我国五大淡水湖日本沼虾线粒体COI基因部分片段序列比较

对我国五大淡水湖日本沼虾100个野生个体的线粒体细胞色素氧化酶亚基I(COI)部分序列进行了测定和分析,经比对获得578 bp核苷酸片段,发现49个变异位点,得到35个单倍型,包括7个共享单倍型,各群体都具有较好的单倍型多态性和核苷酸多态性,其中鄱阳湖群体遗传多样性相对最高.AMOVA分析表明,五群体间总遗传分化系数Fst=0.3187(P<0.05),群体间具有较高的遗传分化.MEGA3.1软件计算五群体的Kimura 2-paramter遗传距离,洞庭湖群体和巢湖群体之间的遗传距离最远为0.0191,巢湖群体和洪泽湖群体之间的遗传距离最近为0.0051.以同属胖掌沼虾(Macrobrachium inflatum)为外群分别构建了NJ和UPGMA系统树,结果显示洞庭湖和鄱阳湖为一族群,太湖、巢湖和洪泽湖为一族群.     

中国东南沿海青蟹线粒体COI基因部分序列分析

对我国东南沿海5个地区的72个青蟹个体的线粒体细胞色素氧化酶亚基I (COI)部分序列序列进行了测定和分析。获得的72个细胞色素氧化酶亚基I (COI)序列可分为12个单倍型,与GenBank中已知的Scylla paramamosain COI序列的相似性达到98%以上,与其它3种 青蟹的差异为7.36%～15.54%。这些序列与S. paramamosain的遗传距离仅为0.00783,但是与S. serrata、S. olivacea和S. tranquebarica〗的遗传距离却分别达到0.11659、0.17812和0.08423。序列特征、遗传距离和系统进化等分析结果都表明本文研究的青蟹为S. paramamosain。结果提示,在进行青蟹属相关研究应当仔细鉴别采集样本的种类。     

条石鲷线粒体COⅠ和Cytb序列的遗传变异分析

通过PCR扩增与测序分别获得了长度为642 bp和1 138 bp的条石鲷线粒体COⅠ和Cytb基因片段。分析表明,COⅠ序列共定义了11个单倍型,存在21个多态性位点,发生转换4次,颠换5次。A、T、G、C碱基的平均含量分别为24.5%、30.6%、18.8%和26.1%。Cytb序列共定义了11个单倍型,存在26个多态性位点,发生转换4次,颠换3次。A、T、G、C碱基的平均含量分别为24.9%、28.3%、14.8%和32.0%。基于COⅠ和Cytb两基因序列的单倍型多样性(Hd)、核苷酸多样性(Pi)和平均碱基差异(K)分别为 0.795、0.008 83、5.667和 0.770、0.003 54、4.025。结果表明,条石鲷群体的COⅠ和Cytb基因片段显示出较高的遗传多样性水平。本研究结果可为条石鲷资源保护及系统进化研究提供基础资料。     

河北3个日本沼虾野生群体线粒体DNAD-Loop基因序列变异及种群遗传结构分析

为进一步了解白洋淀与衡水湖日本沼虾种质资源现状,实验通过对白洋淀南淀(SB)、白洋淀北淀(NB)、衡水湖(HS)日本沼虾群体线粒体DNA D-Loop基因片段进行扩增和测定,得到935 bp的序列用于进一步的分析,其中变异位点80个,占分析位点的8.56%,含有77个简约信息位点,平均转颠换比值(TS/TV)为7.28,4种碱基在所得序列中平均含量为A(42.65%)、G(9.08%)、T(36.98%)、C(11.29%),其中A+T含量为79.63%,明显高于C+G含量。AMOVA分析结果显示,群体间的遗传分化系数FST=0.2336,群体间遗传变异占23.36%,群体内遗传变异占76.64%,群体间具有较高程度的遗传分化。运用K-2-P模型构建了3群体的23个单倍型的NJ系统发育树,单倍型之间并没有按照单倍型所属群体的分类聚簇,表现为不同群体个体相互交错形成复杂的簇群。群体中性检验、错配分析表明,日本沼虾近期未曾经历过种群扩张。     

