兔IFN-γ基因的克隆、遗传进化分析及其表达

运用RT-PCR技术对用ConA刺激后的中国白兔外周血淋巴细胞(PBMCr)进行扩增,将纯化后的PCR产物克隆入pMD18-T中进行序列测定,并进行遗传进化分析.结果发现:该基因全长501 bp,编码167个氨基酸,其中前20个氨基酸残基构成信号肽序列.与不同物种IFN-γ基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列有一定的差异.在推导的中国白兔IFN-γ氨基酸序列中,在41~43、108~110和117~119位存在3个潜在的N-联糖基化位点,同时存在3个Cys残基.转化重组质粒pETIFN-γ的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导后,重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为22.6 kDa的重组蛋白.经凝胶薄层扫描,重组蛋白表达量可占菌体蛋白的19.2%.     

甲状腺肿瘤与细胞因子IL-4、IL-10、IFN-γ、IL-17关系研究进展

<正>现有临床研究表明细胞因子在机体肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用[1],细胞因子是低分子量蛋白质家族成员,在免疫细胞的分裂、迁徙、生长、分化及凋亡过程中相互作用,形成了一个特定的网络。甲状腺肿瘤是内分泌系统常见的肿瘤,占头颈部肿瘤的首位。按其组织发生学、细胞分化程度和生物学特性,甲状腺肿瘤可分为良性肿瘤和恶性肿瘤,大多数为良性肿瘤。近几年来,甲状腺肿瘤发病呈上升趋势,女性明显多于男性,已经成为发病率增长最快的肿瘤[2]。目前,甲状腺肿瘤病因及发病机制尚不清     

IFN-γ、IL-4、IL-17在小鼠哮喘模型不同阶段的变化及其意义

目的研究小鼠支气管哮喘模型不同时间段IFN-γ、IL-4、IL-17浓度的变化,探讨其在哮喘发病机制中的作用。方法卵白蛋白(OVA)致敏建立小鼠哮喘模型,BALB/c小鼠40只,随机分为3组:正常对照组8只,模型对照组8只,哮喘模型组24只。哮喘模型组分别在雾化攻击6d、10d及14d(分别称为哮喘6d、10d、14d组)后随机选取8只小鼠处理,取各组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)及血清,测定IFN-γ、IL-4、IL-17的浓度。结果①.与健康对照组相比,哮喘模型组(包括6d、10d、14d)BALF及血清中的IL-4和IL-17水平升高,而IFN-γ水平则降低,差异具有统计学意义(P<0.05);②.BALF中14d哮喘组各细胞因子水平与6d哮喘组比较,差异也具有统计学意义(P<0.05),但10d哮喘组和6d哮喘组间无明显差异(P>0.05);③.不同时间段哮喘模型血清中细胞因子水平没有差异(P>0.05)。结论 IFN-γ、IL-4、IL-17在哮喘模型不同发病阶段水平会发生变化,因此这些细胞因子在哮喘的发生发展中可能发挥了一定的作用。     

中药复方多糖对鸡IFN-γ、IL-4和L-12质量浓度的影响

通过观察和比较盐酸左旋咪唑、黄芪多糖和对鼠免疫增强效果显著的中药复方多糖对雏鸡细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-12质量浓度的动态变化,筛选出可显著提高雏鸡细胞因子质量浓度的中药复方多糖的最佳剂量。将300羽雄性良凤青脚麻鸡随机分为6组,即生理盐水组(对照)、黄芪多糖组(APS)、盐酸左旋咪唑组(LM)、高剂量中药复方多糖组(cCHMPSH)、中剂量中药复方多糖组(cCHMPSM)和低剂量中药复方多糖组(cCHMPSL),每组50只。于8日龄时分别皮下注射生理盐水、25g/L APS、50g/L LM、50g/L cCHMPS、25g/L cCHMPS、12.5g/L cCHMPS,每只注射0.2mL,连续注射7d,在免疫后第8、14、21、28、35、42天采血,测定外周血中IFN-γ、IL-4和IL-12的质量浓度。结果表明,黄芪多糖和中药复方多糖均能显著提高外周血中IFN-γ、IL-4和IL-12的质量浓度,调节Thl/Th2免疫平衡,并且中剂量中药复方多糖免疫效果优于黄芪多糖和高、低剂量中药复方多糖,提示中药复方多糖具有开发成疗效确切、稳定、无毒的免疫增强剂的潜力。     

