甘蔗锌指蛋白ShZP基因正义反义植物表达载体的构建及转化烟草

根据本实验室克隆的甘蔗锌指蛋白ShZP基因cDNA序列,在开放阅读框两侧设计特异引物,通过PCR扩增引入相应的酶切位点,把甘蔗ShZP基因的编码区(大小为725bp)cDNA片段,分别以正向和反向插入到中间载体pCRBI的Prd29A启动子和NOS终止子之间,构建了其正义植物表达载体pCRBIShZP和反义表达载体pCRBIantiShZP.采用冻融法分别将pCRBIShZP和pCRBIantiShZP导入根瘤农杆菌菌株EHA105中,通过农杆菌介导法对烟草进行转化,经过12mg/L的PPT连续抗性筛选,共获得23株抗性植株,对其中的5株转正义基因烟草植株和9株转反义基因烟草植株进行PCR检测,分别获得3株转正义基因的阳性植株和4株转反义基因的阳性植株.PCR检测结果初步证明外源甘蔗锌指蛋白ShZP基因已成功整合到烟草基因组中,这一研究为植物抗逆基因工程研究打下了一定的基础.     

CryIA(c)基因植物表达载体的构建及转基因甘蔗的获得

构建了玉米UBI启动子驱动Bt CryIA(c)基因的高效植物表达载体pUBTC,通过农杆菌介导法导入甘蔗愈伤组织,经过除草剂PPT 3次连续筛选,获得89株抗性植株,经过PCR扩增检测,得到71株阳性植株,对其中7株进行RT-PCR检测,证明外源基因已经成功的整合到甘蔗基因组中,并得到有效的表达。     

Cry1Ab基因转化甘蔗及转基因抗虫植株的获得

构建玉米UBI启动子驱动Bt Cry1Ab基因的高效植物表达载体pUBTB，通过农杆菌介导法导入甘蔗愈伤组织，经过除草剂PPT三次连续筛选，共获得67株抗性植株，经PCR扩增检测，得到22株阳性植株，并对其进行RT-PCR检测，证明外源基因已经成功整合到其中的15株甘蔗基因组中，且得到了有效的表达。     

甘蔗锌指蛋白基因ShSAP1的RNAi载体构建及对甘蔗的转化

植物中具有A20/AN1锌指结构域的蛋白参与了逆境应答,为研究甘蔗A20/AN1型锌指蛋白基因ShSAP1的功能及在甘蔗抗逆育种方面的价值,本研究通过构建ShSAP1基因的RNAi载体并进行甘蔗的遗传转化,以期通过反向遗传学进行ShSAP1的功能分析。将ShSAP1锌指编码区片段分别以正向和反向插入到中间载体pTCK303内含子的两侧,构建中间载体pTCK-iShSAP1,而后把干扰片段连入pCAMBIA-GUS中,获得RNAi表达载体pCAMBIA-iShSAP1,将该载体转导根癌农杆菌EHA105,通过农杆菌介导法侵染甘蔗胚性愈伤组织,并对部分转化幼苗进行了初步的PCR鉴定。经过限制性内切酶分析和测序验证,RNAi载体pCAMBIA-iShSAP1构建成功;转化幼苗经PPT抗性筛选后,获得了58株抗性植株,对抗性幼苗进行了Bar基因的PCR检测,得到6株PCR阳性植株。本研究完成了ShSAP1的RNAi载体构建及对甘蔗的遗传转化,为ShSAP1的功能研究打下了一定的基础。     

GNA基因表达载体的构建及遗传转化甘蔗

利用经人工改造的gna基因分别与Ubi、Rbcs启动子组合,构建抗虫植物表达载体pUNG和pRNG,通过农杆菌介导法导入甘蔗愈伤组织,经PPT筛选和PCR检测,获得Ubi-gna转基因植株124株,Rbcs-gna转基因植株35株。对部分转基因植株进行RT-PCR检测,初步证明外源基因已经整合到甘蔗基因组中,并得到有效表达;对RT-PCR阳性植株进行GNA(植物外源凝集素)活性测验,结果表明,甘蔗叶片表达的凝集素可以使健康公鸡的红细胞凝集,初步证明表达的GNA具有正常的生物学活性。     

农杆菌介导法向小麦茎尖导入DREB1A基因的研究初报

为了研究以小麦茎尖为受体进行农杆菌转化的可行性,选用小麦品种H6756,以茎尖为受体进行了农杆菌转化.构建了含有拟南芥逆境诱导转录因子DREB1A及除草剂bar基因的表达载体pC3300IS-DREB1A,酶切鉴定此载体,结果证明其连接完全正确,具有转录和表达的功能.农杆菌介导法向小麦茎尖导入DREB1A基因,共获得247株转化苗.转化苗经除草剂筛选,获得66株抗性苗,对抗性苗进一步进行PCR检测,有30株抗性苗扩增出特异性片段,转化率达到12.1%,初步说明本试验中以小麦茎尖为受体的转化系统用于基因转化是可行、高效的.     

