猪圆环病毒2型ORF2基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

为探索猪圆环病毒2型ORF2基因(PCV2 ORF2)的高效表达,本实验将ORF2基因整合到酵母表达载体p GAPZαA中,构建重组质粒p GAPZαA-ORF2。通过AvrⅡ酶切线性化,经电穿孔法转到毕赤酵母菌X33中。经ZeocinTM抗性筛选得到转化子,在GAP强启动子调控下,通过SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定,结果证实Cap蛋白在酵母载体p GAPZαA中得到成功分泌表达。     

巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展

第一个被选择用于表达外源蛋白的是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),人们对其基因操作和生物学特性比较了解,长期用于发酵的经验也显示其安全可靠.然而实践证明,酿酒酵母表达系统也有其局限性,如缺乏强有力的启动子、分泌效率差、表达菌株不够稳定、表达质粒易于丢失等,也不是理想的外源基因表达宿主.     

禽传染性支气管炎病毒S1基因在毕赤酵母中的表达

根据GenBank已公布的传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)株S1基因序列及pPIC9K表达载体序列,设计1对IBV S1基因表达片段的PCR引物,用RT-PCR方法扩增出长度为1 566 bp IBV S1基因表达片段,5′端不含信号肽序列,3′端添加了终止密码子。用限制性内切酶SnaB和Not将S1基因和载体pPIC9K酶切回收后连接,构建了重组表达载体pPIC9K-S1。用限制性内切酶Bgl将表达质粒pPIC9K-S1线性化,然后用电转化的方法导入毕赤酵母GS115,在MD平板上生长的转化子经过PCR鉴定和表型筛选后,获得了整合型阳性重组菌株GS115/pPIC9K-S1 His Muts。将重组菌株在1%甲醇中进行诱导分泌表达,并对表达产物进行SDS-PAGE、Western blot分析。结果显示,IBV S1基因在毕赤酵母中成功获得了表达,表达蛋白的分子量约为76 000,能与IBV阳性血清特异性结合,表达的蛋白占上清中总蛋白量的12.5%。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段在巴斯德毕赤酵母KM71中的表达

猪传染性胃肠炎(TGE)是猪的一种急性、高度接触性传染病,各种年龄及品种的猪对本病均易感,其中2周龄以下仔猪的死亡率可达100％.该病病原为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV).TGEV S蛋白(或称E2蛋白)形成病毒粒子表面的突起,携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇.S蛋白含有4个抗原位点,从氨基末端开始依次定为C、B、D和A,4个抗原位点都位于S蛋白N端543个氨基酸残基之内[1-2].本试验在巴斯德毕赤酵母KM71中表达了TGEV S蛋白B、C抗原位点片段,为建立TGE血清学检测方法提供必要的物质基础.     

浅析巴斯德毕赤酵母表达系统的研究

对于一个有商业潜质和广阔市场前景的兽用蛋白质类药物的研究,主要是要寻找一条稳定的工艺条件和获得较高的工作效率,巴斯德毕赤酵母表达系统就具有这方面的优点,其优越性表现在：分泌性表达,不需要复性,有效率为100%,纯化程序简单,大大降低了生产成本,尤其适用于动物干扰素的表达。     

巴斯德毕赤酵母表达系统在动物传染病防制中应用的研究进展

本文以巴斯德毕赤酵母表达系统在动物传染病防制过程当中的应用研究进展为中心论点,指出了在社会各界对于生物学相关知识的在不断的增多、以及酵母遗传研究深入发展背景下,动物传染病防制的重要意义,并就巴斯德毕赤酵母表达系统的相关优势进行了简要探讨(主要包括操作性高、表达量高、以及成本投入低这几个方面),进而就其在动物传染病防制过程中的相关问题展开了深入探讨,望能够引起各方工作人员的特别关注与重视。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因在酵母中的表达

为探索猪圆环病毒Ⅱ型(PCVⅡ) ORF2基因的高效表达,将ORF2基因整合到酵母表达载体pPICZαC中,构建重组质粒pPICZαC-ORF2,通过SacⅠ酶切线性化,经电穿孔法转到毕赤酵母菌SMD1168。经Zeocin^TM抗性筛选得到转化子,通过SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定,结果表明衣壳蛋白在酵母菌中成功分泌表达。     

传染性法氏囊病毒免疫原基因在毕赤酵母中的高效分泌表达

从国内分离的鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）众多流行株中获得超强毒株（vvIBDV）,应用RT-PCR方法,扩增得到IBDV主要保护性抗原VP2基因的开放编码框,克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαA,将该重组质粒pPICZαA-VP2以电转化方法转入毕赤酵母X-33感受态细胞中,通过PCR鉴定、表型筛选和抗生素浓度梯度筛选,获得高拷贝阳性重组酵母菌株X-33-pPICZαA-VP2。经摇瓶诱导表达试验获得稳定高效分泌表达的酵母工程菌,表达量为0.459mg/ml,聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、免疫印迹（Western-blot）以及动物试验表明,重组酵母工程菌表达的目的蛋白具有鸡传染性法氏囊病病毒天然蛋白的生物活性和免疫原性。     

