一种快速的酸奶质量跟踪监测检验新方法

分析酸奶中的菌种组成是酸奶质量控制的重要指标。本文用PCR—DGGE（denaturing gradient gel electrophotesis，变性梯度凝胶电泳）指纹图谱技术对市售某品牌酸奶在1个月内进行了动态监测。共收集了6个生产批次的18个酸奶样品，通过建立16S rDNA V3区PCR—DGGE分析、DGGE图谱条带割胶回收测序等一套完整的检测评价方法．结合常规分离培养方法．对样品微生物组成及其稳定性进行跟踪监测。结果显示。所有供试样品在整个动态监测期内DGGE指纹图谱都出现2条带．显示。其微生物组成比较稳定．割胶回收测序结果表明其微生物组成与厂家标注完全一致．分别为Lactobacillus delbrueckii subsp．balgaricus（保加利亚乳杆菌）和Streptococcus thermophilus（嗜热链球菌）。分离计数结果表明前者比后者低3个数量级．二者的DGGE条带亮度也有显著差别。本研究用菌种组成及其稳定性两个指标对酸奶样品质量进行评价，建立了DGGE评价方法，结果表明。该技术可以作为酸奶质量控制和动态监测的快速简便的新方法。     

生鲜乳中大肠杆菌的分离及其ERIC-PCR指纹分析

通过了解生鲜乳收购站的生鲜乳大肠杆菌污染情况及不同菌株间的遗传相似性,为日常生产中实时控制生鲜乳大肠杆菌提供了有效技术手段。采用国家规定的标准方法检验从生鲜乳分离的大肠杆菌,分析分离细菌的ERIC-PCR DNA指纹图谱。共采集115份样品,从23份中分离到大肠杆菌25株。ERIC-PCR DNA指纹图谱分析,25株分离菌遗传相似性在56%~100%之间。结果显示,生鲜乳中存在大肠杆菌污染,同一个生鲜乳收购站大肠杆菌的基因型可有不同,不同生鲜乳收购站之间也存在相同基因型大肠杆菌污染。     

利用ERIC-PCR和PCR-DGGE技术分析喂服枯草芽孢杆菌肉鸡肠道菌群的多样性

本文旨在采用ERIC-PCR和PCR-DGGE方法研究肉鸡喂服枯草芽孢杆菌后肠道菌群的多样性.选用15羽28日龄肉鸡,按2mL/kg BW喂服枯草芽孢杆菌悬液(10°CFU/mL).每天2次,连续3d,34日龄时,利用ERIC-PCR和PCR-DGGE方法分析肠道菌群的多样性,并对DGGE条带进行回收、测序.结果表明,肉鸡口服枯草芽孢杆菌后各肠段的条带数显著多于对照组(P<0.05或P<0.01),2种方法检测结果相似,2组之间肠道总菌群相似性为53.2%;电泳指纹图谱和统计条带数量分析,PCR-DGGE明显优于ERIC-PCR;回收条带以乳杆菌属细菌为主.结果提示,34日龄肉鸡肠道菌群具有一定的稳定性,以乳杆菌为主要菌群,饲喂芽孢杆菌后能提高肉鸡肠道菌群的丰度和种群密度;PCR-DGGE检测方法明显优于ERIC-PCR.     

2009～2010年华南地区副猪嗜血杆菌分离株ERIC-PCR指纹图谱的鉴定和分析

本试验采用肠杆菌基因间重复一致序列多态性聚合酶链式反应(ERIC-PCR)对2009~2010年分离自华南地区的41株副猪嗜血杆菌野生菌株及15株参考菌株进行了指纹图谱的鉴定。利用BioNumerics 5.1软件对所有菌株的ERIC-PCR指纹图谱进行分析,结果显示,15株具有不同血清型的参考菌株均具有不同的指纹图谱;41株华南地区副猪嗜血杆菌野生分离株则具有26个不同的指纹图谱,该方法对所有56株副猪嗜血杆菌的鉴别率为0.984。由此可见,ERIC-PCR分型方法具有较好种间的鉴别能力,可作为副猪嗜血杆菌病流行病学研究中的一种有效的辅助分子手段。     