甜菜磷酸蔗糖合成酶的转基因研究

将甜菜磷酸蔗糖合成酶(Beta vulgaris sucrose phosphate synthase,BvSPS)基因构建到植物表达载体pBI121上,利用农杆菌介导法对甜菜叶柄进行遗传转化.通过对转基因体系的优化,确定了农杆菌浓度OD.为0.6时,叶柄外植体经过2d的预培养,农杆菌侵染5mn,侵染受体共培养4d后,所获得的Kana抗性芽率最高.在所获得的27株Kana抗性植株中,通过提取甜菜基因组DNA及PCR鉴定,有8株成功整合了BvSPS基因,阳性率达到29％.     

Cry1Ac和sck双价抗虫基因遗传转化甘蔗的研究

将双价抗虫基因,即修饰的苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因(Cry1Ac)和修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)导入甘蔗优良品种ROC22,获得潮霉素抗性转化植株95株,35株能检测到外源抗虫基因,获得的13株RT-PCR双基因均呈阳性的甘蔗植株,斑点杂交检测有4株呈阳性。结果表明:外源抗虫基因已导入甘蔗基因组中。     

AGPase基因转化木薯获得转基因植株的研究

通过农杆菌介导法将一个提高淀粉含量的AGPase基因在块根特异启动子的调控下成功导入木薯华南8号(SC8)基因组,并获得转化抗性再生植株25株,转化率为1.20%。经生根初筛有19株转化植株能在抗性生根培养基生根,经PCR、Southern等分子检测证实这19株转化植株为转基因植株。     

转cry 1Iem基因大豆的培育及抗虫性检测

以大豆子叶节为外植体,应用农杆菌介导法,将抗虫(cry1Iem)基因转化大豆.筛选标记为bar基因.经Glufasinate筛选,获得大量抗性植株.对转基因T_0、T_1、T_2代植株进行PCR检测,初步证明cry1Iem基因已经整合到大豆基因组中.对T2代PCR阳性植株幼嫩豆荚,采用圆盘分隔法接人初孵幼虫,进行初步的抗虫性检测,得到1株具有明显抗虫效果和7株抗虫效果较好的转基因植株.     

抗花叶病转SrMV-P1基因甘蔗的活性氧代谢分析

转SrMV-P1基因甘蔗经过2个世代的试验,表现出对甘蔗花叶病一定的抗性,但不同转基因无性系中,其抗性呈现出不同程度的分化.本研究以受体材料(FN95-1702)和空转对照P7(未插入外源基因SrMV-P1的载体)为对照,以国家发明专利授权的转基因无性系TF53和T64为试验材料,研究其在不同甘蔗花叶病毒剂量,以及载体效应和外源基因效应作用下的活性氧代谢分析,从代谢水平上解析转基因材料抗性呈现不同分化规律的机理.结果表明:转基因无性系在较高病毒剂量胁迫下,通过活性氧代谢相关指标的变化对病毒侵染起到应激作用;载体效应和外源基因效应对活性氧代谢影响存在一定差异,这段差异时期也主要发生在较高病毒剂量的情况下;外源基因对不同无性系中活性氧代谢的影响,表现在高病毒剂量的作用下,其活性氧代谢相关指标在变化幅度上存在一定差异,导致其对病毒的抵御能力上的不同,这可能是转SrMV-P1基因抗性分化的生理基础.     

甘蔗黄叶病毒与花叶病毒CP基因RNAi载体构建与转化甘蔗研究

甘蔗黄叶病和甘蔗花叶病是我国甘蔗最主要的病毒病,感病品种产量下降和品质变劣,传统方法难以防治。RNA干扰技术使培育抗病毒甘蔗品种成为可能。本研究根据甘蔗黄叶病毒和侵染甘蔗的高粱花叶病毒结构与功能特性,广泛收集不同来源病毒分离物CP基因序列,经过比对选取保守序列作为干扰序列。通过在序列两端添加酶切位点,合成并连接成双价甘蔗黄叶病和花叶病毒干扰序列,然后构建到中间载体p HANNIBAL上,形成双价RNAi干扰结构,最后插入到p ART27上形成干扰表达载体。利用基因枪轰击甘蔗品种福农15号愈伤组织进行转化,经G418筛选获得抗性再生植株。通过提取DNA和RNA分析,证实双价RNAi干扰结构不仅以不同拷贝整合到甘蔗基因组中,而且得到了转录表达。     

抗花叶病转基因甘蔗安全性评价

根据国内外研究进展与本实验室的最新研究成果,综述了甘蔗抗花叶病转基因甘蔗的食品安全、土壤生态安全、基因漂移、病毒的异源包装和重组、转基因杂草化等方面的研究进展.     