牛病毒性腹泻病毒E2基因在毕赤酵母GS115中的表达与鉴定

将牛病毒性腹泻病毒(BVDV)河北分离株HB-bd毒株E2基因去除跨膜区获得sE2基因,将sE2基因克隆入巴斯德毕赤酵母(P.Pastoris)分泌型表达载体pPIC9K中,筛选培养后提取阳性重组质粒,经酶切和PCR鉴定,命名为pPIC9K-sE2.重组质粒pPIC9K-sE2经Sal Ⅰ酶切线性化,电穿孔导入P.Pastoris GS115基因进行整合,使外源基因sE2稳定地整合到P.Pastoris染色体中,G418筛选得到阳性高拷贝转化子GS115-pPIC9K-sE2.经甲醇诱导表达后,sE2融合蛋白获得了表达,表达产物经SDS-PAGE、Western-blot和Dot-ELISA分析,确定其表达的sE2融合蛋白相对分子质量大小为37 000,且具有天然蛋白的抗原特异性.免疫原性研究证明P.Pastoris表达的sE2蛋白能刺激动物产生特异抗体.     

牛病毒性腹泻病毒E2基因在毕赤酵母GS115中的表达与鉴定

将牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea-mucosal disease virus,BVDV)河北分离株HB-bd毒株E2基因去除跨膜区获得sE2基因,将sE2基因克隆入巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)分泌型表达载体pPIC9K中,筛选培养后提取阳性重组质粒,经酶切和PCR鉴定,命名为pPIC9K-sE2。重组质粒pPIC9K-sE2经SalⅠ酶切后,电穿孔导入P.pastorisGS115基因进行整合,使外源基因sE2稳定地整合到P.pastoris染色体中,G418筛选得到阳性高拷贝转化子GS115-pPIC9K-sE2。经甲醇诱导表达后,sE2融合蛋白获得了表达,表达产物经SDS-PAGE、Western-blot和Dot-ELISA分析,确定其表达的sE2融合蛋白相对分子质量大小为37 000,且具有天然蛋白的抗原特异性。免疫活性研究证明,P.pastoris表达的sE2蛋白能刺激动物产生抗体。     

毕赤酵母在基因克隆与表达中的应用

随着分子生物学及基因工程的发展,利用自身基因在外源细胞中的克隆与表达也受世人关注。生物表达系统的出现满足了科学发展的要求,并渐渐成为处理工农生产以及医疗卫生等领域问题的重要手段之一[1]。近年来,蛋白表达系统已有原核表达系统、真核表达系统、哺乳动物表达系统和昆虫细胞表达系统等。不同的表达系统,其有不同的特点。如原核表达系统主要是大肠杆菌,其表达体系相对简单,目的蛋白无法经     

印第安纳型水泡性口炎病毒核衣壳蛋白基因在毕赤酵母表达系统中的表达

将含有IN型VSV核衣壳蛋白基因的重组质粒pET-32a/N用EcoRI和NotI进行双酶切,目的基因克隆到表达载体pPICZαA,构建重组质粒pPICZαA/N。用SacI酶切线性化,并以电转化方法转化受体酵母菌GS115,PCR证实目的基因整合到重组酵母菌染色体中,经鉴定所获得的重组酵母菌株为Muts表型。用甲醇对重组酵母进行诱导表达,经SDS-PAGE和Westernblot鉴定,核衣壳蛋白基因在毕赤酵母中获得表达,目的蛋白分子量大小为约75kDa,表达量约占菌体总量的20%,并能够被VSV阳性血清所识别,可用于VSV的血清学检测。     

口蹄疫病毒RNA聚合酶3D基因在毕赤酵母中的表达

以口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)RNA聚合酶基因3D为研究对象，对其部分碱基进行定点诱变，替换成在毕赤酵母(Pichia pastoris)中使用频率较高的密码子以优化其表达。改造后的目的片段用NotⅠ和AvrⅡ内切酶双酶切，然后与相应内切酶双酶切的穿梭载体pPIC9K相连接，构建重组表达载体pPIC9K／3D，转化大肠埃希氏菌JM109，筛选阳性克隆pPIC9K／3D。经测序表明，插入位置、突变碱基、片段大小和读码框均正确。重组质粒用SacⅠ内切酶线化，电转化毕赤酵母SMD1168，采用G418抗性梯度法筛选，获得高拷贝整合重组菌株SMD1168／pPIC9K／3DHIS^ MUT^ ，利用甲醇进行诱导分泌表达，经SDS-PAGE和Western blotting鉴定，3D基因在毕赤酵母中表达成功，目的蛋白分子质量大小为52ku，与预期的大小吻合，并能够被FMDV阳性血清所识别，表达量占总分泌蛋白量的36％。     

