猪细小病毒SY-99株VP2基因的序列分析

克隆并测定猪细小病毒SY－99株VP2基因，与NADL－2（4973）株、NADL－2（5075）株、Kresse株和US－1株VP2基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行比较与分析，发现PPV SY－99株与Kresse株VP2基因核苷酸和氨基酸同一性最高，推测SY－99株可能为一强毒株。     

不同毒株猪细小病毒VP2基因的克隆与序列分析

应用PCR扩增了猪细小病毒NJ-1株、NJ-2株、7909株和Vaccine株的VP2基因,分别克隆于pGEM-TEasy载体中,测定其核苷酸序列,并推导出相应的氨基酸序列,对其核苷酸和氨基酸序列进行分析和同源性比较。所测4个序列中,NJ-1株、NJ-2株和7909株序列均为1437bp,共编码479个氨基酸;而Vaccine序列为657bp,比其他毒株缺失780bp,共编码219个氨基酸。将所得4个序列与GenBank中NADL-2株、Kresse株、China株及VR-1株相应的核苷酸及氨基酸进行同源性比较,发现其核苷酸和氨基酸的同源性分别在97.7%~99.9%和97.2%~99.2%之间,具有高度同源性;通过绘制系统进化树可知,分离自国内的China株、NJ-1株、NJ-2株、7909株及Vaccine株亲缘性最为相近,与其他毒株的亲缘关系较远。     

鹅细小病毒H1株VP2基因的克隆和序列分析

参考GenBank发表的鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列，设计并合成一对引物，采用PCR方法对国内鹅细小病毒分离株H1(GPV-H1)株的结构蛋白VP2基因进行扩增，将扩增产物与pMD18-T载体连接并测序。结果表明：H1株VP2的核苷酸序列全长1764bp，编码587个氨基酸，与GenBarrk发表的GPV-B株、GPV-SHM株、GPV-YG株、番鸭细小病毒(MDPV)FRANCE株、FM株的VP2相比，核苷酸同源率分别为98．6％、96．2％、93．2％、80．3％、80．0％，推导氨基酸序列同源率分别为98．3％、97．5％、96．1％、88．2％、87．4％。     

番鸭细小病毒XX株VP2基因的克隆和序列分析

根据国内外已发表的番鸭细小病毒(MDPV)FM株和GD株基因序列,应用DNAstar分子生物学软件设计1对引物,应用PCR技术扩增MDPV XX株的结构蛋白基因VP2全基因片段。将扩增得到的VP2全基因克隆到PGEM-T easy载体上,经菌液PCR鉴定后的重组子进行序列测定。结果表明,MDPV XX株基因大小为1764bp,编码587个氨基酸,其基因序列与国内外发表的FM株、GD株核苷酸序列同源性分别为98.4%和99.8%,而与同属的小鹅瘟病毒B株核苷酸同源性仅为78.2%。可见编码番鸭细小病毒结构蛋白的VP2基因较保守,且和同属的小鹅瘟病毒明显不同,这也是该病毒目前只有一个血清型的分子基础。     

猪细小病毒VP2基因的克隆、测序与原核表达

利用PCR技术从猪细小病毒的RF DNA模板中扩增了含有VP2全基因的2.0kb的基因片段，将PCR产物克隆至pMD18-T载体，利用双脱氧末端终止法测定了VP2全基因的核苷酸序列。将所得的核心苷酸序列和推导的氨基酸序列分别与GenBank中的相应序列进行同源性比较，同源性均在99%以上，从而说明该蛋白的碱基序列和氨基酸序列均具有高度的保守性。将VP2全基因分别克隆入原核表达载体pET15(b)、pET17(b)和pET28(b)构建成表达质粒pET15bVP2、pET17bVP2和pET28bVP2；将含有VP2基因起始位点至EcoRⅠ切点间的0.8kb片段克隆入pET17(b)中构建成表达质粒pET17bVP2f。利用上述四种质粒转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况，结果发现pET17bVP2f质粒在45kD处有一特异性表达带，而其它几种质粒均未看到特异性表达带，推测VP2基因3‘端的某些结构可能对VP2全基因的表达有一定影响。这一结果对研究VP2基因的结构与功能具有重要意义。     

犬细小病毒南京株VP2蛋白免疫原性片段的克隆表达

以Protean软件对犬细小病毒南京株(CPV-GN)VP2蛋白的分子结构进行分析,从中筛选出具有良好免疫原性潜能的部分片段(VP2′片段),利用PrimerPremier5.0软件设计一对引物,用以该片段的扩增。将PCR扩增产物克隆入pMD18-T载体,构建了pMD-VP2′重组质粒。双酶切回收目的条带,将之亚克隆入表达载体pET32a(+),构建了重组表达质粒pET32-VP2′。转化宿主菌BL21,经IPTG诱导后成功表达了分子量约为34ku的融合蛋白。免疫转印显示,目的蛋白可被CPV-2b抗血清所识别,证明其具有与特异性抗体结合的抗原性,为CPV亚单位疫苗和免疫学诊断方法的研究打下基础。     