大熊猫粪便菌群ERIC-PCR指纹图谱的分析及优势菌群的鉴定

探讨1只野生大熊猫和不同年龄段圈养大熊猫粪便菌群的多样性和相似性,并鉴定野生大熊猫圈养之后,其粪便中的优势菌群.对来自3个年龄段9只(3只亚成体、3只成年体、3只老年体)圈养大熊猫及1只野生大熊猫圈养前、后的11份粪便细菌的DNA进行ERIC-PCR指纹图谱分析,并利用16S rRNA基因序列分析对优势菌条带进行鉴定.结果显示:该只野生大熊猫粪便菌群多样性比圈养大熊猫丰富;圈养大熊猫粪便菌群多样性:成年体＞亚成体＞老年体;16s rRNA和ERIC-PCR指纹图谱优势条带鉴定的优势菌结果有差异性.结果表明:大熊猫的肠道菌群多样性易受生长环境、年龄因素的影响;其次, 不同年龄段的圈养大熊猫,其肠道菌群的相似性与年龄因素不相关;利用ERIC-PCR指纹图谱优势条带鉴定优势菌的方法有一定的局限性.     

荣昌、长白、杜洛克猪肠道微生物ERIC-PCR-DGGE指纹图谱比较分析

为了解荣昌猪与外种猪肠道微生物间的差异,通过提取荣昌、长白、杜洛克猪不同生长阶段粪样总DNA,进行ERIC-PCR扩增及其DGGE指纹图谱的比较分析.结果表明:ERIC-PCR-DGGE技术是一种有效的分子微生态分析技术,它能较好地反映猪肠道微生物群落构成.在哺乳、断奶和经产三个阶段的指纹图谱中,不同品种猪粪样微生物种...     

采用PCR-DGGE技术分析瘤胃菌群在不同纤维素富集条件下的多样性

本试验旨在采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术分析瘤胃菌群在不同纤维素富集条件下的多样性。试验采用羧甲基纤维素(CMC)培养基、蛋白胨纤维素(PCS)培养基、J培养基和K培养基分别在37和50℃条件下培养瘤胃内容物,使用PCR-DGGE技术、DGGE图谱共性及特异性条带的克隆和测序、聚类分析和主成分分析(PCA)几种方法分析瘤胃菌群多样性。结果表明:37℃条件下,不同培养基的DGGE图谱差异较大,J培养基和PCS培养基间的相似性系数为0.77;J培养基和CMC培养基间的相似性系数仅为0.76。50℃条件下不同培养基的DGGE图谱相似性较高,J培养基和PCS培养基间的相似性系数为0.78;而CMC培养基和PCS培养基间的相似性系数高达0.84。DGGE图谱中共性条带属于解没食子酸链球菌和解脲芽孢杆菌2个菌属,是瘤胃中的优势菌群;而主要的特异性条带属于解没食子酸链球菌、摩氏假单胞菌、产碱杆菌和未培养毛螺旋菌4个菌属。结果提示,不同纤维素富集培养基和温度对瘤胃菌群的多样性有一定程度上的影响。     

中国东南部地区副猪嗜血杆菌分离株ERIC-PCR指纹图谱分析

采用肠杆菌基因间重复一致序列PCR方法,在对15种副猪嗜血杆菌血清型参考株鉴定获得15种不同ERIC-PCR指纹的基础上,对分离自中国东南部发生Glasser's病的不同猪场的111株副猪嗜血杆茵进行了指纹鉴定.结果显示:111株分离株显示出23种指纹图谱,前3种最流行的指纹图谱为ERIC-PCR X X(20/111),X X ⅢⅠ(9/111)和Ⅳ(8/111).且在111株分离株中,来自不同地区的分离株分别表现出不同种类的指纹图谱.该试验表明,ERIC-PCR方法可适用于对某一地区的副猪嗜血杆菌进行分子流行病学的研究和基因型的鉴定;试验结果还揭示了副猪嗜血杆茵在中国东南部地区已广泛存在并具有多样的基因型.     

