牛产气荚膜梭菌分离株毒素基因的检测与分析

为了解黑龙江省牛源产气荚膜梭菌分离株的基因型,检测β2和CPE两种次要毒素因子在牛源产气荚膜梭菌分离株中的携带情况。通过PCR方法检测了产气荚膜梭菌13个野毒株的cpa、cpb、etx、itx四种分型毒素、cpb2、cpb2的两个等位基因突变体(atypical cpb2和consensus cpb2)及肠毒素(cpe)基因。结果表明:92.3%(12/13)的产气荚膜梭菌分离株为A型,检测到1株D型;A型菌中β2毒素基因检出率为66.7%(8/12);β2毒素基因阳性菌株中75%(6/8)携带非典型cpb2基因,50%(4/8)携带典型cpb2基因,非典型突变体占优势。动物致病性试验发现β2毒素阳性菌株(8株)与β2毒素基因阴性菌株(4株)各有2株分离株具有致病性。所有菌株CPE毒素基因PCR检测均为阴性。研究为产气荚膜梭菌病的发病机理和疫苗开发提供了理论依据。     

表面展示C型产气荚膜梭菌α,β毒素蛋白重组乳酸菌的 构建及反应原性分析

构建表达C型产气荚膜梭菌α,β1和β2毒素蛋白的重组乳酸菌,并对表达蛋白反应原性进行鉴定。通过PCR构建pSIP409-pgsA’-α,pSIP409-pgsA’-β1以及pSIP409-pgsA’-β2质粒,并将三种质粒电转入植物乳杆菌NC8后诱导表达,通过Western-blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况。构建的NC8-pSIP409-pgsA’-α,NC8-pSIP409-pgsA’-β1以及NC8-p SIP 409-pgsA’-β2三种重组乳酸菌能成功表达C型产气荚膜梭菌α,β1和β2毒素蛋白,三种表达的融合蛋白大小分别为61 kDa、52 kDa以及46 kDa。三种重组乳酸菌表达了C型产气荚膜梭菌α,β1和β2毒素蛋白且与制备的多抗具有良好的反应原性,为C型产气荚膜梭菌口服疫苗的研制奠定基础。     

无毒性产气荚膜梭菌ε毒素突变体的表达及免疫保护力评价

【目的】获得产气荚膜梭菌ε毒素（ETX）的无毒重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。【方法】对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因按照大肠杆菌偏爱密码子进行优化设计。同时,将第106位的组氨酸和第199位的苯丙氨酸分别突变为脯氨酸和谷氨酸,经人工合成,获得基因片段GETX_m2。将GETX_m2克隆至原核表达载体pET30a-(＋)后,将pET30a-GETX_m2转化至BL21（DE3）感受态细胞中,在15℃和37℃两种条件下分别用IPTG诱导16 h和4 h,超声破碎后收集上清和沉淀,采用SDS-PAGE和Western blot方法检测重组蛋白的表达情况及其可溶性。利用Ni-IDA亲和层析方法对可溶性表达的重组蛋白进行纯化,从而获得重组蛋白rETX_m2。利用Western blot方法,检测rETX_m2与D型产气荚膜梭菌ETX抗血清的反应性。将rETX_m2用细胞维持液稀释至100及10 μg·mL^-1,检测其对犬肾细胞系（MDCK细胞）的毒力。分别用胰酶活化前和活化后的rETX_m2,以0.0625、0.625和6.25 mg·kg^-1 3个剂量尾静脉注射,检测rETX_m2对小鼠的毒力。随后,将rETX_m2与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,取4只健康家兔,皮下免疫2次（间隔两周）,100 μg/只。同时,Montanide ISA 201佐剂与PBS混合液免疫组作为对照组。分别在一免后14 d以及二免后21 d,采血,分离血清,按照《中华人民共和国兽药典》（2015年版）规定的方法检测血清对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价。同时,在二免后21 d,对家兔经耳缘静脉注射1个家兔MLD的D型产气荚膜梭菌毒素,检测rETX_m2对家兔的免疫保护效果。【结果】 在15℃和37℃条件,rETX_m2在BL21（DE3）菌体中均以可溶性和包涵体两种形式表达,综合考虑重组蛋白的表达量、可溶性及诱导时间,选择纯化在37℃条件下诱导获得的可溶性rETX_m2。灰度扫描结果显示,在37℃诱导条件下,rETX_m2可溶表达比例达30%;Western blot检测结果表明,D型产气荚膜梭菌毒素抗血清能够特异性的识别rETX_m2,出现特异性反应条带。MDCK细胞毒性实验显示,在rETX_m2浓度为100 μg·mL^-1的细胞培养基中孵育24 h后,细胞未出现细胞病变,而2 000倍稀释的D型产气荚膜梭菌天然毒素细胞培养基孵育组的细胞出现了明显的细胞病变;小鼠安全试验显示,尾静脉注射6.25 mg·kg^-1剂量的rETX_m2,对小鼠无致死性;血清中和试验结果显示,rETX_m2免疫组每毫升的一免兔抗血清可中和450-750个小鼠MLD,每毫升的二免兔抗血清可中和2 500-4 000个小鼠MLD的D型产气荚膜梭菌毒素,而对照组的兔抗血清对D型产气荚膜梭菌毒素无中和作用;用1个家兔MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔4/4保护。【结论】产气荚膜梭菌rETX_m2毒力基本丧失,但保留了良好的免疫原性,是D型产气荚膜梭菌病基因工程亚单位疫苗的理想候选抗原蛋白。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位与产气荚膜梭菌毒素融合蛋白的免疫原性

