番茄花叶病毒移动蛋白基因转化烟草及在转基因烟草中的表达

从提纯病毒抽提基因组RNA，并通过RT－PCR扩增番茄花叶病毒（ToMV)移动蛋白（MP）基因。经克隆测序后插入植物表达载体PBI121的35S启动子下游，通过PCR及酶切筛选分别获取正、反向插入的克隆，通过三亲交配导入农杆菌，叶盘转化法转化普通烟草。卡那霉素筛选获得一系列抗性小苗，对其进行PCR检测，Southern、Northern点杂交，Western-blot检测，获得能正义、反义表达ToMV MP基因的转基因植株。     

烟草花叶病毒蚕豆分离物移动蛋白基因克隆及序列分析

根据已报道的ＴＭＶ Ｕ１株系（ＴＭＶ－Ｕ１）的序列设计了特异性引物,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从烟 草花叶病毒蚕豆分离物（ＴＭＶ－Ｂ）上扩增移动蛋白（ＭＰ）基因及其邻近序列。将此ｃＤＮＡ片段克隆于 ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ ＳＫ质粒上,进行测序分析。结果表明：ＭＰ基因由８０７个核苷酸组成,编码２６８个氨基酸。与 ＴＭＶ－Ｕ１的ＭＰ基因序列比较,核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性分别为９９．０１％和 ９８．８９％。与ＴＭＶ－Ｙｕ的ＭＰ基因序列比较,同源性分别为９８．１４％和９８．８９％。说明ＴＭＶ的ＭＰ基因 在不同株系中是非常保守的。     

烟草花叶病毒蚕豆分离物移动蛋白基因克隆及序列分析

根据已报道的ＴＭＶＵ１株系（ＴＭＶ－Ｕ１）的序列设计了特异性引物,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从烟草花叶病毒蚕豆分离物（ＴＭＶ－Ｂ）上扩增移动蛋白（ＭＰ＿基因及其邻近序列,将比ＣＤＮＡ片段克隆于ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔＳＫ质粒上,进行测序分析,结果表明ＭＰ基因由８０７个核苷酸组成,编码２６８个氨基酸,与ＴＭＶ－Ｕ１的ＭＰ基因序列比较,核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性的９９．０１和９８．８９％,与ＴＭＶ     

烟草花叶病毒P54基因的原核表达与蛋白纯化

[目的] 烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)编码的与复制相关通读P183基因中,编码一个P54基因,其功能及其作用分子机制还鲜见报道.为获得P54蛋白纯化样品开展本研究,以期为P54蛋白的功能及其作用分子机制研究奠定基础.[方法] 采用RT-PCR技术,从感染TMV的三生烟(Nicotia...     

广东烟草花叶病毒移动蛋白基因的cDNA克隆和酶切鉴定

根据已报道的烟草花叶病毒移动蛋白基因序列,设计合成一对特异性引物。以广东ＴＭＶ株系ＲＮＡ为模板,用ＡＭＶ反转录酶反转录合成ｃＤＮＡ第一链;在复性温度５１℃条件下进行ＰＣＲ扩增,获得了一条０．８Ｋｂ的特异扩增产物,与已发表的ＴＭＶＭＰ基因编码区８０３ｂｐ大小相近;并将之克隆于ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ（＋）质粒。限制性内切酶酶切分析表明,本研究筛选到的是含ＴＭＶＭＰｃＤＮＡ的正向插入组质粒。     

转基因烟草蛋白表达系统的研究进展

随着分子生物学和基因工程理论等技术的迅速发展,转基因烟草可以表达越来越多的外源蛋白。就转基因烟草作为蛋白表达系统的基本方法、研究状况及发展前景进行概述。     

烟草花叶病毒运动蛋白的表达及特异性抗体制备

从烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)感染的发病烟草叶片中提取总RNA,通过RT-PCR扩增得到其运动蛋白基因,将扩增产物克隆到pMD18-T载体上.DNA序列分析表明,所得运动蛋白基因全长为807 bp,与已报道的TMV-U1株系核苷酸和氨基酸同源性均为100%.将目的基因亚克隆到原核表达载体pET-29a上,并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导4 h后蛋白表达量达到最大,超声波显示所得融合蛋白以不可溶形式存在.SDS-PAGA检测蛋白表达情况,表达产物与目的蛋白大小一致,割胶免疫注射家兔得到抗体,ELISA测定效价为25600,Western-blot检测证明在烟草叶片被侵染早期MP得到表达,且抗体特异性良好.     