应用PCR-DGGE分析肉鸡呼吸道中细菌多样性

从不同养殖时期的肉鸡呼吸道中提取微生物基因组总DNA,以细菌16S rDNA基因通用引物341F/534R进行V3高变异区域PCR扩增,长约200 bp的PCR产物经变性梯度凝胶电泳(DGGE)分离,获得微生物群落的特征DNA指纹图谱。通过DGGE图谱的半定量分析以及对条带的测序鉴定,发现样品的优势菌群明显。结果表明,PCR-DGGE是研究动物呼吸道微生物多样性的可行方法。     

HPLC指纹图谱法评价市售僵蚕的品质

为了科学评价僵蚕的品质,建立了僵蚕的高效液相色谱指纹图谱分析方法,并对市售13个批次僵蚕药材的指纹图谱进行比较分析。结果发现这13批僵蚕的HPLC指纹图谱上共有11个明显的色谱峰,通过与标准品比对确定其中4个色谱峰分别为芦丁、紫云英苷、槲皮素和山奈酚; 13个批次僵蚕药材的指纹图谱具有显著差异,仅有5个共有特征峰,而且共有峰峰面积相差较大,相对标准偏差(RSD)分布在43. 31%~90. 62%之间。以共有模式R为基准,对市售僵蚕药材特征指纹图谱进行相似度计算,结果显示13个样品中相似度大于0. 90的有8个样品,相似度在0. 85~0. 90之间的有1个样品,相似度低于0. 85的有4个样品。结果表明,建立的僵蚕HPLC指纹图谱专属性强、稳定性好,能较真实、全面地反映僵蚕的特征;所测市售僵蚕药材品质参差不齐,在化学成分组成和含量上均有显著差异。     

广西地区副猪嗜血杆菌ERIC-PCR指纹图谱分型研究

为探讨肠道细菌基因间重复序列(ERIC)的聚合酶链反应(PCR)技术用于副猪嗜血杆菌基因分型的可行性,对分离自广西地区不同猪场的22株副猪嗜血杆菌进行ERIC-PCR指纹图谱分型研究.结果发现,22株分离株显示出12种指纹图谱,可以区分无法进行血清分型的菌株.表明ERIC-PCR可适用于对副猪嗜血杆菌进行分子流行病学调...     

不同产地与不同生产方式的丹参药材质量相似性评价研究

本研究旨在明确不同产地、不同生产方式丹参药材的质量相似性,建立丹参药材主成分特征图谱以及色差指纹图谱,形成快速、科学的立体质量评价方法,并为丹参临床使用及不同地域药材生产提供数据参考。运用HPLC建立丹参药材指纹特征图谱质量分析方法,通过中药指纹图谱相似度评价系统和ModuleLab Chroman软件对丹参药材质量进行相似性评价及计量分析;采用主成分分析（PCA）、K最近邻法（KNN）等算法及可视化方法对样品丹参药材的色度值总体分布情况进行分析。结果显示,不同产地丹参药材共有11个共有峰,合成特征图谱相似度范围为0.894～0.999,表明不同产地样品化学成分差异较小,各产地丹参药材具有较好的相似度,但根据成分PCA得分载荷图与聚类分析显示,主成分贡献率为85.93%,其中丹酚酸B成分有较高的贡献率,说明丹酚酸B是造成不同产地差异的主要物质;主成分测定显示不同产地与不同生产方式的丹参药材总丹参酮类成分也具有较大差异,总丹参酮含量为1.358～7.515 mg/g,丹酚酸B含量为4.574～112.670 mg/g;药材颜色差异分析结果表明,不同产区丹参药材颜色具有显著差异,特别是广西...     

应用PCR-DGGE分析鸭场土壤细菌群落结构

为了解贵州省三穗县8个养鸭场环境土壤中细菌群落结构多样性概况,本试验采用试剂盒提取土壤样品细菌总DNA,PCR扩增细菌16S rDNA V3可变区,并通过变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术对扩增产物进行凝胶分离,回收测序共得到43条特异性条带,其中7、8号养鸭场条带数相对较少.DGGE图谱经Quantity One软件分析,结果显示,同一鸭场样品相似性存在差异,绝大部分鸭场样品间相似性均高于50%,所测序列与GenBank中相应原核生物16S rDNA序列经同源性比对可见相似性在90%~100%之间,共包括5个大纲的细菌种类:变形菌门(Proteobacteria)的α,β类群、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes).     

