串联抑制素基因克隆与重组质粒的构建

根据GenBank中报道的猪抑制素基因序列设计两对引物，克隆含有抑制素抗原决定簇基因片段α(1～32)的p1INH和p2INH，在这两个片段中都设有限制性内切酶XbaⅠ的酶切位点，通过XbaⅠ把p1INH与p2INH串联起来。串联抑制素基因片段与pcDNA3.1载体通过EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点连接后经过转化DH5α感受态细菌构建重组载体。以重组载体作为模板，以含有EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点的引物PCR，产物经验证为含串联的抑制素基因。串联的抑制素基因产生的融合蛋白具有抑制素的免疫原性，也不会与体内其他蛋白发生免疫交叉反应。串联后的基因片段在单位体积内的抗原位点数增多，免疫效果也会加强。可以反馈性地抑制FSH的分泌，提高母畜的排卵数，提高产仔数。     

快,慢型大豆根瘤菌质粒接合重组的初步研究

通过含有Ｒ６８．４５质粒的大肠杆菌将快生型大豆根瘤ＡＣＣＣ１５０６７菌株的大质粒转到慢生型大豆根瘤菌６１Ａ７６菌株中去，共接合转移出２２个接合子菌株，对其中的１２个菌株进行了与８３－１１９大豆的共生接种试验，其效果是部分接合子菌株超过供体菌和受体菌对接合子ＢＦ２－Ａ１菌株进行了质粒检测。田间应用亦有增产趋势。     

不同转染方法转染牛体细胞效率的比较

为了从新转染方法与传统转染方法的比较中找出更为高效的转染方法,本研究以绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA为外源基因,分别采用核转染法、电穿孔法和脂质体法转染牛的3种常用核移植供体细胞(胎儿成纤维细胞、胎儿输卵管上皮细胞、卵丘颗粒细胞).针对不同类型的细胞,实验首先对核转染法和电穿孔法的转染参数进行了系统的摸索和优化,然后将优化后的核转染法、电穿孔法与脂质体法在可控实验条件完全一致的情况下进行了转染对比实验,分析比较了转染48 h后的绿色荧光比率和细胞存活率.结果显示,核转染法转染胎儿成纤维细胞、胎儿输卵管上皮细胞和卵丘颗粒细胞的优化程序分别是V013、T023和U023;在电穿孔法中,当电场强度为90 V/mm,脉冲时间为10 ms时,胎儿成纤维细胞和卵丘颗粒细胞的转染效率最高,胎儿输卵管上皮细胞则在电场强度为80 V/mm,脉冲时间为5 ms时获得了最佳转染效率;最后通过转染对比实验得出,核转染法在3种细胞中都获得了最高的转染效率,分别为(98.78±0.30)％、(88.43±2.10)％和(71.31±0.77)％,均显著高于电穿孔法和脂质体法;转染后的存活率则为脂质体法最高,电穿孔法最低.研究结果说明,核转染法可以成为一种结合牛体细胞克隆技术生产转基因牛更有效的转染方法.     

脂质体介导的外源基因在黄瓜悬浮细胞原生质体中的表达

本文用脂质体包裹质粒DNA,研究了不同制备方法,不同磷脂成分对包裹率的影响,以及超声处理对脂质体内质粒DNA稳定性的影响。用改进的脱水再加水法制备质粒脂质体,使包襄率由10—20％提高到60—70％。黄瓜悬浮细胞原生质体与包裹pUC12—CAT质粒的脂质体经PEG诱导融合,培养3天和6天后均测得较强的CAT活性,说明脂质体介导的外源基因己在黄瓜细胞中成功地表达。     

