烟夜蛾谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆与时空表达分析

用RT-PCR方法,从烟夜蛾(Helicoverpa assulta (Guenée))成虫腹部克隆获得了1个谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)基因的完整开放阅读框cDNA序列.该基因的开放阅读框全长636 bp,编码211个氨基酸残基,推测编码蛋白的分子量为24.2 kD,等电点为6.66.将该基因推导的氨基酸序列与其他物种的GSTs进行同源性和系统发育分析,发现该基因编码的蛋白属于昆虫特异性Epsilon家族成员,将该基因命名为HaGSTe2(GenBank登录号:GQ856239).HaGSTe2在雌、雄虫触角、喙、去除触角和喙的头、胸、腹、足和翅中均有表达,而且在卵、幼虫和蛹中也有表达.     

拟环纹豹蛛谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆及表达分析

为研究拟环纹豹蛛谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因碱基序列及其对镉胁迫的响应,本研究在转录组测序的基础上,通过RT-PCR克隆了拟环纹豹蛛的GST基因(PpGST),用生物信息学方法对其序列特征进行分析,并采用荧光定量PCR检测了镉胁迫下PpGST基因的相对表达量。结果表明,克隆获得的PpGST(GenBank登录号为KY454857)基因编码区长654 bp,可编码1个217个氨基酸的蛋白质,该蛋白质理论分子量为24 900,等电点为5.98,具有GST蛋白家族保守的N端结构域和C端结构域,与温室拟肥腹蛛(Parasteatoda tepidariorum)GST蛋白Delta型有较高的相似性(65%)。荧光定量PCR分析结果显示,镉胁迫下PpGST基因的表达量显著增加(P0.05),暗示其在抵御镉胁迫中可能发挥了重要作用。     

重组GSTA3蛋白对福美双诱导的肉鸡TD中抗凋亡基因BAG-3表达的影响

【目的】肉鸡胫骨软骨发育不良(TD)是肉鸡常见的一种骨骼性疾病,研究重组GSTA3蛋白对福美双诱导的TD肉鸡软骨细胞中抗凋亡基因BAG-3表达的影响,为治疗TD提供新的思路和方法。【方法】将120羽1周龄肉雏鸡随机分为6组(编号为A、B、C、D、E、F组)。A、B、C组为基础日粮对照组,D、E、F组为添加福美双日粮诱导TD组。试验饲喂福美双2 d诱发TD,在添加福美双第1、3、5、7天,腿部肌肉注射重组鸡GSTA3蛋白和磷酸盐缓冲液,A组与D组注射(100μg·kg-1)磷酸盐缓冲液;B组与E组注射低剂量(100μg·kg-1)GSTA3;C组与F组注射高剂量(200μg·kg-1)GSTA3。试验历时23 d。添加福美双后1、2、4、6、10和15 d采集胫骨生长板。通过Real-time qPCR检测BAG-3基因的mRNA水平,利用免疫组化来检测BAG-3蛋白表达水平。【结果】Real-time qPCR结果显示,TD损伤修复期内,相比较于基础日粮对照组,福美双对照组肉鸡胫骨生长板中BAG-3mRNA的表达水平基本都显著上调(P<0.05);相比较于福美双对照组,E和F组在...     