鲜牛乳生产中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药性与散播

探求生鲜牛乳生产中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)耐药情况和散播特点,采集山西某奶牛养殖区的内外环境、挤奶间环境及乳等各生产环节样本,经细菌分离、纯化培养、16S rRNA鉴定、苯唑西林和头孢西丁药敏纸片法及mecA基因扩增筛选MRSA,测定了其对14种抗生素的药物敏感性,利用mecA基因序列和ERIC-PCR指纹图谱分析鲜牛乳生产中MRSA的遗传相似性。结果显示,从721份生鲜牛乳生产样本中分离鉴定出184株金黄色葡萄球菌,其中90株为MRSA,检出率为48.9%;药敏试验显示,MRSA表现不同程度的耐药性和多重耐药性,对青霉素G的耐药率为95.6%,多重耐药种数主要集中在6～8耐;mecA基因序列分析显示,MRSA的mecA耐药基因同源性为95.22%,不同序列有程度不一的碱基位点缺失和突变;ERIC-PCR同源性分析显示,90株MRSA的DNA指纹图谱相似性为52%～100%,其中牛乳中MRSA与牛场(15株)、挤奶间(3株)、居民区空气(1株)的同源性在90%以上。提示在生鲜乳生产环节中均存在大量MRSA的污染,且呈多重耐药性,并可在牛场、挤奶间和附近环境通过直接接触和形成微生物气溶胶污染生鲜牛乳。     

新疆牛源大肠杆菌O157∶H7的分离鉴定及ERIC-PCR基因分型研究

为了了解牛源大肠杆菌（E.coli）O157∶H7在新疆地区的污染状况以及遗传多样性,探究不同地区分离菌株的遗传关系,为控制牛源E.coli O157∶H7的传播提供试验依据。将采集的样品在EC肉汤中进行增菌（37 ℃、180 r/min）,接着将增菌液划线接种到SMAC平板上,37 ℃培养箱中过夜培养18 h左右。挑取SMAC平板上白色或无色单菌落接种MUG培养基,37 ℃培养18 h左右,将无荧光样品接种到SMAC平板上,37 ℃培养18 h左右,隔天挑取白色或无色单菌落进行PCR鉴定,具有rfbE和fliC基因条带的即为阳性菌株。将阳性菌株进行肠杆菌基因间重复共有序列扩增（ERIC-PCR）指纹图谱聚类分析,分析菌株之间的同源性关系。ERIC-PCR结果显示,相似性100%的菌株有3组。从伊犁地区分离到的菌株差异性最大,具有6种分型;其次是乌鲁木齐,具有4种分型。菌株来源多样性最多的在D簇,由此可见通过ERIC-PCR分型,可以进行溯源观察。ERIC-PCR能够区分特定采样点或物种的分离物,它能够证明从不同来源的菌株之间,存在着某些相似的ERIC特性,并聚集在同一个簇群中。该研究中筛选出的E.coli O157∶H7菌株具有广泛的遗传多样性,该方法对于检测不同物种间的细菌差异非常敏感。由此可见ERIC-PCR可以作为E.coli O157∶H7常规监测和鉴定的一个有效的工具。     

花苜蓿内生放线菌多样性及群落结构

为了了解药用植物花苜蓿内生放线菌的多样性和群落结构,将采自四川省甘孜地区的药用植物花苜蓿进行严格的表面消毒灭菌后,运用变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)技术对其根茎叶花等样品的内生放线菌进行分析。结果表明,花苜蓿不同组织中内生放线菌多样性和群落结构存在明显差异。其内生放线菌的多样性指数(H)和丰富度(S)均是花>根>茎>叶,而均匀度(E_H)则是叶>根>茎>花。不同组织样品之间的放线菌群落结构相似性差异明显,其中茎与叶的相似性最高,根与叶之间相似性最低,其他组织之间相似性均很低。DGGE条带回收测序结果显示,大部分克隆条带属于链霉菌属(Streptomyces),但仍有超过43%的条带属于稀有放线菌,且主条带A23和共有条带A12属于稀有放线菌,说明部分稀有放线菌在花苜蓿样品内是优势放线菌。该研究表明了花苜蓿根茎叶花组织的内生放线菌存在丰富的多样性,且不同组织内生放线菌多样性存在明显差异,其中花组织多样性最丰富。说明甘孜地区的药用植物花苜蓿可作为一种较理想的分离内生放线菌的植物资源。     