核转染技术转染水牛细胞的初步研究

本研究旨在获得一种高效转染水牛细胞的方法。本研究首先以水牛胎儿成纤维细胞（BFF）为研究对象,建立、优化核转染法;随后,比较核转染法、脂质体法、电穿孔法转染BFF的效率;最后选用较优的方法,探讨转染水牛原代骨髓间充质干细胞和类胚胎干细胞的可行性。结果发现随电压的增加,核转染BFF的效率升高;核转染电压为225V,脉冲时间为10ms时,细胞EGFP阳性率为（83.1±1.4）%,转染效率显著高于脂质体法（（11.7±1.2）%）和电穿孔法（（35.5±2.0）%）。运用优化的核转染条件可以成功将外源基因导入水牛原代骨髓间充质干细胞和类胚胎干细胞,且不影响其细胞生物学特性。本研究为以多能干细胞介导的水牛转基因克隆胚胎的生产奠定了基础。     

重组多功能木聚糖酶酶解条件的优化

重组多功能木聚糖酶(recombinant multi-functional xylanase,RMFXase)是以草菇为表达载体,具有多种酶活力的新型酶。为揭示该酶与底物的作用规律,同时为转基因酶的应用提供基础数据,该文利用重组多功能木聚糖酶水解南方特色的甘蔗加工废弃物生产低聚木糖,通过响应面法建立以重组多功能木聚糖酶质量浓度、底物质量浓度和酶解时间为控制因素的反应动力学方程组,从而推导得到酶解最佳工艺参数。试验并通过高效液相色谱法法,监测反应过程中产物的动态变化,分析产物的生成规律。结果表明,通过响应面法推导出符合连续式酶解反应器的最佳酶解工艺参数为:加酶量900 U/mL、底物质量浓度110 mg/mL、反应时间80 min。该条件下酶解木聚糖含量为54.7%的蔗渣半纤维素,得到的低聚木糖DP值达到3,酶解率达到23.94%。酶解过程中重组多功能木聚糖酶表现出高内切-β-1,4-木聚糖活力,优先降解大分子木聚糖,后期产物主要以木二糖和木三糖为主,且底物纯度越高,底物利用率越高。     

共表达PCV2衣壳蛋白和猪GM-CSF重组质粒的构建与体外表达

将猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)orf2和猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)基因插入同一哺乳动物细胞表达载体pIRESneo中，构建出重组共表达质粒pIRES-orf2/gm-csf。以脂质体转染方法将重组质粒pIRES-orf2/gm-csf转染COS7细胞，经间接免疫荧光实验和集落刺激形成实验检测，结果表明orf2和gm-csf基因在COS7细胞中得到表达，转染细胞呈现特异性荧光，转染细胞培养上清能剌激猪骨髓细胞形成集落。重组质粒pIRES-orf2/gm-csf的成功构建为进一步研究猪圆环病毒2型的DNA疫苗奠定了基础。     

重组大肠杆菌表达降氰酶的诱导条件优化

采用积分光密度法对产碱杆菌（Alcaligenes sp.）降氰酶基因在大肠杆菌中的高效表达进行了诱导条件优化,以工程菌BL21（DE3）-pET28a-cdE的诱导表达条件进行优化,以提高目的蛋白的产量和活性。结果显示,重组菌表达降氰酶的最佳诱导条件为温度28℃,初始菌体浓度OD600值为0.6,IPTG浓度为0.8mmol/L,诱导时间12h。研究发现,诱导剂的添加浓度对外源蛋白的表达水平具有显著影响,使用终浓度为0.8mmol/L的IPTG,诱导表达12h,降氰酶蛋白收率达到143.27mg/L,比活力达到11560 U/mg。与不添加诱导剂相比,重组蛋白的收率和比活力分别提高了64倍和9倍。     

