桃树上啤酒花矮化类病毒(Hop stunt viroid)的检测及序列分析

 2005年8月和2006年2月从中国北京、陕西、河北、山东、广西等地共采集76个无明显症状的桃树样品,经斑点杂交、RT-PCR以及生物学鉴定检测,来自北京和陕西的11个样品中检测到啤酒花矮化类病毒(Hop stunt viroid,HSVd),总感染率达14.5%。上述3种方法检测桃树上的HSVd具有一致性。将5个样品中的HSVd进行克隆测序,得到12条不同HSVd核酸序列,与GenBank中D13764序列(日本桃果实HSVd分离物)同源性为93.29%~100%。可以看出,国内桃树HSVd分离物核酸序列变异比较小,地域和品种间核酸序列无明显差异。这是首次比较系统地检测中国桃树上HSVd发生情况的报道。     

利用实时荧光定量PCR技术检测樱桃叶斑驳病毒

樱桃叶斑驳病毒(Cherry mottle leaf virus,CMLV)是南美洲樱桃上重要的病害之一。本研究针对Genbank上公布的该病毒的核酸序列,人工合成了CMLV(AF170028.1)6741～7322 nt的核酸序列并连接载体,构建了阳性标准质粒,进行实时荧光定量PCR(Fluorescence quantitative,FQ-PCR)检测。实验结果表明,本研究设计的利用FQ-PCR检测CMLV的引物及探针特异性良好,经灵敏度检测,最低检测浓度为23 copies/μL,比普通PCR检测灵敏度高100倍。该FQ-PCR检测方法为樱桃叶斑驳病毒的防控提供了重要的技术支持。     

余庆县茶叶斑病致病菌Pestalotiopsis trachicarpicola鉴定及其生物学研究

为有效控制贵州省余庆县茶叶斑病的发生及为害,从该区域茶树叶部病害样品中分离纯化多个菌株,并对其中多个形态相似的分离物进行菌落形态、子实体、产孢细胞、分生孢子的形态观察.测定了核糖体转录间隔区(ITS)、微管蛋白(TUB2)和翻译延长因子1-α(TEF-1α)等核酸序列,采用PAUP软件及最大简约法,进行了多基因系统发育...     

番茄斑萎病毒NASBA检测方法的建立

为建立一种快速检测番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)的方法,以TSWV-CP1/TSWV-CP2为引物对TSWV的N基因进行PCR扩增及序列测定,在TSWV N基因的高度保守区设计特异性扩增引物NA-P1/NA-P2进行核酸序列依赖性扩增(NASBA)反应,并对NASBA方法的特异性和灵敏度进行验证。结果表明,建立的NASBA方法最佳反应时间为1.5 h。该方法特异性较好,只有TSWV阳性样品中出现了预期大小为235 bp的扩增产物,与烟草环斑病毒(Tobacco ring spot virus,TRSV)、番茄黑环病毒(Tomato black ring virus,TBRV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)、番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow curl virus,ToYCLV)无交叉反应。灵敏度验证中,实时荧光RT-PCR的灵敏度最高,为1.56×10~(-5)ng/μL感病植物RNA模板,NASBA次之,为1.56×10~(-4)ng/μL,普通RT-PCR最低,为1.56×10~(-3)ng/μL。在对9份实际样品检测中,NASBA的阳性检出率与实时荧光RT-PCR、普通RT-PCR相同,均为33%,高于ELISA检测的22%。表明NASBA方法适用于实际样品检测,可对TSWV进行快速检测。     

北京地区平菇球形病毒病检测及防控

2014—2015年在北京郊区平菇温室调查时发现部分平菇子实体表现球形畸形,通过提取典型症状样品总RNA利用平菇球形病毒(oyster mushroom spherical virus,OMSV)特异性引物进行PCR检测,扩增约700 bp的特异条带。通过测序和序列比对分析表明,平菇样本cDNA扩增得到的部分基因序列与OMSV标准序列(ID:NC_004560.1)的cp基因核酸序列相似度为91%。对北京郊区一些平菇生产温室的畸形平菇检测表明,OMSV已较为普遍发生。本文还讨论了其防控对策。     