日本沼虾cytMnSOD和mtMnSOD基因全长cDNA克隆及表达

利用RACE技术从日本沼虾肝胰腺中克隆了cytMnSOD和mtMnSOD基因cDNA全长序列。cytMnSOD基因cDNA全长1 233 bp,开放阅读框为858 bp,编码286个氨基酸,N端含有60个氨基酸残基组成的延伸区;mtMnSOD基因cDNA全长1 113 bp,开放阅读框为654 bp,编码218个氨基酸,N端含有20个氨基酸残基组成的信号肽;cytMnSOD和mtMnSOD预测蛋白分子量及等电点分别为31.33、24.05 ku和5.62、7.12。日本沼虾cytMnSOD推导的氨基酸序列与其mtMnSOD的相似性为40%,二者均含有MnSOD的特征肽段(DVWEHAYY)、4个Mn2+结合位点和2个N-糖基化位点。Real-time PCR结果表明,cytMnSOD和mtMnSOD在日本沼虾肝胰腺、肌肉、血细胞、大颚器官、卵巢和鳃等组织均有表达,其中肝胰腺表达量最高;肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD基因的表达量在蜕皮间期最高,蜕皮后期和蜕皮前期较低。嗜水气单胞菌刺激后3 h,肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD的表达量显著增加,推测MnSOD是参与机体免疫防御反应的一种重要分子。     

洪泽湖日本沼虾 9 个野生群体遗传多样性微卫星分析

利用微卫星标记分析了洪泽湖避风港、蒋坝、鲍集等9个日本沼虾(Macrobrachium nipponense)野生群体的遗传多样性。结果表明,8个微卫星位点呈现高度多态性;每个群体中至少有5个位点显示杂合不足,显著偏离了Hardy-Weinberg平衡;9个日本沼虾野生群体均表现出较高的遗传多样性水平,洪泽湖中、东部避风港和蒋坝等群体遗传多样性高于西部鲍集和界集群体。突变-漂移平衡分析表明,洪泽湖日本沼虾群体部分位点杂合显著过剩,表明洪泽湖日本沼虾群体部分位点偏离了突变-漂移平衡,但近期没有经历过瓶颈效应,群体数量也没有下降。群体间F-统计量及AMOVA分析表明,群体遗传分化极显著(F ST=0.0643,P0.01);基于D A遗传距离构建的NJ和UPGMA聚类树均显示,地理位置相邻的群体聚在一起。结论认为,洪泽湖日本沼虾群体具有丰富的遗传多样性,在洪泽湖地区建立日本沼虾种质资源自然保护区,可以更好地有效保护洪泽湖水域的日本沼虾种质资源。     

基于线粒体COⅠ和Cytb基因探讨北鲍南养对皱纹盘鲍群体遗传结构的影响

为探讨近三十年来我国皱纹盘鲍养殖模式对群体遗传结构产生的影响,利用线粒体细胞色素C氧化酶亚基 (COⅠ)基因和细胞色素b (Cytb)基因分析了定殖漳州的群体、大连培育蓬莱越冬群体、荣成培育福建越冬群体及长山列岛 (砣矶岛、大钦岛、南隍城岛)皱纹盘鲍群体的遗传多样性与群体遗传结构。结果显示,在259个个体730 bp的COⅠ序列片段中检测到48个变异位点和30个单倍型,6个群体的单倍型多样性为0.586~0.897,核苷酸多样性为0.0056~0.0081。259个个体730 bp的Cytb序列片段中检测到59个变异位点和32个单倍型,6个群体的单倍型多样性为0.605~0.909,核苷酸多样性为0.0077~0.0120。基于COⅠ和Cytb基因的群体间F_st值以及AMOVA结果表明,绝大部分群体之间存在显著的遗传分化,并且遗传变异主要来源于群体内。现行的皱纹盘鲍北鲍南养模式加强了不同群体之间的基因交流,使不同遗传背景的种群二次接触,导致皱纹盘鲍6个群体均具有较高的单倍型多样性和核苷酸多样性;而各养殖群体中的不同选育条件则可能是造成显著遗传分化的重要原因。本研究对分属南北沿海的6个皱纹盘鲍群体的遗传评估将为我国皱纹盘鲍资源的合理利用以及养殖模式对遗传结构的影响提供科学依据。     