梭菌毒素作为产气荚膜梭菌的主要致病因子可引起家畜的多种疾病,其中β1毒素和β2毒素是由C型菌产生的2种引起动物坏死性肠炎的主要致病因子。基因工程重组毒素蛋白已作为潜在候选疫苗用于预防该菌所引起的多种传染性疾病,大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)是一种常用的黏膜免疫佐剂。本研究将ltb-cpb2-cpb1及ltb-cpa融合基因进行IPTG的诱导表达,制备了包涵体粗提物,并对小白鼠进行免疫攻毒试验及其免疫后抗原免疫保护期的免疫原性的研究。结果显示,经LTB-CPB2B1及LTB-CPA重组蛋白免疫后的小白鼠在第28、第56天时用产气荚膜梭菌强毒攻击,可获得很好的保护,产气荚膜梭菌毒素与LTB融合基因重组菌株能够有效刺激免疫小白鼠产生特异性抗体。说明该重组菌株可以作为预防产气荚膜梭菌所引起疾病的候选菌株。     

鸡源产气荚膜梭菌a毒素基因克隆表达及免疫原性的初步研究

从鸡源产气荚膜梭菌C57-86中PCR扩增出a毒素基因,构建了表达质粒p GEXKG-a,并进行核苷酸序列进化分析。结果表明,鸡源产气荚膜梭菌的a毒素基因与参考菌株strain AL08-16相似性较高,核苷酸同源性为97.7%。对重组菌株BL21/KG-a诱导的表达产物进行了SDS-PAGE分析,重组菌株BL21/KG-a可以高效地表达毒素蛋白质;免疫试验表明,表达产物免疫的SPF试验鸡可抵抗A型产气荚膜梭菌的攻击。     

产气荚膜梭菌α-β融合基因的构建与表达研究

应用PCR技术,首先从A型产气荚膜梭菌菌株NCTC64609中扩增出α-毒素保护性抗原基因片段,然后从C型产气荚膜梭菌C58-1染色体基因组中扩增了930 bp的β-毒素基因,并将α-毒素基因和β-毒素基因插入融合表达载体pBV221中,获得了重组质粒pMCPAB,转化受体菌BL21(DE3),得到重组菌株BL21(DE3)(pMCPAB)。对重组菌株诱导的表达产物进行ELISA检测和SDS-PAGE分析,结果表明重组菌株可以高效表达α-β融合蛋白。免疫实验表明,表达产物免疫的小鼠可抵抗α-毒素和β-毒素的攻击。     