两种质粒中gus基因在植物细胞和根癌农杆菌中的表达特性研究

以含有基因转化操作过程中常用的两种质粒载体pBI121和pCAMBIA2301的根癌农杆菌EHA105为材料,分别转化甜瓜子叶,应用组织化学方法检测了甜瓜子叶和子叶培养后的愈伤组织及根癌农杆菌菌液的瞬时转化效果,研究了两种不同的质粒载体上所含的gus基因在根癌农杆菌中和植物细胞中的表达特性。结果表明,不同质粒载体上所含的gus基因的表达特性不同,质粒载体pBI121上所含的gus基因既能在植物细胞中能表达,也能在根癌农杆菌细胞中表达,而质粒载体pCAMBIA2301上所含的gus基因能在植物细胞中表达,但是不能在根癌农杆菌细胞中表达。     

人IGF-1基因重组杆状病毒表达载体的构建及在sf9细胞中的表达

以pcDNA3．1／IGF-1为模板，采用PCR方法对IGF-1基因进行扩增，EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶切回收含IGF-1基因的DNA片段，与pFastHTA连接，获得重组载体pFast／IGF-1；将其转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH10Bac感受态细胞，经卡那霉素、四环素、庆大霉素及蓝白斑筛选得到重组杆状病毒载体pBacmid-Fa-IGF-1，PCR鉴定得到单-／GF-1条带。将该病毒载体转染sf9细胞，进行病毒重组，Western-blot检测／GF-1表达，并用MTT法检测促内皮细胞生长活性。结果成功获得了重组病毒，Western-blot检测出现1条约13．0kD的带，MTT法检测IGF-1促细胞生长率为24．4％。     

重组球孢白僵菌表达目标产物类枯草杆菌蛋白酶的发酵特性研究

采用单因子筛选和正交试验,研究了碳源、氮源、微量元素及无机盐等营养成分对重组球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株Bb0062-15-4-CDEP-1产生目标产物类枯草杆菌蛋白酶CDEP-1的影响,并通过摇瓶发酵和30 L发酵罐发酵对其发酵特性进行了研究.结果表明,其优化发酵培养基为2.0%玉米粉,1.0%麦麸,0.25%豆粕粉,0.4%NaNO3,0.1%MgSO4·7H2O.摇瓶发酵结果表明,在对数生长期,随着菌体生物量的增加,CDEP-1产量上升,二者呈一定的平行关系;当菌体生长到稳定期,CDEP-1产量继续上升,并达到产酶高峰;此后,随着菌体生长的衰退,CDEP-1产量出现快速下降趋势.扩大培养时,30 L发酵罐中60 h产酶量最高,比摇瓶培养(168 h)缩短了108 h,单位体积的产酶量比摇瓶培养提高80%.结果对研究和利用该球孢白僵菌重组菌株的代谢产物,提高真菌杀虫剂的杀虫效果奠定了基础.     

美拉德反应制备鸡肉风味基料的工艺条件优化

为探究美拉德反应条件对鸡肉风味调味料品质的影响,本试验以鸡胸肉蛋白酶解液为研究对象,采用模糊数学感官评价和气相色谱-离子迁移谱联用技术(GC-IMS)研究还原糖添加量、反应温度、反应时间和pH值4个热反应条件对鸡肉风味基料感官品质和挥发性有机物(VOCs)的影响。结果表明,添加3%木糖的鸡胸肉蛋白酶解液(pH值7),在101.1℃下反应86 min可获得一种感官性状好、风味佳的鸡肉风味基料,且该制品VOCs丰度高,与市售罐头鸡汤风味相似度较高。本研究为低值鸡肉制品的深度开发提供了一定的理论参考。     

Optimization of Culture Conditions for the Biodegradation of Lindane by the Polypore Fungus Ganoderma australe