华山松大小蠹谷胱甘肽S-转移酶基因DaGSTe1的克隆与表达

【目的】克隆华山松大小蠹谷胱甘肽S-转移酶基因的全长序列,并对其序列特征及不同发育时期的表达规律进行研究,以揭示谷胱甘肽S-转移酶在华山松大小蠹克服寄主抗性及物质转运过程中的分子调控机制。【方法】采用RT-PCR和RACE克隆华山松大小蠹谷胱甘肽S-转酶基因全长cDNA序列,用实时荧光定量PCR检测该基因在华山松大小蠹幼虫、蛹和雌雄成虫中的表达情况。【结果】获得cDNA全长为973bp的华山松大小蠹谷胱甘肽S-转移酶基因,并命名为DaGSTe1(GenBank登录号:KJ637332),其编码一个由218个氨基酸组成的多肽,分子质量约为23.567ku,理论等电点为7.90。华山松大小蠹DaGSTe1与山松大小蠹DpGSTe1氨基酸序列的相似度最高,达94%。根据对系统发育树的分析推测,DaGSTe1属于Epsilon类谷胱甘肽S-转移酶。DaGSTe1蛋白三维结构包括一个N端结构域和一个C端结构域,其中N端结构域包括典型的4个β片层和3个α螺旋(β1α1β2α2β3β4α3),C端结构域包括5个α螺旋(α4α5α6α7α8)。DaGSTe1基因在华山松大小蠹不同发育期均有表达,其中在雄性成虫中的表达量最大,为幼虫和蛹的8倍,雌性成虫的4倍。【结论】克隆得到了华山松大小蠹谷胱甘肽S-转移酶家族基因DaGSTe1,推测该基因具有降解寄主毒素的作用,而且参与华山松大小蠹雄性特异性激素的转运过程。     

扶桑绵粉蚧谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆及不同发育阶段的表达分析

【目的】扶桑绵粉蚧是我国重要的入侵生物,其繁殖能力强,能危害棉花、扶桑、向日葵、南瓜、番茄等多种我国重要的经济作物。克隆扶桑绵粉蚧谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）基因,可为揭示扶桑绵粉蚧GSTs的生理功能提供参考。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆扶桑绵粉蚧谷胱甘肽S-转移酶基因全长,并采用生物信息学方法分析其结构特征,用实时荧光定量PCR的方法研究其各个虫态的表达谱。【结果】克隆了扶桑绵粉蚧谷胱甘肽S-转移酶基因全长序列,该基因的开放阅读框包含651 bp的片段,编码217个氨基酸。DNA编码区由4个内含子和5个外显子组成,内含子的长度分别为90,123,67和70 bp;分隔的5个外显子的长度分别为18,50,96,80和500 bp。功能域分析结果显示,该蛋白在N末端和C末端均有GST的类似结构位点。多序列比对及系统进化树构建结果表明,该蛋白属Zeta家族GSTs,将其命名为PsGSTzl。PsGSTzl mRNA在扶桑绵粉蚧的不同虫态中都有表达,在1龄幼虫中的表达量最高。【结论】成功克隆的PsGSTzl基因在不同虫态中差异表达,为进一步揭示该基因在虫体的代谢作用奠定了基础。     

黏虫谷胱甘肽S-转移酶基因对两种杀虫剂的响应

谷胱甘肽S-转移酶是昆虫体内重要解毒酶,对昆虫抗药性具有重要作用。通过转录组测序获得黏虫谷胱甘肽S-转移酶cDNA序列,命名为MsGSTe1(GenBank登录号:MH700949)。cDNA全长1 082 bp,包含一个651 bp开放阅读框,编码216个氨基酸,氨基酸等电点为4.75,分子质量为24.679 ku,具有一个GST N端结构域和一个GST C端结构域。经不同剂量氯虫苯甲酰胺处理不同时间后,MsGSTe1基因表达量均显著下调。处理24和48 h,谷胱甘肽S-转移酶活性显著提高。不同剂量高效氯氟氰菊酯处理不同时间后,MsGSTe1表达量和GST酶活性存在显著差异。处理24 h,各剂量处理MsGSTe1基因表达量均显著上调,且酶活性提高。处理48 h,与对照相比,各剂量处理酶活性显著提高,但基因表达量无显著差异,表明MsGSTe1参与黏虫对高效氯氟氰菊酯的解毒代谢。     