HSN1亚型禽流感病毒NA基因在重组禽痘病毒中的表达及其产物的免疫原性

将禽流感病毒A／Goose／Guangdong／1／96（H5N1）株的NA基因及LacZ报告基因克隆到禽痘病毒载体pSY681中，构建重组转移载体pSY（NA＋LacZ），将其转染鸡胚成纤维细胞，经蓝白斑筛选，纯化表达NA基因的重组禽痘病毒rFPV-NA，用其免疫SPF鸡，检测该重组禽痘病毒的免疫原性。结果显示，该重组禽痘病毒能够在体外培养细胞内表达具有生物学活性的NA蛋白，表达产物的分子质量约为55ku；用该重组禽痘病毒免疫SPF鸡后，能够使免疫鸡获得对H5N1和H7N1两种亚型HPAIV攻击的部分保护。表明，重组禽痘病毒rFPV—NA具有良好的免疫原性。     

禽传染性支气管炎病毒M基因在毕赤酵母中表达与蛋白反应活性检测

将禽传染性支气管炎病毒(IBV)M基因克隆到毕赤巴斯德表达载体pPIC9K中,构建了重组表达载体pPIC9K-M,电击转化毕赤巴斯德酵母GS115,经MD和MM平板筛选和PCR鉴定后,采用G418抗性梯度筛选得到高拷贝重组菌株GS115/pPIC9K-M His~+Mut~+,重组菌株用1%的甲醇诱导分泌表达,并对表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析.结果表明,IBV M基因在毕赤酵母中成功获得了表达,表达蛋白的相对分子质量约为33 000,能与IBV阳性血清特异性结合.将表达蛋白初步纯化后作为包被抗原,ELISA检测结果显示表达蛋白与特异性抗体反应良好,表明表达的M蛋白生物学活性良好.本研究表达的IBV M蛋白可作为制备IB诊断抗原的基础材料,对IB的防治有重要理论和实用价值.     

番鸭细小病毒VP2基因在毕赤酵母中的表达及表达产物的鉴定

通过DNA重组技术,将克隆到的MDPV-Q和MDPV-26的VP2基因片段,经两种限制性核酸内切酶SaclI和Kp-nl的酶切,将酶切产物再克隆到表达载体pPICZαA中,得到表达重组质粒pPICZαA-M-Q VP2和pPICZαA-M-26 VP2.将这两种表达重组质粒分别转化到毕赤酵母(Pichia Pastoris X-33)中进行表达,经甲醇诱导和SDS-PAGE分析结果表明,MDPV-QVP2和MDPV-26 VP2基因片段的表达产物大小约为73kD,与理论预计相符.此外,本研究还意外地发现,重组质粒转化到酵母菌进行表达,在表达VP2结构蛋白的同时,还表达了一条大小约为60kD的蛋白条带.     

重组山羊FSH基因在毕赤酵母中的高效表达

为探讨快速高效表达山羊FSH（促卵泡素）基因的方法,将获得的FSHα,β亚基基因克隆到毕赤酵母快速表达载体pPICZαA中,然后将构建的载体线性化处理后,电击转化至毕赤酵母GS115中,经Zeocin抗生素筛选后获得阳性菌落,经甲醇诱导表达后进行SDS-PAGE和Western–blot分析。结果表明：pPICZαA载...     

微小隐孢子虫P23基因在毕赤酵母中的表达及初步应用

为将微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)P23基因在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)系统中进行表达,利用表达蛋白初步建立隐孢子虫病间接ELISA诊断技术,设计引物从微小隐孢子虫基因组DNA中扩增P23基因序列,构建pPIC9K-P23重组质粒,在毕赤酵母中进行表达,用阴离子交换层析柱进行纯化。以重组P23纯化蛋白为抗原建立间接ELISA检测方法,对现场采集的猪血清样品进行检测。SDS-PAGE显示所表达的蛋白大小约为23 kDa。Western blot检测表明该蛋白能与兔抗P23蛋白血清特异性结合。用建立的间接ELISA技术对186份猪血清样品进行检测,阳性率为83.3%。本研究获得了真核表达的P23重组蛋白,初步建立了微小隐孢子虫病间接ELISA诊断技术,为隐孢子虫病的诊断和流行病学调查打下了基础。     

猪带绦虫未知基因SLC10在毕赤酵母中的表达

SLC10是以反式剪切引导序列为基础,通过RT-PCR从猪囊尾蚴中克隆到的一个未知基因。将猪囊尾蚴SLC10基因从重组克隆载体pGEM-SLC10扩增并酶切后,与相应酶切处理的毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9K-SLC10,转化大肠杆菌JM109,经PCR、酶切和测序鉴定,基因序列完全正确。纯化的重组质粒pPIC9K—SLC10用内切酶Sac I线性化,电转化毕赤酵母,使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合;采用G418抗性梯度法筛选多拷贝重组菌株,用甲醇进行诱导表达;通过SDS-PAGE和Western—blot分析表达产物,结果表明目的蛋白得到了表达,但不具有免疫反应性。