The performance of a lab-scale model biofilter system was investigated to treat CH₄ gas emitted from modern sanitary landfills using landfill cover soil as the filter bed medium. From the batch experiment to measure the influence of moisture content and temperature of the filter medium on CH₄ removal capacity of a biofilter system, the optimum moisture content and temperature were found to be 10–15% by weight and 25–35°C, respectively. From the model biofilter experiment to measure the influence of inlet CH₄ concentration and landfill gas inflow rate on CH₄ removal capacity of a biofilter system, it was found that the removal percentage of CH₄ increased as the inlet CH₄ concentration decreased. Up to a landfill gas inflow rate of 1,000 mL min^?1 (empty bed retention time?=?7.7 min), the CH₄ removal efficiency of the biofilter was able to reach 100%. Up to CH₄ loading rate of 278.5 g CH₄ m^?3 h^?1, the ratio of elimination capacity to CH₄ loading rate was 1 while they were 0.68 and 0.34 at CH₄ loading rate of 417.8 and 557.1 g CH₄ m^?3 h^?1, respectively. The CH₄ removal by biofilter was also confirmed by measuring the change of temperature and moisture content of the filter medium in the model biofilter. The results demonstrated that the installation of a properly managed biofilter system should be effective to reduce atmospheric CH₄ emissions from modern sanitary landfills at the low CH₄ generation stage.     

酶解牦牛血发酵液制备抗氧化肽工艺优化

为进一步提高牦牛血枯草芽胞杆菌发酵液多肽含量,对牦牛血发酵液进行酶解,以酶解液的·OH清除率、多肽含量为主要指标,筛选酶解发酵液的最适蛋白酶,通过单因素和响应面试验优化酶解工艺,并对比菌酶联合制备产物与发酵液体外抗氧化活性。结果表明,碱性蛋白酶酶解发酵液最佳条件为:酶解时间3 h、p H值9.5、酶解温度60℃和酶底比190 U·g-1,此条件下制备得到酶解液多肽含量为5.52mg·mL~(-1),较发酵液提高2.39倍。菌酶联合制备产物对·O2-及脂质过氧化的IC50分别为6.22、4.87mg·mL~(-1),发酵法制备产物对·O2-及脂质过氧化的IC50分别为8.42、11.71 mg·mL~(-1),且菌酶联合制备产物的还原力优于发酵制备产物。因此,菌酶联合制备牦牛血抗氧化肽法优于传统单一发酵法。本研究结果对提高牦牛血抗氧化肽得率,增加牦牛产品附加值具有重要的意义。     

Optimization of Rapid-Visco Analyser Test Conditions for Predicting Asian Noodle Quality

A variety of Rapid-Visco Analyser (RVA) operating conditions have been tested with starch, flour, and wholemeal for predicting the quality of wheats for the manufacture of Japanese white-salted noodles. Using starch as the substrate, an initial temperature of 60°C has been found to be optimum, and the best heating time from this initial temperature to the peak temperature of 95°C was ≈6 min. Significant correlations were found between peak viscosity of starch pastes and noodle quality under these operating conditions. For flour and wholemeal samples, the correlations were not as high as for isolated starch. The correlations with wholemeal or flour and noodle quality could be improved by the addition of α-amylase inhibitors. Measuring RVA viscosity of flour or wholemeal in the presence of silver nitrate gave viscosities which showed highly significant correlations with noodle quality. These correlations were similar to those obtained with isolated starch. It appears that the improvement is due to inhibition of the α-amylase present in grain and flour. Correlations were also observed between flour paste viscosity and alkaline noodle quality. These could be increased either by inhibiting α-amylase with silver nitrate or by pH adjustment with sodium carbonate but the change was not significant. The improvement of the correlations by α-amylase inhibitors in this sample set was not as great as observed with Japanese white noodles.     