抗烟草花叶病毒(TMV)转基因烟草的初步选育

 病毒病是云南烤烟生产上的重要病害,目前尚无有效的防治手段,本研究试图采用植物基因工程技术,将TMV54KD蛋白基因转人云南烤烟栽培品种,获得抗TMV的转基因植株,减少由TMV危害造成的重大经济损失,用携带植物抗病毒基因表达载体的根癌农杆菌LBA4404菌株转化云南烤烟栽培品种红花大金元,获得了大量转基因植株,戴体质粒上含有卡那霉素抗性标记基因(NPTII)和CaMV35s启动子控制的烟草花叶病毒(TMV) 54KD蛋白基因,烟草叶片与携带载体质粒的根癌农杆菌共培养后,将其转移到含50μg/ml卡那霉素(Km)的MS+2.0mg/m16-BA+0.1mg/LNAA培养基上培养筛选,2-3周后分化出芽,切下小芽转移到含50μg/ml卡那霉素的MS+0.2mg/ml NAA的培养上进一步培养基筛选并使转化体生根,再对生根植株叶片进行Km抗性鉴定,结果表明,Km抗性标记基因(NPTII)在烤烟植株中已得以表达,间接证明TMV54KD蛋白基因已整合到烤烟植株的基因组中,抗性鉴定结果表明,转基因植株对TMV摩擦接种表现出明显抗性,选择抗性植株,单株收种子,以对其后代抗性的遗传稳定性研究.     

拟南芥ATLP-3基因在转基因烟草中的整合和表达

将拟南芥ＡＴＬＰ－３基因从质粒ｐＵＣＴＬ亚克隆到植物表达载体ｐＢＩ１２１中,得到了质粒命名为ｐＢＩＴＬ。被亚克隆到重组质粒ｐＢＩＴＬ的ＡＴＬＰ－３基因通过农杆菌ＬＢＡ４４０４介导法导入烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｂａｃｃｏ Ｌ．ｖａｒ Ｇｅｘｉｎ Ｎｏ．１）。通过卡那霉素抗性筛选,得到１９株再生烟划植株。ＰＣＲ（用根据ＣａＭＶ３５ｓ启动子和ＮＯＳ终止子序列合成的引物）分析表明,ＡＴＬＰ－基因是在     

云南烟草花叶病毒外壳蛋白基因的分离克隆及序列分析

从云南弥勒县采集典型病株接种蔓陀萝植斑分离,经免疫电镜（ＩＥＭ）鉴定为ＴＭＶ;在烤烟品种红花大金元上以ＴＭＶ普通株作对照进行致病率测定,确定为强毒株系,以烟草花叶病毒（ＴＭＶ）云南强毒株系ＲＮＡ为模板,根据国外研究结果,自行设计,合成寡核苷酸为引物,通过ＰＴ－ＰＣＲ体外扩增,得到约５００ｂｐ的ＤＮＡ片段,将其克隆到Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５０上,并进行了序列分析。分析表明,该基因含４７７个核苷酸,编码１５     

PtWRKY14 基因转化烟草及对 TMV 的抗性影响研究

PtWRKY14 是从毛白杨中获得的WRKY 基因,为研究PtWRKY14 基因对植物抗病性的影响,构建了毛 白杨PtWRKY14 基因的植物表达载体pBI121-W14,通过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草,PCR 与Southern 杂交 进行转基因烟草鉴定。对获得的转基因烟草植株进行烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV）的接种试验,结果表 明PtWRKY14 基因的转化使烟草对TMV 的抗性增强。荧光定量PCR 检测结果表明,TMV 接种后,转基因烟草中 PtWRKY14 的表达量显著上调,同时转基因烟草中超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD）、过氧化物酶(Peroxidase,POD）、过氧化氢酶(Catalase,CAT）的表达量均高于对照组。因此,PtWRKY14 可能通过上调SOD、POD、 CAT 的表达从而增强植物抗病性。     

烟草蚀纹病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

根据烟草蚀纹病毒(TEV)CP序列设计合成上下游引物,利用RT-PCR方法获得了TEV CP基因,大小为789 bp。将TEV CP基因克隆到pM D 18-T S im p le V ector,经E coRⅠ/S acⅠ双酶切得到目的片段,并将其定向插入到pET 30a载体中构建了原核表达载体pET 30-TEV CP,重组质粒经E coRⅠ和S acⅠ双酶切鉴定及基因测序验证正确后,转化大肠杆菌BL 21,用IPTG进行诱导表达。结果表明,TEV CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,分子量约为37 ku。以表达产物为抗原免疫家兔,制备了特异性抗血清,其效价为1/1 204。W estern b lot检测结果表明,制备的抗血清可用于检测田间的发病植株。     

金针菇中一种抗病毒蛋白的纯化及其抗烟草花叶病毒特性

通过DEAE-SepharoseFF离子交换层析、Superdex75凝胶层析和高效液相色谱,从金针菇中获得抗烟草花叶病毒蛋白Zb,经SDS-PAGE确定该蛋白相对分子质量为30ku.采用半叶法在心叶烟上检测抗烟草花叶病毒活性,发现该蛋白抑制中质量浓度为4.4μg·mL-1.     