日本沼虾微卫星引物筛选及群体遗传多样性分析

采用(CT)15、(CA)15两种生物素标记及磁珠富集法构建了太湖日本沼虾基因组微卫星富集文库。120个微卫星克隆中83个位点的核心序列重复在10个以上,长度介于191～580bp,平均为311bp;重复类型中,(CA/GT)n及(AG/TC)n分别占59.09%及20.45%,还检测到(GC)n、(AAG)n、(ACAA)n和(GGCAGA)n等17种类型,包括25.75%完美型、20.45%非完美型和53.80%复合性。用其中12条微卫星引物扩增吴江、滨湖、宜兴和吴兴4个群体240个个体的基因组DNA,各位点表现出较高的遗传多样性,除Mni86、Mni103和Mni114外,其它群体位点大都表现出显著的杂合子缺失,4个群体的遗传分化为低度分化(FST<0.05),4个群体中97.58%遗传变异存在于群体内,仅有2.42%的遗传变异来自于群体之间;吴江和吴兴群体亲缘关系最近,与宜兴和滨湖群体亲缘关系渐远。     

洪泽湖野生河蚬(Corbicula fluminea)线粒体COⅠ基因序列的遗传多样性分析

利用线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)分子标记对洪泽湖河蚬(Corbicula fluminea)野生种群的遗传多样性水平进行分析。采集洪泽湖野生河蚬50个个体,对COⅠ基因序列片段进行PCR扩增和序列测定。结果显示,长度为614 bp的COⅠ基因片段中,碱基A、T、G和C的平均含量分别为22.6%、42.4%、21.0%和14.0%,A+T的含量(65.0%)显著高于G+C的含量(35.0%)。COⅠ基因序列中有67个核苷酸变异位点,总变异率为10.9%,其中简约信息位点63个,单一信息位点4个。50条COⅠ基因序列共定义了15个单倍型,单倍型多样性指数(h)和核苷酸多样性指数(π)分别为0.870和0.045,平均碱基差异数(K)为27.370,单倍型序列间的遗传距离为0.002?0.095。采用邻接法(NJ)和最大简约法(MP)构建COⅠ单倍型系统进化树,15个单倍型聚为两个明显分支,表明洪泽湖河蚬种群出现了遗传分化。中性检验结果和歧点分布图显示,洪泽湖河蚬种群大小保持相对稳定,未经历种群扩张。本研究结果表明,洪泽湖河蚬种群具有较高的遗传多样性水平,该结果可为合理开发、利用及保护洪泽湖河蚬野生种质资源提供科学参考。     

日本沼虾三个野生群体亲缘关系分析

为研究我国野生日本沼虾洞庭湖、鄱阳湖、龙感湖3个不同地理群体之间的亲缘关系,利用微卫星(SSR)分子标记技术对上述3个群体进行了亲缘关系分析。从47对引物中筛选出11对引物对日本沼虾上述3个不同地理群体的基因组进行PCR扩增,共扩增90个条带,其中69个(占76.6 ％)为多态性条带。参照pBR322DNA/MspI Marker估算所扩增的条带大小,根据条带的位置确定其基因型,并利用GENEPOP32软件进行遗传距离和相似指数数据分析。结果发现:日本沼虾3个不同地理群体间遗传距离最大为0.196 5,最小为0.186 1,平均遗传距离为0.188 8。采用NTsys2.20聚类分析软件的UPGMA聚类法进行聚类分析的结果表明:龙感湖群体与鄱阳湖群体的亲缘关系最近,而与洞庭湖群体的亲缘关系最远。     

