昆虫杆状病毒分子生物学及其应用研究的新进展

杆状病毒是昆虫专一性的病原病毒,具有重要的应用价值。首先,杆状病毒是昆虫杆状病毒表达系统的核心部分,该系统已在药物研发、疫苗生产等方面得到广泛应用。随着杆状病毒载体的不断改进,杆状病毒表达系统获得重组病毒的几率已从最初的0.1%~1%提高到现在的80%~90%,并且出现了一些新的宿主域扩大的杆状病毒载体。其次,杆状病毒是非复制型载体,且能高效表达目的蛋白,目前杆状病毒作为基因转移载体在基因治疗中已显示出良好的应用前景。此外,杆状病毒还是一类重要的微生物杀虫剂。重组杆状病毒杀虫剂及其安全性也是目前人们关注的焦点。综述了杆状病毒分子生物学及其最新应用进展。     

植物病毒-新型的外源基因表达载体

与利用转基因植物表达外源基因相比,植物病毒载体具有表达水平高、速度快、宿主广等优点,是一类新型的外源基因表达载体.本文就植物病毒表达载体的构建策略、应用状况和存在的问题进行了综述.     

家蚕微孢子虫SWP25基因BmN细胞表达质粒的构建及表达

本研究旨在构建含家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25的家蚕卵巢细胞(BmN)表达质粒,检测该基因在宿主细胞中的表达,为在细胞水平筛选与家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25相互作用的宿主蛋白奠定基础。利用家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac表达系统,将家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25和报告基因EGFP克隆到杆状病毒转移载体pFast Bac1中,转化BmDH10Bac感受态细胞并筛选阳性重组质粒用于转染BmN细胞。经PCR技术鉴定,成功获得重组杆状病毒质粒v BmEGFP-SWP25。在转染成功的细胞中可观测到绿色荧光信号。使用Western blot方法在感染重组病毒的家蚕BmN细胞中检测到大小约55 000的重组蛋白条带,与理论值一致,表明家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25在BmN中成功表达。     

柞蚕核型多角体病毒转移载体的组建及外源基因在柞蚕蛹体内的表达

近几年,以昆虫杆状病毒为载体,表达外源基因的研究发展较快。由于杆状病毒载体具有所用的核多角体蛋白基因启动子效率高,外源基因插入容量大;重组病毒对人、畜等安全无害,所表达的外源蛋白的抗原性、免疫源性和生物学功能等均与其天然蛋白质相似等特点,因此,有关这一方面的研究日益受到人们重视。一、组建柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)转移载体的重要意义1983年,美国科学家 G.E.Smith 等采用基因工程技术首先建立了苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)载体表达系统,即以AcNPV 为载体,用培养的昆虫细胞(如 Sf9)为宿主进行外源基因的表达。从那以后,该载体表达系统得到了深入的研究和应用,一系列     

病毒介导的外源蛋白在植物中的表达

植物病毒载体是一类新型的外源基因表达载体,与利用转基因植物表达外源基因相比,植物病毒载体具有表达水平高、速度快、宿主广等优点。文章主要介绍了病毒载体的发展过程,以及病毒载体的构建策略,如“全病毒”和“重组病毒”载体策略。     

家蚕核型多角体病毒orf90基因在Bac-to-Bac家蚕杆状病毒系统中快速表达

【目的】利用BmNPV的Bac-to-Bac系统快速表达目的基因orf90,为深入研究该基因打下基础。【方法】将目的基因BmNPV orf90 克隆到转移载体pFasBacHTb上,并将报告基因egfp插入到orf90的3'末端,形成重组转移载体pFasBacHTb-egfp-90。在将其转化到含穿梭载体bacmid的感受态细胞DH10Bac中,通过转座作用,经白斑筛选得到重组穿梭载体。纯化DNA,用脂质体介导转染家蚕BmN细胞,得到重组病毒bacmid-egfp-90。【结果】转染细胞72 h后在荧光显微镜下可以观察到强烈的绿色荧光。重组病毒穿刺接种家蚕蛹,5 d后观察到很强的荧光。结果表明构建的Bac-to-Bac系统能在家蚕细胞和蛹体中正确的快速表达外源基因。【结论】证明BmNPV的Bac-to-Bac是一个快速表达系统,适合在家蚕上广泛应用。     

家蚕生物反应器表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白的免疫原性研究

将传染性法氏囊病病毒(IBDV)浙江分离株JD1的多聚蛋白(VP2/4/3)基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,重组载体与杆状病毒Bm-BacPAK6的线性化基因组DNA共转染家蚕细胞后,将获得的重组病毒BacPAK-A感染家蚕5龄起幼虫进行虫体内表达.用感染后第5日的蚕血淋巴作抗原制备油佐剂苗免疫14日龄非免疫鸡,安全性试验表明,接种1倍和5倍免疫剂量的试验鸡在临床反应和剖检中均无异常变化;在免疫-攻毒试验中设杆状病毒表达的IBDV VP2蛋白和正常蚕血淋巴免疫对照组,并于28日龄加强免疫,25 d后用IBDV强毒BC6/85攻击.通过临床保护率、病理保护率及血清学试验表明,基于多聚蛋白制备的疫苗更成功地诱导了体液免疫应答,比VP2蛋白对IBDV强毒的攻击具有更高的保护力,更适于作为IBD基因工程亚单位疫苗的抗原成分.     