猪细小病毒SC-1株VP2基因的克隆及生物信息学分析

根据PPVNADL-2株基因组序列设计了一对引物,以复制型DNA为模板,通过PCR扩增出长约2.0kb的DNA片段,将其插入克隆载体质粒pUC19,构建重组质粒pPVP2,测序显示PPV-SC-1VP2基因全长1740bp,共编码579个氨基酸。多序列比对结果显示,猪细小病毒VP2基因保守性强,仅存在个别的差异;密码子偏向性分析结果表明,PPV-SC-1VP2基因在同一氨基酸的不同密码子的选择上存在一定的偏向性,并且与PPV-SC-1NS1在密码子的偏向性上具有相同的属性,主要偏向于使用以A结尾的密码子;氨基酸疏水性分析表明,PPV-SC-1VP2蛋白在77~82、291~304、362~373、400~411、465~477等位点存在较明显的亲水区段;跨膜区结构分析显示该蛋白不存在显著意义的跨膜区;分析该蛋白的抗原位点可能位于60~68、81~88、266~275、351~357、398~404位点处。     

番鸭源鹅细小病毒ZQ株VP2基因的克隆和序列分析

根据国内外已发表的鹅细小病毒(GPV)B株和GD株基因序列,应用DNA Star分子生物学软件设计一对引物,应用PCR技术扩增GPV ZQ株的结构蛋白基因VP2全基因片段。将扩增得到的VP2全基因克隆到pMD18-T载体上,获得的重组质粒经PCR鉴定后进行序列测定。结果表明ZQ株基因大小为1 764 bp,编码587个氨基酸,其基因序列与GPV参考毒株推导的氨基酸序列同源性在89.1%~99.3%之间,差异较大;与番鸭细小病毒(MDPV)参考毒株相比同源性在92.0%~92.5%之间,超过与部分GPV毒株的同源性,推测可能与该毒株来源于番鸭而不是鹅有关,另外也在基因水平上解释了GPV与MDPV在血清学上存在交叉反应的部分原因。     

鹅细小病毒VP1基因的克隆及序列分析

参照GenBank中收录的鹅细小病毒(GPV)B株基因序列设计并合成了扩增GPV H1株VP1的1对引物，利用PCR技术扩增出长约2．2kb的目的片段，将其克隆到pMD 18-T载体上，进行了序列测定及分析。测序结果表明，GPV H1株VP1基因由2199个核苷酸组成，编码732个氨基酸。经与B株、YG株进行同源性比较，核苷酸的同源性分别为98．50％和93．18％；推导的氨基酸同源性分别为98．09%和95．77％。     

猪细小病毒PPV-SD1株VP2全基因的克隆及原核表达

为研究猪细小病毒PPV-SD1分离株的VP2蛋白的结构与功能,自行设计引物,通过PCR扩增的方法,获得VP2全基因,克隆到pMD18-T载体中进行测序,然后亚克隆到pET30a(+)表达载体中,构建并筛选出阳性重组子,标记为pET30a-VP2。将阳性重组质粒转化进RosettaTM宿主菌中,通过改变IPTG浓度、诱导温度和诱导时间,使重组蛋白获得表达,并确定最佳诱导条件为:IPTG终浓度1.0 mmol/L、诱导温度37℃、诱导时间为3~4 h。经SDS-PAGE和Western-blotting分析表明该重组蛋白相对分子量约为68 ku,具有良好的免疫学活性。     

猪细小病毒自然弱毒N株VP1基因的扩增与序列分析

对猪细小病毒自然弱毒N株（PPV—N株）VP1基因扩增及测序,利用生物信息学技术预测VP1蛋白的二级结构与B细胞抗原表位,以及分析该蛋白的氨基酸差异位点及密码子偏爱性。结果表明,PPV—N株VP1基因与弱毒参考毒株NADL-2VP1基因同源性最高,亲缘关系最近。PPV—N株VP1蛋白的二级结构较为复杂,以β-折叠为主,并有较多的转角和无规则卷曲区域,在序列的20～56、61～80、86～130、136～188区域为B细胞抗原表位的优势区域。PPV强、弱毒株VP1蛋白存在5个氨基酸差异位点（T-365-I,G-528-D,Q-533-H,P-586-S,K-715-R）,这些位点处氨基酸残基抗原性与毒力成正相关。PPV—N株VP1蛋白在A、C、E、G、H、I、K、N、Q、R、S、T、V和Y氨基酸于密码子选择上存在一定的偏爱性。     

贵阳地区犬细小病毒VP2基因的克隆及遗传进化分析

为研究贵阳地区犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）的流行基因型及其遗传进化情况,本试验对从贵阳市分离的10株CPV的VP2基因进行PCR扩增和克隆并进行序列分析。结果显示,分离的病毒能使F81猫肾细胞产生明显的细胞病变（CPE）,分离的10株病毒中,7株为CPV-2a亚型,3株为CPV-2c亚型,命名为GY-1~GY-10。10株CPV分离株与疫苗株VP2基因的同源性98.4%~99.4%,与其他国内外参考株的同源性为97.7%~99.9%。本试验首次报道贵阳市CPV的流行基因型为CPV-2a亚型并伴随CPV-2c亚型存在,对监测CPV遗传变异趋势及疫苗的研制具有重要意义。     