产气荚膜梭菌毒素型菌落多重PCR方法的建立及应用

根据产气荚膜梭菌α、β、ε和ι毒素基因cpa、cpb、etx、iA设计并合成4对特异性引物,建立快速鉴定产气荚膜梭菌毒素型的多重PCR方法。结果显示:产气荚膜梭菌A、B、C、D和E型参考菌株均扩增出相应的片段,而肉毒梭菌、气肿疽梭菌、腐败梭菌、诺维梭菌的扩增均为阴性;将产气荚膜菌株单个菌落稀释100倍,仍能扩增出相应的目的片段。利用此多重PCR方法对16株不同动物来源的产气荚膜梭菌进行分型鉴定,并与毒素中和试验鉴定结果进行比较,结果显示2种方法具有较高的符合率。该方法可有效进行产气荚膜梭菌的快速检测和分型,对产气荚膜梭菌感染与食品安全问题的研究具有参考价值。     

产气荚膜梭菌肠毒素基因原核表达载体的构建

以含C型产气荚膜梭菌分离株(CP2)肠毒素基因的克隆载体pMD18-T-cpe为材料,根据产气荚膜梭菌开放阅读框设计合成一对特异性引物,采用PCR技术对其进行扩增,经BamHI和EcoRI双酶切后,从胶上回收目的基因,与经过相同两种内切酶处理的原核表达栽体pET32a连接,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞后,提取质粒进行PCR和BamHI/EcoRI双酶切鉴定后测序.结果表明,肠毒素基因已成功地克隆到原核表达栽体上(重组质粒命名为pET32a-cpe),从而构建了产气荚膜梭菌肠毒素基因的原核表达质粒.     

多种动物源A型产气荚膜梭菌的分离鉴定及生物学特性

【目的】研究猪源及其它动物源A型产气荚膜梭菌(CpA)的β2毒素基因和相关生物学特性。【方法】从南昌周边地区随机采集猪、牛、羊、鸡、犬、鱼的新鲜粪便样品,采用4%D-环丝氨酸FTG梭菌选择培养基从各样品中分离纯化产气荚膜梭菌,并对分离菌株进行培养特性观察、革兰氏染色镜检、生化鉴定和16S rDNA分子鉴定;再通过多重PCR技术进行分子分型,对分离到的A型产气荚膜梭菌(CpA)进行β2毒素基因检测和溶血试验。【结果】所分离到的CpA中,除犬源CpA,其它动物源分离株均携带β2毒素基因;不同动物源的CpA溶血时间和溶血强度不一样:羊源CpA在血平板上4 h能观察到明显的溶血,溶血圈直径达到30 mm;猪源CpA 6 h才能观察到明显的溶血,溶血圈直径约为14 mm。【结论】为了解CpA致病机理,解析其在不同动物致病强弱和地区特异性提供参考依据。     

产气荚膜梭菌β毒素抗体间接ELISA检测方法的建立

【目的】建立产气荚膜梭菌β毒素抗体间接ELISA检测方法。【方法】将原核表达重组质粒pET-28a-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,表达产物经镍柱亲和层析纯化、尿素梯度透析复性后进行Western blot鉴定。用复性的β毒素重组蛋白作为包被抗原,通过优化间接ELISA试验条件,建立其抗体间接ELISA检测方法,对该方法的特异性、敏感性和重复性进行考察,并用其对521份临床样本进行检测。【结果】通过诱导、纯化和复性,获得了纯度较高且具有良好反应原性的β毒素重组蛋白。间接ELISA条件为:抗原最佳包被质量浓度为5.0μg/mL,阳/阴性血清最佳稀释度为1∶50,酶标二抗最佳稀释度为1∶2 500,以含50g/L脱脂奶粉的PBST作为封闭液,37℃封闭1h,抗原抗体作用1h,TMB显色30min。间接ELISA的判定标准为OD450≥0.313为阳性,OD4500.313为阴性;建立的间接ELISA方法的特异性为96%,敏感性为98%;批内变异系数在3%~4%,批间变异系数在9%以下。利用间接ELISA检测方法对521份临床山羊血清样本的检测结果表明,抗体阳性率为72.5%。【结论】对产气荚膜梭菌β毒素进行了原核表达,成功建立了其抗体间接ELISA检测方法,为产气荚膜梭菌β毒素抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。     