越橘谷胱甘肽巯基转移酶基因的克隆及表达

以越橘(Vaccinium L.)品种"北陆"为试材,采用反转录PCR克隆技术成功克隆越橘谷胱甘肽巯基转移酶基因c DNA全长序列,获得一个完整的编码区c DNA序列,长为690 bp,编码229个氨基酸,将其命名为VcGSTU1(Gen Bank登录号KT601064)。经与谷胱甘肽巯基转移酶家族其他成员的氨基酸序列比对和系统进化分析,初步确定VcGSTU1属于谷胱甘肽巯基转移酶Tau家族。生物信息学分析表明,该蛋白不稳定指数为28.80,属于稳定蛋白。预测该蛋白分子量为25.499 ku,等电位点为5.68。蛋白质序列同源比对发现其含有完整的GST-N-Tau和GST-C-Tau结构域。利用反转录PCR和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)2种方法分析谷胱甘肽巯基转移酶的表达模式,该基因在越橘的根、茎、叶芽、叶、花芽、绿果、粉果、蓝果、蓝果果皮、蓝果种子中均有表达,且在蓝果种子中相对表达量最高。     

人胎盘谷胱甘肽S-转移酶的快速分离纯化

将人胎盘组织粗匀浆、超速离心、GSH-Sepharose6B亲和纯化,再经DEAE52纤维素离子交换层析,分离纯化了人胎盘谷胱甘肽S-转移酶(GST-π).纯化的酶比活力为66.94 μmol*min-1*mg-1,纯化倍数为515倍,人GST-π的最适pH值为7.5;冷冻干燥后,在-20℃可保存1年.体外实验表明,酶在37℃保温90 min,酶活性下降80%.     

日本沼虾mu型可溶性谷胱甘肽S-转移酶的克隆与表达

利用简并引物从日本沼虾肝脏克隆mu型sGST基因cDNA核心片段获得其sGST氨基酸序列.序列分析表明日本沼虾肝脏mu型sGST基因cDNA核心序列长299 bp,编码99个氨基酸.日本沼虾sGST与南美白对虾(Litopenaeus vannamei)、小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、肩突硬蜱(Ixodes scapularis)、扇头蜱(Rhipicephalus appendiculatus)、热带爪蟾(Xenopus tropicalis)、微小牛蜱(Rhipicephalus microplus)和太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)的mu型sGST基因核苷酸同源性为60 ％左右,表明所克隆的日本沼虾sGST亦属于mu型sGST.通过对日本沼虾活体浸泡MC-LR,发现微囊藻毒素对日本沼虾肝脏mu型sGST基因表达没有显著的诱导作用.     

藏药喜马拉雅紫茉莉谷胱甘肽-S-转移酶基因的克隆及表达分析

谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase,GST)是参与谷胱甘肽催化反应的关键酶,在生物解毒、应激耐受和次级代谢等多个方面发挥生物学功能.本研究以藏药喜马拉雅紫茉莉为材料,基于前期转录组数据,从cDNA中克隆出谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因MhGSTL3,该基因开放阅读框(ORF)全...     

小麦Ra3基因编码区的克隆、原核表达及纯化

【目的】克隆小麦ramosa3(Ra3)基因完整编码区,利用原核表达系统表达并纯化获得重组的小麦RAMOSA3(RA3)。【方法】利用RT-PCR技术,从普通小麦"中国春"幼穗中扩增小麦Ra3,将其重组到原核表达载体pET-41a,并在T7Express competentE.coli菌株中进行诱导表达;利用Ni-NTA亲和层析柱纯化获得重组蛋白,并通过Western印迹技术对其进行鉴定。【结果】获得了长度为1080bp的cDNA片段,该片段包含小麦Ra3完整编码区,编码产物长度为360个氨基酸残基,属于TPP酶家族成员;SDS-PAGE结果显示,菌体总蛋白中出现约66ku的预期条带,其表达量占总蛋白的44.6%;抽提液中加入体积分数0.3%的Triton X-100,可显著提高重组蛋白的溶解度;纯化后的重组蛋白呈单点纯,Western印迹结果进一步确证其为目标蛋白。【结论】利用原核系统高效表达并纯化获得了重组的小麦RA3。     