基于免核酸提取可视化RT-LAMP快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

本文基于逆转录环介导恒温扩增(RT-LAMP)技术建立葫芦科作物中黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)免核酸提取的可视化快速检测方法。根据CGMMV全基因组序列，筛选保守区域并设计特异性RT-LAMP检测引物。通过荧光扩增方法 (加SYTO-9)和可视化方法 (加钙黄绿素),开展RT-LMAP特异性、灵敏度和重现性试验分析。结果表明，优化筛选的引物组可以特异性地检测CGMMV,检测灵敏度达到4.21×10³ fg/μL,组内和组间变异系数均小于5%,重现性好。对瓜类作物田间种苗、植株叶片及市售种子等103份样品进行检测及一致性分析，表明该方法与基于RNA提取RT-LAMP、荧光RT-qPCR及免疫测试条检测结果之间的Kappa值均为1.0 (1～1, 95%置信区间),具有很好的一致性。基于免核酸提取的可视化RT-LAMP快检方法成为适合现场快速检测的理想选择，对于CGMMV危害葫芦科作物的田间监测以及疫情防控具有广泛的推广应用前景。     

菊花绿变病植原体在中国的发生及分子鉴定

对内蒙古农业大学校园内表现花器绿变症状的菊花样品进行采集和DNA提取,应用植原体16S rRNA基因和rp基因的引物进行巢式PCR扩增,从感病样品中分别扩增得到了长度均约为1.2 kb的片段。序列一致性分析表明,菊花绿变植原体16S rRNA基因与翠菊黄化植原体匈牙利风信子株系(GenBank登录号MN080271)、印度玉米株系(KY565571)、印度繁缕株系(KC623537)和印度马铃薯株系(KC312703)的核酸一致性最高,为99.9%,rp基因序列与翠菊黄化植原体立陶宛洋葱株系(GU228514)的核酸一致性最高,为99.8%。基于16S rRNA基因和rp基因构建系统进化树时发现,菊花绿变植原体均与16SrI-B亚组成员聚为一起。16S rRNA基因相似性系数分析表明,菊花绿变植原体与洋葱黄化植原体(AP006628)的相似性系数最高为1.00,洋葱黄化植原体(AP006628)在分类上属于16SrI-B亚组。因此,我们可以确定该菊花绿变植原体属于16SrI-B亚组。这是我国首次报道菊花绿变病的发生。     

山西苹果茎痘病毒遗传多样性分析

苹果茎痘病毒是苹果安全生产的巨大威胁,严重影响苹果产量和质量。探讨苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV)在山西省的分布、变异和多样性,可为制定可持续的病毒管理策略提供理论依据。从山西省11个地区采集苹果叶片样品进行RT-PCR检测。结合在线数据库,利用相关软件对文中研究获得的序列进行系统发育、遗传多样性、重组以及种群遗传分化等分析。RT-PCR检测结果显示从山西省11个地区采集的409份苹果叶片样品中,ASPV的检出率为36.33%(临漪)至55.37%(平遥)。选择15个ASPV检测为阳性的样品,分别克隆其CP基因并与22个不同的ASPV分离物进行核苷酸和氨基酸一致性分析,发现37个ASPV分离物的核酸一致率为70.27～96.31%,氨基酸一致率为37.04～96.64%,其中,Shanxi-2与JX673826.1的核酸一致率最高,为90.86%, Shanxi-2与MN617853.1的核酸一致率最低,为70.40%。基于CP的进化树分析结果显示37个ASPV分离物被划分为2个进化群体。遗传多样性分析结果表明ASPV种群发生了收缩,且在两个...     

香石竹斑驳病毒(CarMV)云南分离物CP基因的克隆和序列分析

 香石竹斑驳病毒(CarMV)是侵染香石竹的主要病毒。关于该病毒的株系和不同地区分离物的病毒核酸序列研究报道较少。     

进境日本豇豆中黑眼豇豆花叶病毒的检测与鉴定

从进口日本豇豆中随机挑选种子在隔离温室内种植。出苗后,发现有典型花叶症状的植株。对该病株进行电镜观测,发现有线条形病毒粒体,大小约为750nm×13nm。设计特异性引物(BL-5/BL-6),对该样品进行黑眼豇豆花叶病毒的反转录(RT)PCR分子检测。电泳检测表明,扩增出一条特异性的目标条带,大小为338bp。对该样品的RT-PCR产物进行测序,结果表明该序列与黑眼豇豆花叶病毒(GENEBANK登录号:AY575773)的序列有4个碱基差异,同源性为98.8%。鉴定该病毒为黑眼豇豆花叶病毒(Blackeye cowpea mosaicvirus)。     