日本沼虾五群体形态性状对体质量的通径分析

为筛选出影响日本沼虾体质量的主要形态性状,以便确定人工选育的理想测定指标,以太湖、鄱阳湖、白洋淀、微山湖及淀山湖的野生日本沼虾为研究对象,随机选取各群体90尾虾测定19个形态指标,采用简单相关分析和通径分析等多元回归分析方法分析各群体对体质量作用较为突出的形态性状,并进行聚类分析。通径分析结果显示,太湖群体体长、头胸甲宽、第二步足长、头胸甲高、尾扇长对体质量的通径系数达到极显著,逐步回归建立其对体质量的回归方程、回归截距及相应的回归系数分别为–9.878、0.075、0.314、0.011、0.320、0.222;鄱阳湖群体头胸甲长、尾扇长、尾节宽、头胸甲宽、头胸甲高、尾节高、体长性状对体质量的通径系数达到极显著,回归截距和相应的回归系数分别为–1.618、0.392、–0.280、0.703、0.524、–0.359、0.688、–0.061;白洋淀群体体长、头胸甲宽、第二步足长和尾扇长对体质量的通径系数达到极显著,其回归截距和相应的回归系数分别为–4.796、0.082、0.222、0.007、0.136;微山湖群体头胸甲长、腹节高、第二步足长、腹节宽对体质量的通径系数达到极显著,其回归截距和相应的回归系数分别为–7.644、0.248、0.329、0.025、0.301;淀山湖群体体长、第二步足长、头胸甲宽、尾节宽、腹节宽对体质量的通径系数达到极显著,其回归截距和相应的回归系数为–6.257、0.019、0.018、0.164、0.264、0.162。体长与头胸甲性状在不同群体中都对体质量的作用十分明显。聚类结果显示,地理位置越接近,形态上越相似。研究表明,各个地区被保留的性状与体质量的复相关系数为0.965、0.904、0.902、0.971、0.955,为影响各自群体体质量的主要自变量。     

在体条件下miR-305-5p对日本沼虾MnCHT3A的靶向调控作用

为了探索miRNA对日本沼虾几丁质酶3A(Macrobrachium nipponense chitinase 3A,MnCHT3A)基因的调控作用,实验采用生物信息学方法预测并筛选与MnCHT3A靶向结合的miRNA—miR-305-5p;利用qRT-PCR、生物化学以及组织学方法,研究了在体条件下,miR-305-5p对靶基因的调控作用。结果显示,一个蜕皮周期中miR-305-5p与MnCHT3A的表达量呈负相关,前者C期最高、A期最低;而MnCHT3A的表达趋势则相反。注射miR-305-5p mimics和miR-305-5p inhibitor后,与对照组相比,MnCHT3A转录水平分别降低60%和升高166%;MnCHT酶活性分别降低39.53%和升高133%。组织学观察发现,C期的头胸甲表皮为3层结构,由外向内依次为上表皮、外表皮和内表皮(H.E染色);几丁质荧光染色结果显示,几丁质分布在内、外表皮;扫描电镜结果清晰显示了内、外表皮的板层结构。与对照组相比,miR-305-5p mimics组内表皮的板层厚度增加,呈蓝色荧光的几丁质条带有增厚趋势;而miR-305-5p inhibitor组表皮结构紊乱,几丁质荧光分布不均且部分区域明显减弱。研究表明,miR-305-5p的靶基因为MnCHT3A,在体条件下,miR-305-5p能够靶向抑制MnCHT3A的转录。     

日本沼虾C型凝集素结构域家族3的cDNA克隆、原核表达和定位分析

C型凝集素(C-type lectin)是一类能与糖类结合的非抗体的蛋白质或糖蛋白家族,为了研究C型凝集素基因在日本沼虾组织分布、细胞定位和细菌感染过程中的表达情况,本研究应用cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了日本沼虾C型凝集素结构域家族3基因(MnLec3)的全长序列,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MnLec3基因在不同组织、细菌感染后不同时间的表达水平,Western blot和免疫荧光分别分析蛋白的表达水平和细胞定位。结果显示,MnLec3基因cDNA全长1 357 bp,包括125 bp的5′末端非翻译区(UTR)、1 026 bp的开放阅读框(ORF)和206 bp的3′UTR,其中开放阅读框编码341个氨基酸。氨基酸序列比对显示,日本沼虾MnLec3基因含有保守钙结合点(Met 1-Glu17)和糖识别结构域(CRD)。同源性分析结果显示,MnLec3与罗氏沼虾C型凝集素3相似度较高;邻接法(Neighbor-Joining,NJ)进化树分析结果显示,MnLec3与其他甲壳动物C型凝集素聚为一支。通过构建原核表达载体获得体外重组蛋白rMnLec3,并将纯化重组蛋白免疫大鼠获得抗血清,免疫荧光结果显示,绿色荧光信号主要在肝胰腺细胞核中表达。qRT-PCR结果显示,MnLec3在日本沼虾所检测组织中均表达,其中肝胰腺中表达量最高,血细胞次之;与对照组相比,在嗜水气单胞菌刺激12～48 h时MnLec3表达量显著升高,48 h表达量最高,Western blot分析结果显示,MnLec3蛋白表达丰度与基因表达模式基本相似,提示克隆得到的MnLec3参与日本沼虾抵御细菌入侵的免疫过程。     