桂糖11号Rubisco基因克隆、原核表达及纯化

[目的]通过原核表达及纯化获得甘蔗1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的大、小亚基融合蛋白,为获得符合抗体制备条件的高纯度融合蛋白提供技术支持.[方法]以甘蔗品种桂糖11号(GT11)+1叶为材料,根据NCBI公布的甘蔗Rubisco大、小亚基基因(rbcL和rbcS)的编码域序列(CDS)设计特异性引物,PCR扩增rbcL和rbcS基因的CDS,然后连接至原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒后转入原核细胞(大肠杆菌Rosetta)中诱导表达,用镍亲和层析柱对融合蛋白进行纯化,并比较分析桂糖11号与其他甘蔗品种在rbcL和rbcS基因的CDS及编码蛋白序列方面的差异.[结果]rbcL和rbcS基因的CDS长度分别为1431和510bp,其中桂糖11号rbcL基因的CDS与Saccharumhybrid cultivar SP80-3280(GenBank登录号AE009947)、Saccharum hybrid cultivar Q155(GenBank登录号KU214867)的一致,桂糖11号rbcS基因的CDS与Saccharum hybrid cultivar GT28(GenBank登录号JN591757)的存在7个碱基差异,但仅有2个氨基酸发生错义突变.RbcL和RbcS融合蛋白以包涵体形式存在原核细胞中,用镍离子亲和层析纯化及超滤浓缩后其浓度均在1.0 mg/mL以上.[结论]从桂糖11号成功克隆Rubisco大亚基和小亚基基因的CDS,大亚基基因的CDS比小亚基的保守性更高,且均可在原核细胞中高度表达,经纯化浓缩获得的高纯度融合蛋白可用于制备Rubisco单克隆抗体.     

龙眼TFL1基因的克隆与表达

以‘红核子’龙眼叶芽为材料,克隆了龙眼TFL1-1和TFL1-2基因的c DNA序列和基因组DNA序列,进行序列分析,并对这两个基因在花芽分化过程中的表达进行了研究.结果显示,龙眼TFL1-1基因c DNA开放阅读框共519 bp,编码173个氨基酸,TFL1-2基因c DNA开放阅读框共525 bp,编码175个氨基酸;两个基因DNA序列均含有4个外显子和3个内含子;序列分析和系统进化树分析表明,龙眼TFL1-1和TFL1-2都是TFL1同源基因,龙眼TFL1-1基因与柑橘、梨的TFL1基因亲缘关系较近;基因表达结果表明,龙眼TFL1-1和TFL1-2基因的功能都与抑制花芽分化有关.     

拟南芥AFP4的克隆、原核表达和纯化及其与ABI5的互作

拟南芥ABI5相互作用蛋白AFP4(ABI five binding protein 4)是植物中的一个小分子蛋白,其表达特性与ABI5相似,受ABA诱导。以拟南芥Arabidopsis thaliana L. (Heyn) cv. Columbia为材料,通过PCR扩增了AFP4基因的完整编码序列。扩增片段插入到原核表达载体pET-32a(+)的多克隆位点EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点之间和酵母双杂交载体pGBKT7的多克隆位点EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点之间。将ABI5基因的编码序列插入到酵母双杂交载体pGADT7的多克隆位点EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点之间。重组质粒测序结果表明,所克隆的AFP4和ABI5编码区序列分别与NCBI数据库收录的AFP4基因(GenBank登录号NM_111081.2)和ABI5基因(GenBank登录号NM_129185.3)完全一致。重组原核表达载体含有AFP4片段的重组融合蛋白的理论分子量为53.4 ku。将重组质粒转化至大肠埃希菌表达菌株BL21 Star (DE3)中诱导表达,并经Ni-NTA亲和层析柱分离纯化、SDS-PAGE分析和Western blot鉴定。将含有AFP4和ABI5的酵母双杂交重组质粒共同转化酿酒酵母AH109中进行酵母双杂交。结果表明,重组融合蛋白在大肠埃希菌E. coli BL21 Star (DE3)中表达的适宜条件为:IPTG浓度为0.4 mmol·L^-1、25 ℃下诱导表达6 h。在上述条件下,重组融合蛋白占细胞破碎后上清液总蛋白的41.6%。经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,AFP4融合蛋白在SDS-PAGE分析时呈现单一条带。该条带经过抗6xHis标签肽的抗体分析,呈阳性。该条带经酵母双杂交分析结果表明,AFP4和ABI5在酵母细胞中可以相互作用。     