大白菜CBF4基因的克隆和遗传进化分析

采用RT—PCR法,从大白菜（Brassica rapa subsp．pek／nens／s）河头早中克隆了拟南芥CBF4的同源基因BrCBF4,并对它的序列特征、蛋白结构和遗传进化进行了分析。结果表明,BrCBF4全长663bp,编码一个包含220个氨基酸残基和具有典型AP2结构域的蛋白,并且含有两个潜在的豆蔻酰化位点。遗传进化分析表明,BrCBF4与BjDREB1—2的关系最近,与拟南芥AtCBF4同属一个类群,而AtCBFI,2,3与大白菜的BrCBF1,2,3及其它芸薹属植物相关基因分属另一个类群。推测BrCBF4与BjDREB1—2．AtCBF4为直系同源基因,在功能上相似,而与BrCBF1,2,3存在功能上的分化。本研究为进一步研究BrCBF4在大白菜非生物逆境响应中的功能奠定了基础。     

狐IFN-γ、IL-2基因在我国首次扩增成功

中国农业科学院特产研究所野生动物人兽共患病研究室应用RT-PCR方法在国内首次扩增出狐IFN-γ、IL-2基因序列。研究人员应用植物血凝素(PH A)诱导北极狐外周血淋巴细胞(PBM C)产生IFN-γ和IL-2,通过RT-PCR方法扩增出两个基因片段,测序结果分析得出,北极狐IFN-γ基因序列含501bp的开放阅读框,     

鸡IL-6、IL-17和IFN-γ实时荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立针对鸡白介素6（IL-6）、白介素17（IL-17）和γ干扰素（IFN-γ）的实时荧光定量PCR检测方法,为细胞因子的定量检测及病毒致病机制的研究奠定基础.[方法]根据GenBank已发表的鸡IL-6、IL-17、IFN-γ和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因保守序列,设计并合成4对相应的特异性引物,以鸡胚成纤维细胞的cDNA为模板构建重组质粒,对退火温度、引物浓度等SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应条件进行优化,建立各基因的标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性试验.[结果]GAPDH、IL-6、IL-17和IFN-γ的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增效率分别是98.2％、99.2％、102.0％和100.8％,相应的标准误差为0.00666、0.00813、0.00365和0.00458.特异性试验结果显示各基因的溶解曲线均呈单一溶解峰,敏感性试验结果表明各基因的检测下限均为100拷贝,重复性试验结果表明组内变异系数均小于2.00％.[结论]建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR具有敏感性高、重复性好、特异性强等特点,为快速检测和定量鸡源IL-6、IL-17和IFN-γ的表达水平提供了技术平台.     

毛白杨4CL基因家族的克隆与进化分析

为研究毛白杨4CL基因家族及其进化关系,采用TRIZOL法单独提取毛白杨各组织的总RNA,以反转录得到各个组织的总cDNA为模板,通过PCR技术克隆18个毛白杨4CL基因。利用MEGA软件对这18个基因以及其他25个来自不同物种的4CL基因进行了进化树分析,结果显示,毛白杨4CL基因分为两个聚类:ClassI和ClassII,4CL1～4CL5属于ClassI,而4CL6~4CL18属于ClassII。     

加味参附姜苓汤对围月经期咳嗽变异性哮喘患者血清IL-4、IFN-γ和IL-8表达的影响

目的 研究加味参附姜苓汤对围月经期咳嗽变异性哮喘患者血清炎性因子IL-4、IFN-γ和IL-8表达的影响,为其临床治疗提供科学的实证依据。方法 将围月经期咳嗽变异性哮喘患者80例,随机分为观察组（40例）和对照组（40例）。观察组患者采用加味参附姜苓汤进行治疗,对照组采用口服氨茶碱缓释片联合酮替芬片进行治疗,连续治疗3个月。分别采集治疗前、后各组患者的静脉血,经离心后,取血清,采用酶联免疫法检测血清IL-4、IFN-γ和IL-8表达水平。结果 经3个月治疗后,观察组总有效率为90%,显著优于对照组的72.5%（P<0.05）。与治疗前相比,观察组血清IL-4和IL-8表达显著降低（P<0.01）,IFN-γ水平显著上升（P<0.01）。与对照组相比,观察组血清IL-4、IL-8和IFN-γ表达水平差异具有统计学意义（P < 0.01,P < 0.05）。结论 加味参附姜苓汤对围月经期咳嗽变异性哮喘患者具有较好的治疗效果,其作用机制可能与其促进围月经期咳嗽变异性哮喘患者IFN-γ的表达和抑制IL-4和IL-8释放有关。     