噬菌体裂解酶Cp51在重组乳酸菌中的表达及对A型产气荚膜梭菌的抗菌活性

【目的】构建A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens裂解酶重组表达乳酸菌Lactococcus lactis,并检测重组菌及其表达产物的抗菌效果。【方法】全基因合成噬菌体裂解酶Cp51基因,构建PNZ8148-Cp51原核表达重组载体,电转化至乳酸菌NZ9000,经乳链菌肽诱导表达可溶性Cp51蛋白;用比浊法检测表达蛋白对A型产气荚膜梭菌的抗菌活性;利用细菌液混合培养检测重组菌对A型产气荚膜梭菌增殖的抑制作用。【结果】噬菌体裂解酶Cp51在乳酸菌中成功表达,为1 268 bp;质量浓度1μg·mL-1以上的重组蛋白对A型产气荚膜梭菌具有高效抗菌活性;重组乳酸菌对A型产气荚膜梭菌增殖有一定的抑制效果,混合培养后使产气荚膜梭菌活菌数从9×10~9 CFU·mL~(-1)下降到约9×10~8 CFU·mL~(-1)。【结论】A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶重组乳酸菌构建成功,为后续优化表达和临床应用研究奠定了基础。     

牛产气荚膜梭菌黑龙江分离株的分型鉴定

为了对三株未知型牛源产气荚膜梭菌(Clostridium Perfringens,Cl.perfringens)进行基因分型鉴定,将三株未知型菌株进行厌氧培养、纯化,观察培养特性,进行革兰氏染色镜检以及生化管鉴定,根据产气荚膜梭菌α、β、ε和ι毒素基因以及产气荚膜梭菌16S r RNA保守基因分别合成5对引物,建立PCR方法。经培养特性、革兰氏染色镜检、生化特性以及16S r RNA保守基因细菌PCR鉴定均符合产气荚膜梭菌,PCR结果表明,三株产气荚膜梭菌均为A型。     

A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51的原核表达及活性检测

【目的】原核表达A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51并研究其对A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens的体外抗菌活性。【方法】合成噬菌体裂解酶Cp51基因,并构建了pET-32a-Cp51原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),经终浓度为0.5 mmol·L~(-1)的IPTG诱导以及镍柱纯化后,获得了可溶性的Cp51重组蛋白;用比浊法检测Cp51重组蛋白的杀菌活性。【结果】噬菌体裂解酶Cp51重组蛋白能够有效降低7株A型产气荚膜梭菌的浊度,裂解酶质量浓度在5μg·m L~(-1)以上、作用30 min对A型产气荚膜梭菌的杀菌率可达到99.99%以上,而对其他种类细菌无杀菌效果。【结论】A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51重组蛋白对A型产气荚膜梭菌有较强的体外杀菌活性和特异性,研究结果为后续裂解酶Cp51的临床应用奠定基础。     

冷鲜鸡产气荚膜梭菌及其毒素的潜在危害分析

为调查广州市冷鲜鸡产气荚膜梭菌及其毒素危害,从广州市各大型超市随机采集鸡肉样品进行产气荚膜梭菌分离、鉴定和毒素分型,同时检测分离菌株对常用抗生素的抗药性,并采用Eric-PCR对分离出梭菌进行亚型分析。结果表明,从78个样本中分离出57株产气荚膜梭菌,所有菌株均为A型,其中,cpb2(Atypical)型40株,cpb2(consensus)型1株;含net B基因菌株1株;药敏结果显示,分离出的产气荚膜梭菌大部分对氟苯尼考、氨苄西林、青霉素敏感;值得注意的是产气荚膜梭菌分离株对仅可用于人的抗生素克林霉素、头孢氨卞的耐药率分别达73.68%和31.58%。Eric-PCR结果显示,相似性为80%时,57株梭菌可分为13个亚型,提示污染来源的多样性。     

天祝白牦牛MSTN基因编码区克隆及生物信息学分析

为探讨天祝白牦牛MSTN基因的分子结构特征,通过PCR扩增和测序技术以及生物信息学分析工具对天祝白牦牛MSTN基因进行克隆、测序及相关生物信息学分析。结果表明,天祝白牦牛MSTN基因编码区序列全长1 128 bp,编码375个氨基酸残基;天祝白牦牛MSTN基因编码蛋白分子量42.55 ku,理论等电点为6.14;生物信息学预测发现,天祝白牦牛MSTN蛋白是不稳定的亲水蛋白,mRNA二级结构的最小自由能为-1 135.16 k J·mol~(-1),蛋白质二、三级结构均是以无规卷曲和延伸链为主的混合型蛋白。天祝白牦牛MSTN基因的成功克隆为进一步研究牦牛MSTN的遗传特性和生理机制奠定了基础。     

