酸克雷伯氏菌游动性减弱突变体的筛选

以产酸克雷伯氏菌KO108为研究对象,通过构建转座子突变体文库,筛选获得2株游动性显著降低的突变菌株,并以转座子mTn5gusA-pgfp21构建突变体库,利用地高辛生物标记gfp基因序列作为探针,Southern杂交验证突变体库的质量,根据杂交条带判断mTn5gusA-pgfp21转座子插入染色体的拷贝数,以反向PCR获取未知序列,通过基因组学分析预测游动性相关基因。结果表明:产酸克雷伯氏菌KO108具Kan抗性标记、GUS活性、GFP遗传标记的突变体库可由两亲结合经转座子mTn5gusA-pgfp21转座突变获得;随机选择100株突变体进行游动性筛选,仅获得2株游动性显著降低的目标菌株MA和MD;MA、MD与KO108差异显著(P0.05),而MA和MD之间没有显著差异;Southern杂交结果显示MA和MD的转座子mTn5gusApgfp21为单插入,且插入位点所在的酶切片段大小不同;经反向PCR、测序、序列分析,发现MA突变基因为醌类氧化还原酶(NAD(P)H:quinone oxidoreductase)(NQR)基因簇的NqrA,MD突变基因为LPS脂多糖生物合成基因簇基因;生长曲线检测显示KO108和MA、MD无显著差异;菌膜检测发现MD与KO108、MA有一定差异,但KO108与MA之间无显著性差异;以Biolog ECO检测KO108和MA、MD的碳源利用情况,结果表明MA和MD 72h后仍然不能利用羧酸类碳源D-半乳糖酸γ-内酯和2-羟基苯甲酸。     

瓦氏黄颡鱼肝脂酶基因cDNA序列的克隆与序列分析

利用RT-PCR方法克隆瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)肝脂酶cDNA序列片段,并对其基因结构和系统进化关系进行分析.瓦氏黄颡鱼肝脂酶cDNA片段长1065 bp,编码353个氨基酸.肝脂酶氨基酸序列同源性分析结果表明,瓦氏黄颡鱼与其他鱼类的同源性为62%-100%.瓦氏黄颡鱼肝脂酶氨基酸残基包含糖基化位点、催化位点、催化中心三联体位点、脂质结合位点和多肽"盖"等主要结构区域.系统进化树分析表明,瓦氏黄颡鱼肝脂酶与草鱼、鳙、斑马鱼肝脂酶聚为一支.因此,瓦氏黄颡鱼的肝脂酶在鱼类进化中较为保守.     

毛皮动物克雷伯氏菌的病学分析与防治

<正>克雷伯氏杆菌既是一种人兽共患病病原,又是一种可引起多种动物患病的条件性致病菌。该菌属于肠杆菌科、克雷伯氏菌属的成员,与人和动物有关的是肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌两个种,分布于动物的消化道、呼吸道、泌尿生殖系统及皮肤等。长期以来,人们都认为它只是一种条件致病菌,对畜禽危害不大,一直未引起重视。但是近年来,肺炎克雷伯氏菌对     

植物果胶裂解酶的研究现状及展望

果胶是一种结构性多聚糖,也是植物细胞壁的主要成分。果胶裂解酶(PL)则是一类通过β-反式消除作用切割α-1,4-糖苷键,降解去甲酯化果胶产生寡聚糖的酶类。PL的研究将有助于了解植物细胞壁的代谢网络并促进其在食品、造纸、纺织和生物能源等行业中的工业化应用。本文总结了30年来植物果胶裂解酶基因(PL)的鉴定及功能研究的进展情况,归纳了PL在植物生长发育、花器官发育、果实成熟软化、植物与病原微生物的相互作用以及过敏性反应中的生物学功能,并对PL的未来研究进行了展望。     