用萤光抗体试验筛选能表达鸡马立克病病毒pp38基因的重组昆虫杆状病毒

用抗鸡马立克病病毒(MDV)的38Kd磷蛋白的单克隆抗体作萤光抗体试验,直接从用可转染性野生型杆状病毒AcMNPV株DNA与含MDVpp38基因的重组转基因质粒载体DNA共同转染的Sf 9单层细胞培养中筛选到能表达pp38基因产物的重组杆状病毒感染斑,并从保存于琼脂醣凝胶上的复印斑中收复并进一步克隆了该基因重组病毒.该法易于实施,即使未能熟练掌握根据杆状病毒多角体来区别野生型杆状病毒斑与基因重组病毒斑的技术,也可顺利地筛选到能表达目的基因的重组合病毒。     

柞蚕核型多角体病毒宿主载体表达系统的研究现状及展望

对构建柞蚕蛹-柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus,ApNPV)宿主载体表达系统及利用其生产有用外源基因产物的基本原理、研究进展和应用前景进行了论述。指出该系统为真核生物表达系统,与大肠杆菌等原核生物和其他昆虫杆状病毒表达系统相比,在表达出的目的基因产物特性、经济效益和产业化生产等方面均具有明显的优越性,应用前景广阔。     

piggyBac转座子在绒山羊基因组中的整合位点及其特征分析

【目的】构建piggyBac（PB）转座子表达载体系统,研究PB转座子在绒山羊基因组中的整合位点。【方法】构建pB-CMV-EGFP-Neo转座载体和pcDNA-Trans辅助载体,利用lipofectamine 2000介导共转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得稳定转染的转基因细胞系。提取转基因细胞基因组DNA,利用反向PCR检测piggyBac转座子整合位点。【结果】构建了转座系统并成功介导外源基因在绒山羊成纤维细胞染色体中整合,获得了转基因细胞系;反向PCR检测显示在绒山羊基因组中有21个PB转座子整合位点;整合位点TTAA毗邻一侧的5个碱基组成中,PB转座子3′倾向于插入到富含AT（58.35%）碱基的区域,PB转座子5′倾向于插入到富含GC（57.8%）。【结论】PB转座子可在绒山羊基因组中发生高效转座,获得的整合位点信息可为利用PB转座子开展绒山羊研究提供理论参考。     

PiggyBac转座元件的构建及其在团头鲂基因组中的转基因效率

鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的PiggyBac(PB)转座子已用于模式生物小鼠的转基因及插入诱变研究,目前,该转座子在养殖鱼类中的转基因效率如何还不清楚。构建了带PiggyBac转座子左臂、右臂、EF1α启动子和绿色荧光蛋白(eGFP)编码框的pPBs-EF1α-eGFP供体质粒。以50 ng/μL供体质粒和100 ng/μL体外转录的PB转座酶mRNA共同显微注射入团头鲂(Megalobrama amblycephala)1~2细胞期受精卵中,团头鲂eGFP的荧光表达率可达58.26%,PCR检测结果显示,该转座系统在团头鲂成鱼基因组中的整合效率为53.04%。表明PiggyBac转座子可高效介导基因在团头鲂基因组中的插入,为进一步开展团头鲂插入诱变研究奠定了基础。     

单子叶植物表达载体pUN3300的构建

植物双元表达载体在植物基因工程研究中具有重要作用,表达载体所包含的结构元件,如启动子、多克隆位点、筛选标记等,对植物遗传转化效率、外源基因表达强度及遗传稳定性等具有重要影响。本研究中,为提高目的基因对单子叶植物的遗传转化效率,对植物表达载体pCAMBIA3300进行改造,在原有以bar基因作为选择标记的基础上,采用不完全酶切的方法添加了Ubiquitin启动子,经酶切、测序表明,植物双元表达载体pUN3300构建成功。该载体对于研究外源基因功能、植物性状改良及新品种的培育,具有重要的价值。     