B型产气荚膜梭菌三种主要毒素基因的PCR检测

为了对B型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type B)进行快速检测,依据NCBI登录的产气荚膜梭菌α、B及ε毒素基因序列设计引物,并对其进行PCR扩增.琼脂糖凝胶电泳结果显示3个毒素基因均被成功扩增,目标片段条带清晰,长度与预期相符.     

D 型产气荚膜梭菌贵州分离株ε毒素的 DNA 序列测定与分析

为研究产气荚膜梭菌ε毒素的结构与功能,以及对该病的防治提供基础依据,利用 D 型产气荚膜梭菌贵州分离株（CP02株）,根据 GenBank 中登记的产气荚膜梭菌ε毒素基因设计特异性引物进行PCR 扩增,扩增产物纯化后测定核苷酸序列并与 NCBI 登录的参考毒株进行相似性比较。结果表明：D 型产气荚膜梭菌 CP02株基因片段大小为456 bp,与 CWD_CN_409、NCTC_8533、NCTN_6121、ETX21512、KurCpD1、CtrCpD2、IVRI_Vac1和 IVRI_49菌株的核苷酸序列相似性在98．5％～100％,推导的氨基酸序列相似性在98．4％～100％。碱基突变以 A-G、C-T 间的转换为主,也发生低频率的 A-C、G-T 间颠换,但突变均为点突变。     

江苏地区临床健康肉羊的产气荚膜梭菌感染分析

为揭示临床健康肉羊的产气荚膜梭菌感染概况,于2018年4-6月选择江苏地区肉羊养殖场30个,采集3～5月龄肉羊肛拭子样品892份.所有样品接种至梭菌增菌液,于厌氧条件下增菌培养后,以PCR进行产气荚膜梭菌的检测,并对部分检测为产气荚膜梭菌阳性的样品进行细菌分离.结果表明:175份(19.62％)肛拭子样品为产气荚膜梭菌阳性,提示临床健康肉羊的消化道可携带产气荚膜梭菌.数据分析表明,3、4、5月龄羊差异不显著,免疫羊与未免疫羊差异不显著.通过对分离的68株产气荚膜梭菌进行α、β、ε和ι毒素基因检测,确定了其中43株(63.24％)为A型产气荚膜梭菌,25株(36.76％)为D型产气荚膜梭菌,提示A、D型是江苏地区肉羊感染的主要产气荚膜梭菌类型.     

无毒性产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白的自诱导分泌表达及免疫原性分析

为获得分泌表达的无毒性产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白并分析其免疫原性,根据A型产气荚膜梭菌α毒素基因序列,对α毒素的第176位组氨酸突变为天冬酰胺,同时对信号肽序列进行密码子优化,将化学合成的该序列插入到载体pET32a,获得重组质粒pET32a-αH176N,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),通过自诱导的方法分泌表达重组αH176N蛋白。SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,αH176N蛋白在乳糖1～2 g/L、28℃诱导条件下高效分泌表达。卵磷脂酶试验及小鼠毒力试验显示,αH176N蛋白失去磷脂酶C活性及毒性。免疫保护试验结果显示,αH176N蛋白与氢氧化铝胶配制成的疫苗,以0.25 mL/只免疫试验兔就能达到100%(6/6)的免疫保护效果,优于传统灭活疫苗免疫2 mL/只的保护效果。     

一株西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌基因分型及rpoE基因生物信息学分析

为分析本实验室分离保存的一株西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌基因型和rpoE基因编码蛋白的生物特性,通过16S rDNA、特异性基因、荚膜分型、脂多糖分型、rpoE基因扩增等分子生物学和生物信息学方法对此株牦牛源多杀性巴氏杆菌进行分析.结果 表明:此株牦牛源多杀性巴氏杆菌为B∶ L2∶ST44基因型,rpoE基因和印度牛源多杀...