玉屏风复合多糖对免疫低下小鼠血清IL-2和IFN-γ含量的影响

[目的]探讨玉屏风复合多糖对免疫低下小鼠的调节和保护作用.[方法]以环磷酰胺80 mg/kg诱导的免疫低下小鼠为实验动物模型,研究不同剂量玉屏风复合多糖（100、200和400 mg/kg）对小鼠脾脏指数、血清IL-2和IFN-γ含量的影响.[结果]高剂量玉屏风多糖能提高免疫功能低下小鼠的脾脏指数（P＜0.05）.玉屏风多糖能提高免疫抑制的小鼠血清的IL-2和IFN-γ含量,尤其以中、低剂量组效果较好.玉屏风多糖能明显提高正常小鼠血清的IL-2含量（P＜0.01）,但对正常小鼠的IFN-γ含量无显著影响.[结论]该研究可为玉屏风复合多糖的临床应用提供试验依据.     

痒螨病患兔皮损中细胞因子IFN-γ、IL-4和转录因子T-bet、GATA-3的表达

【目的】探讨不同病变评分痒螨病患兔皮损中细胞因子IFN-γ、IL-4和转录因子T-bet、GATA-3的表达。【方法】采用免疫组化、酶联免疫吸附试验和荧光定量PCR法检测痒螨病患兔(病变评分为1分、3分和5分)耳部皮损和健康兔(0分)耳部皮肤中IFN-γ/IL-4和T-bet/GATA-3的表达。【结果】与0分组相比,患病组(1分、3分和5分组)皮损处IFN-γ蛋白和IFN-γmRNA均增高,但仅3分组呈显著增高(IFN-γ蛋白:0分组=(0.344 2±0.014 33)pg/mg,3分组=(0.463 6±0.014 95)pg/mg,P<0.05;IFN-γmRNA:3分组/0分组=2.365,P<0.05)。患病组皮损处T-bet和GATA-3蛋白的阳性产物均定位于细胞核,但两者较健康组均无明显差异(P>0.05);1分组和3分组皮损中的T-bet mRNA较健康组呈显著增高(P<0.05),而3分组和5分组皮损中GATA-3 mRNA呈显著降低(P<0.05)。【结论】随着痒螨病病变评分的增加,宿主的Th2免疫反应受到抑制(GATA-3的表达降低),而Th1免疫反应则有所增强(IFN-γ和T-bet的表达增高)。     

川芎嗪联合IFN-γ对哮喘大鼠GATA-3、IL-4和IL-5的影响

目的观察川芎嗪联合γ-干扰素(IFN-γ)对哮喘大鼠转录因子GATA-3、白介素-4(IL-4)和白介素-5(IL-5)影响。方法50只健康SD大鼠,随机分为健康对照组、空白对照组、川芎嗪组、IFN-γ组和川芎嗪 IFN-γ组。每组10只;除空白组10只外,余均制作哮喘大鼠模型,哮喘激发前分别给予生理盐水、川芎嗪、IFN-γ和川芎嗪 IFN-γ。检测支气管肺泡灌洗液细胞总数和分类I、L-4I、L-5含量、肺组织中GATA-3的表达情况的变化。结果(1)空白对照组中BALF上清液中细胞总数明显增多,嗜酸性粒细胞数量上升;川芎嗪 IFN组细胞数量下降,嗜酸性粒细胞比例下降明显,与川芎嗪或IFN组比较有统计学意义(P<0.05)。(2)空白对照组中IL-4和IL-5明显增多,与健康对照组组比较有统计学意义(P<0.01);川芎嗪 IFN-γ组IL-4和IL-5下降明显,与川芎嗪或IFN-γ组比较有统计学意义(P<0.05)。(3)空白对照组支气管管壁较健康对照组增厚,川芎嗪 IFN-γ组与川芎嗪组、IFN组比较有统计学意义(P<0.05)。4 GATA-3免疫组化结果:空白对照组气道和肺组织有GATA-3表达,川芎嗪和IFN-γ组可见部分GATA-3表达,川芎嗪 IFN-γ组基本无表达或仅见很弱的GATA-3表达。结论川芎嗪联合IFN-γ能抑制哮喘大鼠GATA-3表达,降低IL-4和IL-5含量,减轻支气管管壁炎症反应。     