青虾冷休克蛋白Y-box编码基因的cDNA全长克隆与表达分析

为研究冷休克蛋白Y-box基因在青虾应答环境胁迫过程中所起的调控作用,实验应用RACE PCR技术首次克隆了青虾的冷休克蛋白Y-box基因全长c DNA序列,并利用在线软件对其序列特征进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR技术对其在青虾不同组织及环境胁迫过程中的表达变化特征进行分析。青虾冷休克蛋白Y-box基因c DNA全长1501 bp,包括84 bp的5′末端非翻译区(UTR),876 bp的开放阅读框(ORF),541 bp的3′UTR,开放阅读框编码291个氨基酸。氨基酸相似度比对显示,青虾冷休克蛋白Y-box基因富含高度保守的冷休克结构域。系统进化树分析显示,青虾冷休克蛋白Y-box基因与水蚤等节肢动物冷休克Y-box聚类一支,具有最近的亲缘关系。荧光定量PCR检测显示,冷休克蛋白Y-box基因在青虾不同组织中均有表达,其表达量在肝胰腺组织中最高,使用荧光定量PCR检测青虾冷休克蛋白Y-box基因在低温胁迫和恢复条件下在肝胰腺中的m RNA时空表达情况,结果显示,与对照组相比冷休克蛋白Y-box在肝胰腺中的表达量分别在低温和低氧胁迫3,6和12 h出现了显著上调,而在恢复刺激后其表达量与对照组差异不显著。此外,本实验对Y-box进行了原核表达,为进一步研究Y-box基因的功能奠定了基础。     

日本沼虾血清淀粉样蛋白A(SAA)基因的克隆及其免疫功能

为探索血清淀粉样蛋白A(SAA)在日本沼虾免疫防御系统中的作用,实验利用RACE方法克隆了日本沼虾SAA(MnSAA)基因cDNA全长序列,采用实时荧光定量PCR(QPCR)分析其在日本沼虾不同组织、不同发育时期的表达情况,以及溶壁微球菌、嗜水气单胞菌和白斑综合征病毒(WSSV)感染后MnSAA在血淋巴细胞和肝胰腺中的表达情况,同时还利用RNA干扰(RNAi)技术检测了MnSAA基因沉默后,日本沼虾再感染嗜水气单胞菌后其肝胰腺中激活子蛋白-1(AP-1)和B类清道夫受体(CD36)基因表达变化及虾的累积死亡率变化。结果显示,MnSAA基因cDNA全长649 bp (GenBank登录号:MK292888),包含21 bp 5′非编码区,232 bp 3′非编码区,369 bp开放读码框,编码131个氨基酸残基;氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,MnSAA蛋白属于急性期血清淀粉样蛋白A蛋白(A-SAA),在进化上与无脊椎动物香港牡蛎的亲缘关系最近;mRNA表达分析显示,MnSAA基因在日本沼虾的各组织和各生长阶段均有表达,分别在肝胰腺和成虾阶段中的表达量最高;病原体感染实验表明,在日...     