人促性腺激素释放激素及其转运肽基因的克隆、表达与纯化

研究根据GenBank中已发表的人GnRH2基因mRNA序列以及转运肽基因核苷酸序列,借助Oli-go4.1设计了一对寡核苷酸引物,以引物3'末端的短互补序列退火形成小段双链,从而互为模板和引物,通过引导合成长达90bp的目的序列GnRH/TRS。将其克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒pYC1,经酶切鉴定筛选出阳性克隆pYC1,进一步的序列分析确认其中GnRH/TRS序列的正确性。pYC1经BamHI和EcoRI酶切得到GnRH/TRS片段,然后将此片段克隆到表达载体pGEX-6p-1上,构建重组质粒pYC2。经酶切鉴定筛选出阳性克隆pYC2,并转化到大肠杆菌BL21(ED3)plyS实现原核表达。IPTG诱导后成功表达出与预期大小相符的约28ku的融合蛋白,光密度扫描对表达产物进行初步定量,表达产物约占菌体总蛋白的33.3%,表达产物经GlutathioneSepharose4B层析纯化后,得到了纯度较高的GST-GnRH/TRS融合蛋白,为进一步科研和实际应用奠定基础。     

泛素样小蛋白4(SUMO4)的克隆、原核表达、纯化及鉴定

【目的】为人类泛素样小蛋白4(SUMO4)多克隆抗体制备和疾病研究奠定基础。【方法】根据Gen-Bank提供的核酸序列,设计7条单链DNA,采用重叠延伸PCR方法,合成SUMO4基因编码区。基因片段经限制性内切酶双酶切,构建到表达载体pGEX-4T-1中。酶切、测序鉴定后,将重组子转染BL21 RIL菌株,表达及纯化融合蛋白。用SDS-PAGE和Western blot检测纯化效果,鉴定表达产物。【结果】成功合成了长度约为280 bp的SUMO4基因,经双酶切鉴定,SUMO4原核表达载体构建成功,插入片段测序正确。GST-SUMO4融合蛋白在终浓度1mmol/L IPTG、28℃诱导5 h后产量达到高峰,SDS-PAGE证实表达产物以可溶形式存在,分子量约为37 ku,GST亲和层析的纯化效果良好,Western blot验证融合蛋白分子量与预期值相符。【结论】SUMO4蛋白在大肠杆菌中高效表达,并以可溶性蛋白形式存在。     

氟苯尼考对肉鸡空肠黏膜的完整性及免疫相关基因表达的影响

研究空肠免疫相关指标及绒毛结构的变化在氟苯尼考致肉鸡腹泻中的作用。40羽1日龄肉鸡适应性饲养7 d后,随机分为对照组、氟苯尼考组（饮水添加100 mg·(kg?d)^-1氟苯尼考至35日龄）,35日龄检测体重、脾脏与胸腺指数,取空肠组织以HE染色,观察组织切片并测量绒毛长度、隐窝深度且计算绒隐比,荧光定量PCR检测空肠TLR4、MyD88、NF-κB和TNF-α基因表达量。结果表明,与对照组相比,氟苯尼考组肉鸡空肠绒毛长度、绒隐比极显著下降（P＜0.01）,隐窝深度极显著升高（P＜0.01）;体重、脾脏指数与胸腺指数极显著下降（P＜0.01）;TLR4、MyD88、NF-κB与TNF-α mRNA相对表达量极显著升高（P＜0.01）。空肠绒毛结构功能改变及免疫相关指标异常表达参与了氟苯尼考致肉鸡腹泻的发生发展。     

2个水稻PLT基因启动子的克隆及其表达分析

为研究水稻中PLT基因的表达及功能,利用同源序列分析,在水稻基因数据库中检索到2个与拟南芥PLT基因高度同源的基因序列,命名为OsPLT7和OsPLT11。根据进一步预测的PLT启动子序列设计引物,以水稻品种中花11的基因组DNA为模板,用PCR方法扩增得到PLT7、PLT11的启动子片段,克隆至含有报告基因的表达载体上并转化水稻。通过GUS染色观察T1代转基因阳性植株,发现OsPLT7和OsPLT11在水稻根部干细胞小生境和中柱部位表达,表达模式类似于其同源基因在拟南芥中的表达谱。     