哈茨木霉(Trichoderma harzianum)多种胞壁降解酶基因表达载体的构建及转化水稻

为提高水稻的抗病性,利用哈茨木霉(Trichoderma hazianum)P1菌株的3个胞壁降解酶基因ech42、nag70与gluc78构建了7个植物表达载体,每个基因受独立的Act1启动子调控.构建的7个载体不仅包含3个外源基因的所有组合(A,B,C,A+B,A+C,B+C,A+B+C),而且具有双元载体本身携带的HPT基因与Gus基因,为研究不同T-DNA长度、不同基因组合与不同基因排列方向对植物遗传转化效率以及外源基因在转基因植株中表达的影响提供了一套比较完整的材料.利用本实验室的农杆菌高效转化体系,将所有组合的7个载体分别转入粳稻品种石狩白毛(Oryza sativa L ssp. Japonica cv. Ishikari-shiroge)中,共获得再生植株1800余株.对部分再生植株进行了PCR检测,证明96%的植株至少携带有外源基因中的一个,80%以上的植株整合有完整的外源基因片断.     

果树病毒载体研究进展

植物病毒载体作为重要的研究工具被广泛运用于蛋白表达、基因沉默等研究,当前普遍使用的是以烟草花叶病毒载体等为代表的草本植物病毒载体,但其大多不能侵染果树,且稳定性较差,容易丢失插入的外源基因,因此该类载体无法满足果树等多年生植物研究的需要。近年来新兴的果树病毒载体可解决这些难题,为此作者对果树病毒载体的研究进展和发展方向进行综述。当前国内外取得的研究成果主要包括：（1）通过掌握柑橘衰退病毒、柑橘叶斑病毒、李痘病毒、苹果潜隐球形病毒、葡萄病毒A和葡萄卷叶伴随病毒等果树病毒的传播途径、寄主范围、致病力分化、基因功能和表达策略等特性,采用体外转录或农杆菌介导的方式获得了上述果树病毒的全长侵染性克隆。在此基础上,通过在病毒外壳蛋白基因与其邻近的上游基因之间插入外源基因（包括荧光蛋白基因和β-葡萄糖醛酸酶基因等报告基因）,并用该病毒外壳蛋白基因的启动子或其他异源启动子驱动外源基因表达的方式,将上述6种果树病毒的全长侵染性克隆改造成为病毒载体;（2）运用果树病毒载体明确了柑橘衰退病毒、柑橘叶斑病毒、李痘病毒、苹果潜隐球形病毒和葡萄卷叶伴随病毒在植株中的分布、移动规律,及其在细胞中的定位。探寻了柑橘衰退病毒在大翼来檬上产生茎陷点症状的原因,以及交叉保护防治柑橘衰退病的主要机理。果树病毒载体还被作为病毒诱导的基因沉默载体用于基因功能和防病研究;（3）通过选用本地已经存在,且无虫传能力的弱毒株,以及对控制病毒致病和媒介传播能力的基因进行敲除、突变可以解决果树病毒载体研发过程中所遇到的安全风险。由于有些果树病毒仅分布于植株的韧皮部,因此限制了其作为病毒载体在植株中表达外源基因的范围,但由这类果树病毒构建的病毒载体稳定性极高,并且通过添加分泌信号肽基因等方式可以扩大表达产物在植株中的分布和作用范围,因此其在果树病毒研究方面仍然具有很高的应用价值。此外,采用不同病毒来源的异源启动子代替同源重复区来驱动外源基因的表达,可以进一步提高果树病毒载体的稳定性。     

外源基因高效转移与整合策略:人工引导转化系统

外源基因的引导转化是相对直接转化而言 ,包括两类蛋白分子对转移DNA的的共价结合和包被 ,涉及转移DNA复合物的形成、转移和在受体细胞核基因中的整合。认为引导转化将提高外源基因转移和整合的频率。在此认识的基础上 ,提出一个人工引导转化系统的技术方案     

从中国商陆分离的PacPAP基因转化番茄对TMV的抗性研究

以中国商陆(Phytolacca acinosa)叶片为材料,经PCR从基因组扩增克隆缺失无毒型抗病毒蛋白基因.采用叶盘法转化番茄,对转基因植株T1代摩擦接种TMV,50d后统计发病情况.结果表明:克隆得到缺失无毒型PAP基因PacPAP,大小为714bp,与美洲商陆抗病毒蛋白基因的同源性为99.7%,GenBank登陆号为AY603353;得到PacPAP整合入番茄基因组中的阳性植株11株,检测的4个转基因番茄株系均达到抗病级别,对照为感病.     