KK-42对蜕皮后期日本沼虾头胸甲超微结构的影响

为了深入探究KK-42对表皮结构的影响,本实验以外表皮形成趋于结束而内表皮开始出现的蜕皮后期幼虾为材料,通过扫描电镜观察石蜡切片法,分析了KK-42处理前后头胸甲外表皮,尤其是内表皮结构的变化。将处于蜕皮间期的健康幼虾[体长(3.5±0.1)cm]随机分为2组,分别用1.95×10-4 mol/L的KK-42溶液和不含KK-42的溶液处理,取蜕皮后1.5、3.0、6.0及12.0 h幼虾头胸甲,观察其超微结构。另取蜕皮后6.0 h头胸甲,用解剖刀轻轻刮去内面组织,通过扫描电镜观察内表皮的表面结构。结果显示,蜕皮后1.5和3.0 h,头胸甲只包含上表皮和外表皮,KK-42处理组外表皮的板层数量显著增加,外表皮厚度分别比相应对照组提高了72.07%和38.67%;蜕皮后6.0～12.0 h,外表皮中疏松的板层趋于致密,其厚度在二组间无统计学差异。蜕皮后6.0 h,只有1层板层的内表皮出现,到蜕皮后12.0 h,板层数增至2层(对照组)和3层(处理组),且板层结构均疏松。此外,内表皮表面分布着大小不等、头尾走向的梭形孔道(pore canals);KK-42处理组内表皮结构未见明显变化。实验...     

日本沼虾VASA蛋白的原核表达、抗体制备及其免疫鉴定

Vasa基因具有在性腺中特异表达的特点,在生殖细胞分化与发育过程中起重要作用。从日本沼虾精巢cDNA中克隆了vasa基因的阅读框,连接到pET-32a载体,构建重组表达质粒pET32a-vasa,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导融合表达,表达产物经SDS-PAGE分析表明,融合蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约85 ku,表达量约占包涵体总蛋白的48.7%,Westernblotting检测表明,融合蛋白可特异地被anti-HIS标签抗体识别。用Ni²⁺-NTA纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备获得多克隆抗体,ELISA显示该抗体效价达1∶160 000,Western免疫鉴定显示该抗体不仅能识别融合蛋白,而且也能识别日本沼虾性腺粗提液中的内源性VASA蛋白,免疫组化进一步显示,VASA蛋白主要分布在卵母细胞核周围和精原细胞质中,成熟精子中无信号,暗示VASA在日本沼虾生殖细胞发育分化过程中扮演重要角色。     

不同水温与饲料磷水平对日本沼虾生产性能、组织及水体磷含量的影响

为探讨不同水温与饲料磷水平对日本沼虾生产性能、组织及水体磷含量的影响,实验采用3×3因子设计,设定3个水温梯度(20、25和30°C)和3个饲料磷水平(1.1%、1.5%和1.9%),共9组(分别命名为20/1.1、 20/1.5、 20/1.9、 25/1.1、 25/1.5、 25/1.9、30/1.1、30/1.5和30/1.9),每组4个重复。虾饲养于室内循环系统中,养殖期为8周。结果显示,从水温来看,30°C组的终末体质量、特定生长率和增重率均显著高于20°C组,但与25°C组间差异不显著,而摄食量和饵料系数的变化趋势与此相反。此外,30°C组的磷保留率显著高于其他2组,且该组血淋巴磷含量显著高于25°C组,而与20°C组无显著差异。从饲料磷水平来看,1.9%磷水平组的终末体质量、增重率和磷保留率显著低于其他2组,而磷摄入量与饵料系数的变化趋势与之相反。1.9%磷水平组的特定生长率显著低于1.5%磷水平组,但与1.1%磷水平组差异不显著。此外,1.1%磷水平组全虾磷含量显著低于其他2组,且该组的血淋巴钙含量显著高于1.9%磷水平组,而与1.5%磷水平组无显著差异;1.5%磷水平组血清碱性磷酸酶活性显著高于1.1%磷水平组,但与1.9%磷水平组间无显著差异。水温和饲料磷水平之间的交互作用显著影响摄食量、磷摄入量、磷保留率、血淋巴磷含量及碱性磷酸酶活性,峰值分别发现于20/1.1、25/1.9和30/1.9、30/1.1、30/1.9及25/1.5组。另外,水体磷含量随时间延长显著升高,而20/1.5组水体磷含量极显著高于25/1.1组和30/1.1组。研究表明,当水温为30°C而饲料磷水平为1.1%时,日本沼虾的生长性能及饲料效率最优,同时其对水体中磷的排放量也较低。