黑曲霉固体发酵产木聚糖酶的响应面优化设计及其酶学性质的研究

本研究采用响应面法的中心组合对影响黑曲霉(aspergillus niger JL 15)固体发酵产木聚糖酶的条件进行了优化.以橘皮粉为基质,补充碳源、氮源,以及含水量和发酵时间对木聚糖酶产量具有显著影响(P<0.05).模拟二次多项式回归预测模型,并建立自变量与响应值的回归方程,获得各因素的最佳水平,即:甘油、硫酸铵的添加量分别为4.2%和3.1%,含水量为61%,发酵时间为73.4 h,木聚糖酶活性最大预测值达922.9 U/g干发酵产物,验证值为917.7 U/g干发酵产物,高出基础培养基酶活3.2倍.酶学性质分析研究表明,黑曲霉木聚糖酶(XylA)的最适温度和最适pH分别为55oC和pH 5.0.XylA的K_m和V_(max)值分别为9.24 mg/mL和54.05 μmol/min/mL.Mn~(2+)、Zn~(2+)和斗和Mg~(2+)对XylA活性具有促进作用,而Fe~(3+)和cu~(2+)对XylA活性具有明显抑制作用.HPLC分析结果表明,XylA的水解桦木木聚糖和麸皮不溶性木聚糖的产物均为木糖至木六糖,主要产物为木三糖.     

高产中性纤维素酶的巨大芽胞杆菌基因工程菌发酵工艺条件优化

为了加快纤维素酶工业化应用的步伐,解决纤维素酶发酵工业产量低、生产成本高等问题,本研究采用正交设计法对高产中性纤维素酶的巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)基因工程菌的培养基和发酵条件进行优化.结果表明,最佳发酵培养基成分为:麦麸2.5%、玉米浆1.5%、磷酸二氢钾0.75%、硫酸镁0.04%、氯化钠0.25%;最佳发酵条件为:温度37℃,pH 7.0,罐压0.03～0.05 Mpa,转速600 r/min,装液量3 L,接种量10%,培养4 h后以0.25 g/L/h的流速流加木糖10 h,发酵16 h后,以恒溶氧方式流加补料8 h,共补加料320mL,发酵过程控制溶氧浓度≥30%.该工程菌在此最佳发酵条件下培养,纤维素酶活力可达3846.48 U/mL,是优化前摇瓶发酵的4.3倍.本研究可为工业化生产纤维素酶提供依据.     

响应面法优化秘鲁鱿鱼(Dosidicus gigas)肌肉盐溶蛋白的提取和凝胶形成条件

探讨了秘鲁鱿鱼肉盐溶蛋白的提取及凝胶形成条件对其凝胶特性的影响。采用响应面分析法,研究KCl浓度、pH值和低温加热时间对鱿鱼肉盐溶蛋白凝胶保水性和质构特性的影响。结果显示:(1)提取液KCl浓度对保水性影响极其显著,对硬度影响显著;提取液pH值对保水性影响显著;低温加热时间对硬度和粘性影响显著;(2)在分析各因素显著性及其交互作用的基础上,确定鱿鱼肉盐溶蛋白提取和凝胶形成的适宜条件为:KCl浓度0.16 mol·L-1、pH 7.10、40℃加热55min,此时凝胶保水性、硬度、粘性分别达到88.00%、510.00g、-11.00g,与模型预测值相符。     

水蜜桃酒速酿酵母菌的筛选、鉴定及发酵条件优化

为获得快速酿造水蜜桃酒的专用酵母菌株,生产优质水蜜桃酒,以水蜜桃自然发酵醪为筛菌原料,通过TTC显色法与杜氏小管法初筛;再经耐酒精能力、发酵速度与产酒能力以及发酵液风味分析与感官评定三级复筛,获得了优质高效的酿酒酵母菌PY01(Saccharomyces cerevisiae PY01);并以初始pH值、主发酵温度、酵母接种量为自变量,以酒精度为响应值作酿酒工艺的响应面优化。结果表明,PY01菌株发酵水蜜桃酒最适发酵参数为初始pH值3.9,发酵温度26℃,酵母接种量6.2%。在此条件下发酵可得到酒精度为12.78%vol,总糖含量为6.71 g·L^-1,风味纯正,口感醇厚,典型性的半干型水蜜桃发酵酒。本研究结果为水蜜桃发酵酿酒产业菌种的选择与工艺优化提供了基础。