Cloning and Phylogenetic Analysis of VP2 Gene of Canine Parvovirus in Guiyang Area

This study was aimed to investigate popular genotype and phylogenesis of VP2 gene of canine parvovirus (CPV) in Guiyang area. Ten strains of viruses were isolated from Guiyang and the VP2 gene was amplified by PCR, cloned and sequenced. Results showed that the isolate virus grew could produce typical CPE in F81 cells, seven strains of CPV were CPV type 2a and others were CPV type 2c, named as GY-1 to GY-10. The nucleotide homologies of the isolated strains compared with 3 vaccine strains were 98.4% to 99.4%, with others reference strains nucleotide homologies within 97.7% to 99.9%.This research firstly reported the prevalence of CPV genotype was CPV type 2a in Guiyang area with such CPV type 2c, this was very important for monitoring the trend of CPV genetic variation and the development of vaccine.     

南宁地区犬细小病毒VP2基因的克隆及遗传进化分析

为了解广西南宁地区犬细小病毒（CPV）的流行现状与病毒变异情况,本试验对初步确诊为犬细小病毒病的12份阳性病料提取基因组DNA,以提取的基因组DNA为模板,通过PCR扩增VP2基因序列并测序,将12个阳性毒株样本VP2基因测序结果与GenBank中登录的17株国内外CPV分离株VP2基因进行同源性比对,采用Mega 7.0软件绘制遗传进化树,分析其病毒亚型和遗传进化情况。结果显示,成功扩增得到12个毒株样本的VP2基因片段,大小约1 755 bp,12株阳性样本毒株的VP2基因同源性在99.2%~100.0%之间,其中NN01与NN07、NN02与NN06同源性最高,为100.0%;阳性样本毒株与国内其他分离株VP2基因的同源性为97.6%~100.0%,其中NN08、NN10及NN04与CPV-ZJ1579同源性最高,均为100.0%,属于CPV-2a亚型;阳性样本毒株与国外代表性毒株同源性在98.1%~99.8%之间。遗传进化树分析表明,12个样本毒株中有3株属于CPV-2a亚型,3株属于CPV-2b亚型,6株属于CPV-2c亚型。这是继2018年初广西分离到CPV-2c型CPV后,首次发现南宁地区大规模流行CPV-2c亚型病毒,预示着CPV-2c亚型CPV在国内的流行正在增加。综上所述,广西南宁地区CPV-2a、CPV-2b与CPV-2c亚型并存,但CPV-2c亚型的比重比其他地区大,这也给该地区提供了新的防治信息,在实际CPV防控工作中除了对CPV-2a、CPV-2b等传统流行亚型的关注之外,更应该重视CPV-2c亚型CPV的防控。     

广州地区犬细小病毒VP2基因的序列分析

犬细小病毒病是一种高度接触性传染病,临床上以急性出血性肠炎和心肌炎为特征。为研究广州地区犬细小病毒病的流行亚型,本试验采集2011—2012年间疑似病犬粪便,进行犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）分离鉴定,提取病毒基因组进行VP2基因扩增和序列分析,与GenBank中登录的参考毒株进行比对,结果发现,分离的8株CPV中SCAU-5为CPV-2b 亚型,其余为CPV-2a亚型。结果表明,2011—2012年间广州地区的流行毒株以CPV-2a亚型为主。     

猪细小病毒结构蛋白VP2及其疫苗的研究进展

猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍性疾病的主要病原之一,该病毒在世界范围内广泛存在并呈地方性流行, 给生猪的繁殖、发展带来了巨大的经济损失,故防制猪细小病毒病非常重要。PPV VP2蛋白是病毒粒子的主要衣壳蛋白,在体外能自我装配成病毒样颗粒,并能刺激机体产生抗PPV中和抗体,且可作为抗原转运载体,所以研究VP2对PPV新型疫苗研制至关重要。文章综述了猪细小病毒结构蛋白VP2及其疫苗的研究进展。     

猫细小病毒CC 1株VP1基因克隆与序列分析

根据GenBank登录的猫细小病毒(CU-4)VP1基因序列,设计了1对引物,用PCR技术对VP1基因进行整体扩增,将扩增产物纯化后克隆入PGM-T载体,通过酶切、PCR和测序进行验证。结果表明,测序拼接得出VP1基因的序列长度约为2306 bp,该基因的ORF总长为2184 bp,编码727个氨基酸,应用DNAStar软件把所测得的序列与国内外代表性毒株的VP1基因编码区全长核苷酸序列和氨基酸序列进行比对分析,发现CC-1株与国内XJ-1株的核苷酸和氨基酸同源性均为99.3%。