毛白杨TIR-NBS-LRR基因转化烟草的研究

该文采用农杆菌介导法将从毛白杨中克隆得到的TIR-NBS-LRR抗病基因（PtDRG01）导入烟草中,经抗生素筛选和PCR分子检测,获得了一批阳性转化植株。进而对这些阳性转化植株进行烟草花叶病毒接种实验,从表型观察结果发现,在接种病毒1周和6周后,转基因烟草株系TG-11的发病程度明显低于非转基因烟草。荧光定量分析结果显示,转基因烟草株系TG-11叶片中的烟草花叶病毒(TMV)数量显著低于非转基因植株,且该转基因株系中的PtDRG01基因转录水平显著高于非转基因植株。这些结果表明,毛白杨PtDRG01基因具有明显的抗病功能,其高效表达能够显著提高烟草的抗TMV能力。该文通过对烟草的遗传转化与病毒接种实验,鉴定了PtDRG01基因的功能,可为其他TIR-NBS-LRR基因的功能鉴定提供参考。      

外植体预培养时间对番茄外源基因转化的影响

以番茄叶片为外植体,含有烟草花叶病毒外壳蛋白(TMV-rep)基因的工程农杆菌LBA4404为外源基因转化的双元载体,通过农杆菌叶盘法将外源基因转入番茄,转化前将番茄叶片进行不同时间预培养,研究外植体预培养时间对外源基因转化率的影响.结果表明,最适宜的预培养时间为32～48 h,番茄外植体转化率均达到70％以上.     

云南香料烟花叶病病原分离物的鉴定

从云南保山采集具典型花叶症状的香料烟病株，用病株汁液接种心叶烟，进行单斑分离纯化。电子显微镜观察到杆状病毒粒体（18nm×300nm），三抗体夹心酶联免疫吸附（TAS-EUSA）检测与烟草花叶病毒（Tobaccomma／cv／nu，TMV）抗血清呈阳性反应；用TMV外壳蛋白（CP）基因特异性引物进行RT-PCR扩增，克隆，经序列测定分析，侵染云南保山香料烟的病原分离物CP基因含480个核苷酸，编码159个氨基酸，通过核苷酸和氨基酸序列分析，与TMV-152的相似性最高，核苷酸序列的相似性为98．8％，推导编码氨基酸相似性达到100．0％，亲缘关系最近。根据这些特性，引起云南保山香料烟花叶病的病原分离物是烟草花叶病毒的一个分离物。     

烟草抗TMVN基因及其在分子标记辅助育种中的应用

N基因是控制烟草花叶病毒发生的最有效基因。本文详细阐述了烟草花叶病毒的发现、基因组结构及致病机制,并对N基因的基因组结构、表达、抗TMV机理和N基因的分子标记方法做了详细介绍,最后对该技术的发展前景提出了展望。     

烟草质膜ATPase4基因的克隆、表达载体构建及表达分析

植物细胞质膜ATPase基因表达可以引起细胞向外界环境释放H⁺,从而形成细胞膜内外的电化学式梯度,促进各种离子的运输,抵抗外界的各种胁迫。为研究ATPase基因在烟草中的非生物胁迫调控机制及相关生物学功能,本研究采用同源克隆的方法,从普通烟草K326中克隆到了1个ATPase4同源性基因,成功构建ATPase4-pcambia1300过表达载体。利用生物信息学分析ATPase4基因编码蛋白的疏水性、理化性质、蛋白结构预测、信号肽预测、磷酸位点预测及同源性分析,结果显示,该基因与绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)质膜ATPase4具有99%同源性,故命名为质膜ATPase4基因。利用荧光定量PCR(qRT-PCR)测定该基因在烟草组织中的表达量及其在非生物逆境胁迫中的表达模式,结果表明,该基因在根中表达量最高,且能快速响应低钾、高盐、PEG和冷胁迫诱导,说明ATPase4基因在烟草逆境胁迫中发挥着重要的调节作用。