柑橘衰退病毒基因p23 RNAi载体的构建及转化

【目的】构建柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)含p23的RNAi载体,以获得具有抗性的柑橘转基因植株。【方法】基于转化病毒基因介导抗性,根据NCBI公布的CTV基因组序列,查找p23保守序列,设计并克隆两条不同长度的片段。对两条片段和植物表达载体p BI 121进行双酶切和连接来构建RNAi载体。初步预测所构建的载体发生RNAi抗病毒的可行性。利用农杆菌介导的瞬时表达技术将含RNAi载体的农杆菌注射入CTV指示植物墨西哥莱蒙的叶片,利用GUS组织化学染色法观察叶片中载体发生瞬时表达的情况。发生瞬时表达的叶片接种CTV T36基因型,利用酶联免疫反应(ELISA)检测病毒含量。同时,提取叶片的RNA并反转录为c DNA,利用实时荧光定量PCR(q-PCR)检测CTV p20,通过该基因的表达量反映叶片中的病毒含量。通过农杆菌介导的遗传转化将RNAi载体转入大红甜橙实生苗上胚轴节间茎段,抗生素筛选得到的芽嫁接至枳橙实生试管苗。提取大红甜橙叶片的DNA,通过PCR扩增确定其是否为转基因阳性;目的基因检测为阳性的植株二次嫁接至温室保存的酸橙实生苗;根据插入的p23基因序列设计q-PCR引物,检测转基因植株中p23的表达情况。取CTV T36基因型寄主的带皮芽,用腹接法接种大红甜橙转基因植株。取接种后新萌发枝梢上的叶片,用检测瞬时表达叶片同样的方法分析植株的抗病性。对于第1次接种后未检测出病毒感染的植株,进行第2次接种并检测分析。【结果】克隆得到CTV p23 513 bp的长片段和291 bp的短片段,与载体p BI121连接后成功构建含发夹结构的来自病原且能靶向目的基因的RNAi载体,命名为p23-RNAi。注射p23-RNAi的墨西哥莱蒙叶片经GUS染色后能够产生蓝色斑点,表明农杆菌p23-RNAi可以在叶片中发生瞬时表达;接种CTV后第15和30天,瞬时表达p23-RNAi的墨西哥莱蒙叶片ELISA检测结果均为阴性,同时q-PCR检测结果显示其CTV p20的积累水平和增加速度明显低于对照植株,表明瞬时表达的p23-RNAi在一定时间内可以对CTV的侵染产生抑制。p23-RNAi经农杆菌介导遗传转化大红甜橙获得抗性芽,通过普通PCR的扩增结果证明得到7个转基因植株;q-PCR检测结果进一步表明7个转基因植株间p23的含量呈现一定差异,植株E的含量最高,其次是C、F、H、A、B和G。接种CTV后,p20的表达量在7个转基因植株间也表现出一定差异,表达量最高的是植株A,其次是G、F、E、B、H、C,且与对照植株相比,呈现不同程度的抗病性。转基因植株对病毒的抗性与外源基因的表达水平没有相关性,外源基因表达水平最高的植株E并没有表现强的CTV抗性。经过两次病毒接种,转基因植株C在接种后具有完全抗性。【结论】p23-RNAi载体能引起植物抗柑橘衰退病毒;瞬时表达技术可快速鉴定RNAi载体的抗病性,有利于筛选高效率的RNAi载体。     

杜氏盐藻新型遗传转化方法的建立(英文)

本研究采用LiAc/PEG介导法首次成功地将外源基因导入盐藻细胞,组织化学染色发现转基因盐藻为蓝色,表明外源的基因在盐藻细胞中得到了成功表达。同时还进行了生长状态、转化温度、质粒浓度等因素对转化率影响的研究,优化了转化条件。结果表明,盐藻处于对数生长早期、质粒DNA浓度为600μg/ml、转化温度29℃是最理想的转化条件,其转化率为74.8‰。PCR扩增和PCR-Southern杂交结果证明,目的基因已整合到基因组中,且能够遗传。     

以吡啶硫胺素抗性基因为选择标记的红曲菌原生质体转化研究

[目的]以吡啶硫胺素抗性基因(Pyrithiamine Resistance Gene,ptrA)为选择标记基因,对红曲菌原生质体转化体系进行研究,以期为红曲菌基因功能的研究奠定基础。[方法]采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化法,将含有吡啶硫胺素抗性基因(ptrA)的pPTRⅡ质粒转入橙红色红曲菌AS3.4384原生质体中,随机挑选5个转化子,通过PCR方法和Southern杂交对转化结果进行检测,验证pPTRII质粒是否整合到转化子染色体DNA中。[结果]pPTRⅡ质粒转入红曲菌AS3.4384原生质体中的转化率为20～24个/μg,PCR检测结果显示,基因组DNA中有吡啶硫胺素抗性基因的存在,Southern杂交分析发现,ptrA基因随机整合到了转化子的染色体上,该结果表明ptrA基因可用作红曲菌转化的选择标记。[结论]该研究是吡啶硫胺素抗性基因在红曲菌中的首次转化研究,试验结果为红曲菌的基因功能研究奠定了基础。