贵州黑山羊IL-2基因的克隆及序列分析

根据Gen Bank中山羊IL-2基因序列(登录号:NM_001287567)设计一对特异性引物,采用RT-PCR技术从贵州黑山羊外周血淋巴细胞中扩增IL-2基因,并将其克隆到p MD19-T载体上,构建IL-2基因克隆质粒,通过质粒PCR、双酶切和序列测定进行鉴定,对其核苷酸、氨基酸进行了比对分析并绘制系统进化树。结果表明,贵州黑山羊IL-2基因大小为468 bp,编码155个氨基酸。该基因与山羊、绵羊、藏羚羊、蓝牛羚、林麝、猪、牛、猫、大熊猫、犬、人、鼠、鸡等动物的核苷酸一致性在39.6%~100%,氨基酸一致性在26.7%~100%,遗传进化树表明,贵州黑山羊IL-2基因与鸡亲缘关系最远。     

外源性IFN-γ对植入前期妊娠大鼠下丘脑内IL-4阳性细胞的影响

为了解外源性IFN-γ对植入前期大鼠下丘脑内IL-4表达的影响,通过阴道口肌肉注射不同剂量IFN-γ后观察植入前期大鼠下丘脑内IL-4表达的变化,并且用免疫组织化学SP法对其检测。结果表明:在下丘脑的视前大细胞核(POMA)、视前内侧核(POM)、交叉上核(SO)、视上核(SC)、室旁核内侧部(PVM)和室周核(HPV)等处均有IL-4阳性细胞的表达分布;试验1组(注射IFN-γ25 000 IU)和试验2组(注射IFN-γ75 000 IU)各个核团中阳性细胞数与对照组相比较少而且差异显著(P<0.05),2个试验组相比,在部分核团中阳性细胞数试验1组高于试验2组,差异显著(P<0.05)。结果说明下丘脑内IL-4阳性细胞随着外源性IFN-γ剂量的增加而减少,从而说明外源性IFN-γ有可能会影响下丘脑中IL-4蛋白的表达分布。     

胡萝卜1个新4CL基因的克隆、进化及表达分析

胡萝卜(Daucus carota L.)在NCBI(美国国家生物信息中心)上总共公布了13个4-香豆酰-CoA连接酶(4CL)基因,而在芹菜转录数据中发现1个4CL基因,利用该基因序列设计1对克隆引物,成功得到1个新胡萝卜4CL基因,命名为Dc4CL-1。Dc4CL-1基因长1 635 bp,编码544个氨基酸,位于胡萝卜基因组第2染色体上。进化树分析显示,Dc4CL-1基因聚集在与木质素合成有关的4CLⅠ亚族。实时荧光定量PCR转录表达发现,在胡萝卜根生长发育期间,Dc4CL-1基因在野生胡萝卜中高表达,而在栽培胡萝卜中低表达。推测Dc4CL-1基因与胡萝卜木质素合成有关。     

稀土钕尘肺工人血清中IL-10、IFN-γ的表达及其DNA甲基化分析

尘肺病是由于长期吸入粉尘颗粒物并沉积于肺部,引起以肺纤维病变为主的疾病。在此过程中,DNA甲基化可以调节细胞因子基因活性,影响Th1、Th2型细胞因子的转录,导致Th1/Th2细胞因子之间失衡,可能是导致尘肺形成的重要原因。为明确尘肺与DNA甲基化的关系,本研究检测了尘肺病人和健康人群的全血钕含量、血清中Th1型细胞因子IFN-γ、Th2型细胞因子IL-10的表达和IFN-γ、IL-10基因启动子区甲基化状态,了解了稀土钕尘肺工人钕暴露水平和机体免疫状况,初步探讨DNA甲基化在钕粉尘致肺纤维化中的作用。结果表明,氧化钕体内高蓄积、IL-10与IFN-γ基因启动子区的甲基化水平改变,导致IL-10表达升高、IFN-γ表达降低,在钕尘肺的病情进展中起重要作用。     