PCR-DGGE分析白犀牛粪样菌群多样性

为研究不同食谱下白犀牛粪样菌群多样性变化,分别采集5头以青草为主食谱和以干草为主食谱的犀牛粪样,提取总细菌核酸,利用基于16S rRNA基因的变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术进行菌群分析。结果表明:在2种食谱条件下,5头犀牛粪样细菌DGGE图谱均出现较多条带;同一食谱时,5头犀牛样品存在较多共有条带。相似性分析显示,所有犀牛样品间的相似性较高,大于55%。各个体间,犀牛B、C和E样品归于同一簇,相似性大于70%;更换食谱后,未出现样品归于同一簇规律。与夏季青草为主食谱相比,冬季更换以干草为主食谱后,5头犀牛粪样细菌菌群的Shannon多样性指数显著升高(P<0.05)。结果提示,不同季节更换食谱在一定程度上会影响犀牛粪样菌群区系。     

五种不同苜蓿的种子蛋白指纹图谱研究

采用8%和10%两个浓度梯度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,对黄花苜蓿、天蓝苜蓿、一年生苜蓿(Orion)、紫花苜蓿(敖汉)及1个紫花苜蓿杂交种共5种不同苜蓿的种子可溶性蛋白和盐溶蛋白图谱进行了研究。结果显示:5个种10%和8%凝胶电泳的种子可溶性蛋白总带数分别为97和91,10%凝胶电泳的种子盐溶蛋白共有69条谱带;5种苜蓿在种子可溶性蛋白和盐溶蛋白电泳图上都具有各自的特征谱带,谱带数目、位置、宽窄和颜色深浅都存在明显的差异;10%凝胶的可溶性蛋白指纹图谱谱带数目相对较多,种间遗传差异在A、B、C区均有分布,谱带的重复性好,是鉴别种的最好图谱。5种苜蓿种子可溶性蛋白和盐溶蛋白指纹图谱一致,表明杂交种和敖汉苜蓿的谱带相似性最大,与黄花苜蓿的相似性次之,而这3个种与天蓝苜蓿和一年生苜蓿(Orion)的相似性较小。这与种在形态学上表现出来的差异相一致,从而进一步肯定了采用种子贮藏蛋白电泳技术进行苜蓿分类研究和种子鉴别的可靠性。     

新疆北部部分地区副猪嗜血杆菌的ERIC-PCR指纹聚类分析

为了解新疆北部部分规模化养猪场副猪嗜血杆菌(H.parasuis)分离株的基因型,本实验采用ERIC-PCR方法结合统计学分析软件,对来源不同的12株H.parasuis进行分子指纹图谱分析.结果表明12株分离株分别位于4个聚类中,各个菌株之间的遗传距离较近,并且含有长度为1 000 bp的相同条带,相同血清型的分离株在其分子指纹聚类上均位于同一个分支中.试验结果表明基于ERIC-PCR的分子指纹聚类分析结合传统的琼脂免疫扩散法可以准确地对不同分离株H.parasuis进行分型.试验结果显示H.parasuis在该地区广泛存在并具有多种不同的基因型,同时为该地区H.parasuis的免疫防治提供了重要的实验依据.     

运用PCR-DGGE分析比较瘤胃中不同饲料固相粘附微生物区系

通过研究奶牛瘤胃中苜蓿、青贮玉米和羊草3种饲料固相粘附微生物菌群结构,分析比较附着于不同粗饲料微生物区系的差异。选择3头健康且体质量相近的装有永久性瘤胃瘘管的中国荷斯坦奶牛,将苜蓿、青贮玉米和羊草分别装入尼龙袋,在瘤胃中孵育24h后取出,PBS洗脱获得固相粘附微生物,提取总DNA,采用变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)分析群落结构,选取清晰条带测序后构建系统发育树。不同样品的DGGE图谱条带的数目和条带颜色深浅有一定差异;苜蓿与青贮玉米和羊草间相比相似性较低,青贮玉米与羊草间的相似性较高;3种饲料及瘤胃内容物固相粘附微生物的Simpson多样性指数差异显著(P0.05),Shannon-Wiener多样性指数差异不显著(P0.05);3种饲料固相粘附微生物条带近源种分别归属Butyrivibrio sp.、Fibrobacter sp.、Prevotella sp.、Succiniclasticum sp.、Pseudobutyrivibrio sp.5个属。3种饲料固相粘附微生物的种群构成存在差异。