小麦TaTDR-Like基因的克隆及表达分析

【目的】克隆小麦绒毡层退化基因（Tapetum degeneration retardation,TaTDR-Like）,研究其组织表达及不同育性材料间花药不同发育时期的时空表达模式,为深入揭示小麦花药异常发育的分子机制打下理论基础。【方法】以普通小麦品种西农1376（MF-XN1376）为材料,通过PCR扩增克隆得到TaTDR-Like基因的3个同源拷贝,利用生物信息学分析TaTDR-Like蛋白特性及TaTDR-Like基因启动子顺式作用元件,利用实时荧光定量PCR检测TaTDR-Like基因的组织表达情况及在可育、不育材料花药不同时期中的时空表达模式,利用酵母双杂交技术进行自激活检测,并构建植物融合表达载体35S-TaTDRLD-EGFP,通过农杆菌介导转入烟草叶片表皮细胞,观察TaTDRL-D蛋白亚细胞定位情况。【结果】成功克隆小麦TaTDR-Like基因,发现该基因存在3个同源拷贝即TaTDRL-A、TaTDRL-B和TaTDRL-D,分别编码550、553、557个氨基酸,其蛋白分子量分别为58.50、58.90和59.21 kD,等电点（pI）分别为4.77、4.66和4.63。TaTDR-Like蛋白均在C端有1个bHLH保守结构域,其中TaTDRL-A与TaTDRL-B的保守结构域相似度达100%,与TaTDRL-D的保守结构域相似度为96%,TaTDRL-D与OsTDR、AtAMS保守结构域相似度分别为98%和88%;系统发育进化树表明TaTDR-Like蛋白与大麦（KAE8787147.1）、二穗短柄草TDR（XP_014756384）、水稻TDR（Os02g0120500）和拟南芥AMS（AT2G16910.1）的进化关系较密切;启动子分析表明TaTDR-Like基因启动子处含有较多光响应元件、非生物应激反应、激素响应元件等顺式作用元件;组织特异性表达分析显示TaTDRL-D在花药中的表达量最高,而TaTDRL-A和TaTDRL-B在幼穗表达量较高;对花药发育不同时期表达分析显示TaTDRL-D在花药发育单核早期表达量最高,之后逐渐降低,单核晚期到三核期不育材料（CMS-XN1376）表达量均高于可育材料（MF-XN1376）;自激活检测结果表明TaTDRL-D具有转录激活活性;亚细胞定位显示TaTDRL-D蛋白定位于细胞核。【结论】TaTDRL-D基因可能参与小麦花药发育,负调控花药育性。     

滇牡丹中3个类查尔酮合成酶基因的克隆与表达

从开黄花的滇牡丹转录组中分离了3个CHS基因,利用生物信息学预测其基因功能,并比较不同花发育时期CHS基因的表达量。结果显示:3个CHS基因的cDNA全长分别为1 173、1 185、1 128 bp,依次命名为PdCHS1(GenBank登录号MK516264)、PdCHS2(GenBank登录号MK516265)和PdCHS3(GenBank登录号MK516266),分别编码390、394和375个氨基酸;这3个CHS基因编码的蛋白均为无信号肽的非分泌蛋白,均含查尔酮合成酶活性位点基序(G/A) FGPG。聚类结果显示,滇牡丹中的3个CHS蛋白归属于不同分支。基因表达结果显示,PdCHS1基因在花蕾期和花蕊中表达量较高,PdCHS2基因在末花期和初花期表达量较高,PdCHS3基因在末花期和花蕾期表达量较高。这3个CHS基因分别参与不同次生代谢产物的合成,推测PdCHS1参与柚皮素查尔酮,PdCHS2参与芪类化合物,PdCHS3参与聚酮类化合物的生物合成。