麻鸭γ-干扰素基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR技术,直接从成年麻鸭脾淋巴细胞提取的总RNA中扩增出麻鸭γ-干扰素基因(duIFN-γ),并克隆、测序。测序结果表明,麻鸭IFN-γ全序列大小为515 bp,包含一个完整阅读框(495 bp),编码164个氨基酸残基,推导的氨基酸有3个潜在的N-糖基化位点,有5个与二硫键形成有关的半胱氨酸。麻鸭IFN-γ基因序列与AF087134、AF100929、AJ012254的序列完全一致,而与北京鸭(AY166850)核苷酸同源性为99.6%,有2个碱基差异,为非同义突变,氨基酸同源性为98.8%。麻鸭IFN-γ基因与鸡、火鸡和鹌鹑IFN-γ基因核苷酸序列同源性分别为77.2%、78.0%、78.8%,氨基酸序列同源性均67.1%,而与人、狒狒、猪、牛、绵羊、犬、猫IFN-γ核苷酸序列同源性为39.7%～42.1%,氨基酸序列同源性在28.0%～31.7%之间。     

固始鸭白细胞介素2基因的克隆及分子进化分析

根据已发表的鸭白细胞介素（IL-2）cDNA序列设计并合成1对引物,直接从成年固始鸭脾淋巴细胞中提取的总RNA,应用反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）扩增鸭儿-2cDNA,将扩增片段克隆入pGEM—TEasy载体,并对其进行测序、结果表明,扩增片段长度为446bp,与预期大小一致,为鸭,IL-2基因的编码区全长,共编码140个氨基酸的多肽、把该基因编码的鸭IL-2氨基酸序列与已公布的禽及哺乳动物IL-2氨基酸序列进行比较,其同源性分别在54．3％～100％和15．0％～17．9％之间．分子系统进化树分析表明,固始鸭,IL-2与哺乳动物,IL-2有共同的祖先,亲源关系较近,但在免疫系统选择性压力下,形成独特的种族特异性．     

黄牛白细胞介素-2基因的克隆与序列分析

为了克隆黄牛IL-2基因,采用RT-PCR技术,用ConA刺激12 h的黄牛颈部外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出黄牛IL-2基因,琼脂糖凝胶电泳技术显示扩增片段约为500 bp,分离纯化,将其克隆到PDM18-T载体,重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定以及核苷酸测序。结果显示,克隆的黄牛IL-2基因大小468 bp,与GenBank中报道的水牛、牛、绵羊、猫、马、鸡、犬、人、山羊、鼠、猪IL-2基因比较,同源性分别为98.9%;98.5%;97.0%;82.4%;79.9%;5.3%;78.2%;79.7%;95.9%;65.2%;84.7%。     

青鱼γ-干扰素基因的克隆与表达分析

【目的】开展青鱼γ-干扰素(IFN-γ)基因的克隆、结构特征与表达谱分析研究。【方法】采用cDNA末端快速扩增技术获得了青鱼(Mylopharyngodon piceus)IFN-γ基因cDNA的5′和3′末端序列,然后根据其末端序列设计特异性引物,扩增得到青鱼IFN-γ基因cDNA全长序列,对其序列和编码氨基酸序列进行生物信息学、同源性比较及系统进化树分析,同时对其在青鱼各组织中的表达进行分析。通过构建真核表达载体,将其转染青鱼鳍条组织细胞进行表达分析。【结果】青鱼IFN-γcDNA全长为895bp,其开放阅读框大小为549bp,编码182个氨基酸。氨基酸序列比对分析结果显示,青鱼IFN-γ与人、鸡、鼠IFN-γ的序列相似性仅为1.5%~7.7%,与其他鱼类IFN-γ序列相似性较高,为16.3%~92.9%。青鱼IFN-γ分子N末端包含1个信号肽序列、C末端有IFN-γ特征序列([I/V]-QX-[K/Q]-A-X2-E-[L/F]-X2-[I/V])以及核定位基序(RRRR)。青鱼IFN-γ蛋白二级结构与高等脊椎动物IFN-γ类似,包含7个α螺旋结构。经Poly I:C诱导后发现,IFN-γ在青鱼头肾、肾、脾、皮肤和鳃组织中表达显著上调,最高的为头肾,其次为脾、皮肤、鳃和肾,而在心脏和脑组织中无显著变化。青鱼γ-干扰素真核表达质粒在青鱼鳍条组织细胞中成功表达IFN-γ。【结论】成功克隆了青鱼IFN-γ基因cDNA,经Poly I:C诱导后,该基因在头肾中上调倍数最为显著,青鱼γ-干扰素在体外获得表达。