水貂克雷伯氏菌病的诊治

正2015年8月,文登区大水泊镇水貂养殖户饲养的水貂零星出现了以颈部和颌下发生肿胀、呼吸困难、食欲废绝为主要症状的疾病。经临床诊断,结合剖检变化和实验室检查,确诊为水貂克雷伯氏菌病。1临床症状主诉:发病貂初期出现食欲减退、废绝,之后全身出现小脓疱,尤以颈部、颌下出现较多。发病貂在咽喉部皮下出现脓疱,并顺颈部向下蔓延,达到肩部后破溃流脓。严重病例后肢麻痹,步态不稳,多数病貂出现症状后2~3天内死亡。个别病例表     

球毛壳菌几丁质酶3基因的序列分析

根据EST分析的结果，从cDNA文库中挑取几丁质酶3基因的克隆进行了测宁并序列分析。结果表明：cDNA文库中几丁质酶3基因的克隆插入片断大小为1268bp；用Phrap软件拼接出来的几丁质酶3的表达序列标签拼接序列与实际平列不完全吻合：因此，在EST分析中不用Phrap软件为好。     

水貂克雷伯氏菌病的诊治

20 0 3年 7月 ,某养殖场的水貂感染了以发热、全身出现脓疡 ,特别是颈部有许多小脓泡、肺出血、呼吸困难、急性死亡为特征的疾病。经流行病学调查、临床检查、病理剖检及细菌学检查 ,确诊为水貂克雷伯氏菌病。1　发病情况该场饲养水貂 5 2 0只 ,发病 36只 ,死亡 15只 ,发病率 6     

桦褐孔菌漆酶基因片段的克隆与序列分析

通过简并引物克隆得到了桦褐孔菌及同属真菌共11个菌株的漆酶基因片段,并对其结构与同源性进行了分析。结果表明:11个目的扩增产物均含有2个内含子,且内含子位置保守,推导的氨基酸序列中均包含有保守的铜离子结合位点;DNA序列与氨基酸序列的相似度都颇高,基于2类序列构建的NJ系统进化树均能将除俄罗斯采集的桦褐孔菌菌株外归为1组,该漆酶基因片段可用于鉴定桦褐孔菌。     

麝鼠克雷伯氏菌病的诊断与治疗

麝鼠(Onda tra Zibe Zhica)克雷伯氏菌病又称麝鼠多发性脓肿,是由肺炎克雷伯氏菌(Klebsie lla Pneumoniae)引起的一种呈散发或地方性流行的慢性传染病。该病幼鼠易发,多发生在夏、秋季节,     

蟒蛇肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定

亚洲岩蟒主要栖息在热带与亚热带森林,具有较高的药物、营养和经济价值,人工养殖中常因肺炎而死亡.为调查该病病因,对海南省养殖场发病蟒蛇进行心脏穿刺采集血样、细菌培养、革兰氏染色镜检、16S rRNA基因序列测定和BLAST分析等方法寻找病原,结果表明,分离菌株为肺炎克雷伯氏菌.     

宁夏地区牛源肺炎克雷伯氏菌分离鉴定及主要毒力基因分析

本研究以宁夏地区导致牛群发病的肺炎克雷伯氏菌作为研究对象,通过生化实验和细菌特异性基因Khe基因的PCR扩增,最终分离鉴定出14株肺炎克雷伯氏菌.对分离菌株进行毒力基因检测,结果显示毒力基因mrkD、wabG、rmpA、fimH的检出率分别为35.7%、100%、87.5%、21.4%.该研究对肺炎克雷伯氏菌分离株的毒力基因的分布进行了检测分析,可为宁夏地区牛群肺炎克雷伯氏菌病的诊断与防治工作提供理论依据.     

桑青枯雷尔氏菌MR111的GspF基因的获取与结构分析

Gsp F是细菌Ⅱ型分泌系统的内膜平台的重要蛋白,利用PCR扩增技术,获得了桑青枯雷尔氏菌MR111的含有该类基因功能性结构域的Gsp F基因。NCBI在线BLASTP分析发现,该基因与雷尔氏菌属来源的同源基因的一致性在90%以上;在聚类分析中,首先所有雷尔氏菌属同源基因聚合在同一分支,后与皮氏罗尔斯顿菌的同源基因聚合。基因结构分析表明,该基因有2个由α螺旋组成的具有高度相似性的、跨膜胞质结构域,揭示该基因可能参与细菌的跨膜分泌。