抗花叶病转SrMV-P1基因甘蔗的产量和糖分分析

结合国家转基因中间试验,在通过2 a的完全随机区组试验对转SrMV-P1基因甘蔗的发病率调查的基础上,进行产量和糖分性状分析。结果表明,SrMV-P1基因能够有效地提高甘蔗抗花叶病能力。对转基因甘蔗2个世代的田间发病率进行调查,转基因甘蔗的发病率都低于5％,转基因甘蔗田间发病率明显低于受体材料FN95-1702（对照1）与空载对照P7（只含标记基因的载体转化后获得的植株,对照2）,其中TF64表现高抗,2 a均未发病。利用模糊数学隶属函数对转基因无性系进行综合评价,结果表明,转基因无性系在产质量性状方面的     

大豆抗病相关基因SR1正反义植物表达载体的构建及遗传转化研究

实验构建了CaMV35S启动子控制下的大豆抗病相关基因SR1的正反义植物双元表达载体pBISR1( )和pBISR1(-).通过根癌农杆菌叶盘转化法,将正义和反义SR1基因导入烟草Ha-vana 425,经卡那霉素筛选,获得了抗性植株.经PCR和PCR-Southern印迹分析,证明抗性植株中整和了SR1基因,RT-PCR分析进一步表明正义和反义基因皆能转录为完整的mRNA,经疫霉根腐接种及抗病性鉴定表明,转反义基因株系和未转基因株系均轻微感病,而转正义基因株系始终没有出现感病症状.     

甘蔗主要亲本自然条件下抗甘蔗花叶病测定

选用国内外102份甘蔗亲本连续3年在甘蔗花叶病高发病生态区测试其抗性表现,以了解甘蔗常用亲本对甘蔗花叶病的抗性,为甘蔗抗花叶病育种亲本选配提供参考。结果表明,甘蔗花叶病发病症状以长条纹线条花叶病为主,其次是褪绿花叶病、褪绿花叶病+长条纹线条花叶病混合类型;花叶病发病率属遗传力中等偏高性状,受到调查时期、年度和植期的影响,随着花叶病发病率的升高,甘蔗株高、有效茎数和蔗产量都将明显下降,耐寒性也将减弱。抗性评价表明102份测试亲本中,GT03-2309、GT02-761和ROC26等8份亲本表现高抗,占7.84%;GT03-713、LC03-296和GT03-557等47份亲本表现抗病,占46.08%;CP09-4257、FN39和GT04-2679等44份亲本感病,占43.14%;GT04-2724、YT93-373和YG24三份亲本高感花叶病,占2.94%。与20年前相比,抗病亲本数量增多,说明抗甘蔗花叶病育种取得了较为良好的进展。     

基于近等基因导入系发掘玉米抗甘蔗花叶病毒主效基因

利用玉米自交系掖478与中自01构建近等基因导入系群体(BC4F2),通过田间人工接种甘蔗花叶病毒鉴定获得抗病植株。采用38个SSR标记分析抗病株基因型,通过连锁不平衡分析,在玉米第3和6染色体上发掘3个主效抗病QTL。第3染色体上的QTL置信区间为26.1cM-phi053-5cM;第6染色体上的QTL置信区间分别为1.2cM-bnlg161和5.3cM-bnlg1538-7cM。建立了基于近等基因导入系发掘玉米抗甘蔗花叶病毒主效QTL技术,获得了一批含有抗病毒QTL的近等基因导入系,为抗病育种提供了信息和材料。     

甘蔗花青素转录因子基因ScRS克隆与基因枪转化研究

花青素不仅是天然色素,而且具有保健功能。花青素转录因子基因对于调控花青素的合成具有关键作用。本研究根据玉米花青素转录因子基因RS序列设计引物,利用同源克隆技术,得到甘蔗花青素转录因子基因ScRS的全长序列;在ScRS序列两端分别添加KpnⅠ、SalⅠ酶切位点,构建植物表达载体pCAMBIA1301-35SN-ScRS,包被微粒载体通过基因枪对甘蔗愈伤组织进行轰击,转化的愈伤组织明显呈紫红色;将紫红色愈伤组织分化培养获得再生甘蔗植株,经PCR检测,获得转ScRS基因阳性植株,初步证实利用克隆的基因转化甘蔗可以使愈伤组织显色。研究结果对于建立新型的遗传转化可视化示踪体系和培育高花青素甘蔗品种具有重要意义。