鸢尾黄斑病毒几种PCR检测方法的建立和比较研究

 以带有鸢尾黄斑病毒的烟草叶片为材料,研究建立了IYSV的普通RT PCR、免疫捕获RT PCR和SYBR Green Ⅰ实时荧光RT PCR方法,并比较了几种检测方法的灵敏度。结果表明,DAS ELISA检测灵敏度较低,为1 mg带毒叶片。而各种PCR方法的灵敏度均高于DAS ELISA 100倍以上,其中SYBR Green Ⅰ实时荧光RT PCR检测灵敏度最高,可从0.4 μg的带毒叶片中检出IYSV,而RT PCR的灵敏度为40 μg带毒叶片,IC RT PCR的检测灵敏度是RT PCR的4倍。鉴于DAS ELISA灵敏度较低,建议在用ELISA初筛时,如样品OD405值与阴性对照OD405值之比在2.0左右时需要再用分子方法加以确证,以防漏检。     

香石竹斑驳病毒的鉴定和RT-PCR检测

从表现为叶斑驳、花碎色症状的香石竹病株上获得一病毒分离物 ,电镜负染观察到直径为28～33nm的球状粒子。病毒提取液经紫外光测定呈典型核蛋白吸收曲线 ,OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.70;血清学反应与CarMV抗血清出现明显的沉淀线。通过以上实验结果 ,确定该病毒分离物为香石竹斑驳病毒(carnation mottle virus ,CarMV)。根据该病毒的RNA序列设计引物 ,对病健材料进行了RT-PCR检测 ,结果从感病材料中扩增出大约600bp的特异片段 ,而健康植物无此扩增带。将PCR产物连接 pGEM-T-easy载体 ,转化大肠杆菌JM109,得到了含目的片段的重组子 ,经双脱氧序列分析 ,与Guilley报道的序列对应部分的核苷酸序列基本一致 (其同源性达96% ) ,最低检出病毒核酸含量为5ng ,表明应用RT-PCR检测香石竹斑驳病毒是可行的     

Occurrence of Tomato spotted wilt virus (TSWV) in Jordan

Tomato spotted wilt virus was recorded for the first time in Jordan on tomato plants. Severe disease symptoms were observed in different tomato farms in the Jordan Valley. Using a specific primer pair a fragment of the capsid protein gene of the virus has been amplified by RT-PCR and IC-RT-PCR. The amplified PCR product was cloned and sequenced. Sequence analysis revealed that the Jordanian isolate of TSWV shared high nucleotide similarities with other isolates from different countries. The sequence of the capsid protein gene was deposited in GenBank under the accession number AY646682 . The response of different tomato breeding lines and hybrids, previously developed for resistance against Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) were tested for their reaction to TSWV infection. All tested lines and hybrids were susceptible to TSWV infection. This has been confirmed at the molecular level by using the SCAR 421 marker linked to the TSWV resistance gene Sw-5 .     

应用PCR方法检测烟粉虱传双生病毒

番茄黄化曲叶病毒属于双生病毒,根据其外壳蛋白基因保守序列设计简并引物,对杭州和海宁地区番茄上疑似番茄黄化曲叶病毒进行PCR检测,获得产物克隆到pMD18-T载体中,经测序和序列分析,表明杭州和海宁地区发生的病毒是番茄黄化曲叶病毒,并且两地区病毒核苷酸序列同源性达97.5%。     

齿兰环斑病毒与建兰花叶病毒分子检测研究

齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus,ORSV）与建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus, CyMV）是严重危害兰科植物的两种主要病毒。本研究根据病毒外壳蛋白基因设计特异性引物,应用ELISA、普通RT-PCR、巢式RT-PCR和免疫捕获RT-PCR4种方法进行了检测研究与比较。结果表明：普通RT-PCR与ELISA方法检测灵敏度相当;巢式RT-PCR检测灵敏度要比普通RT-PCR与ELISA方法高出104倍以上;免疫捕获RT-PCR检测灵敏度介于普通RT-PCR和巢式RT-PCR之间。采用巢式RT-PCR方法对我国台湾进境的蝴蝶兰植株样本检测,1号样本出现与阳性对照一致的特异条带。双向测序分析,扩增产物序列与ORSV外壳蛋白基因具有100％的同源性,表明1号蝴蝶兰样本携带ORSV。     

木尔坦棉花曲叶病毒RPA快速检测方法的建立

木尔坦棉花曲叶病毒Cotton leaf curl Multan virus(CLCuMuV)引起的病害是世界棉花生产上的毁灭性灾害,也是我国进境植物检疫性有害生物之一。因此,建立快速检测技术对CLCuMuV的检疫和防控具有重要意义。本研究根据CLCuMuV外壳蛋白(CP)基因序列设计引物,建立了该病毒的重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)检测方法,并评价了该方法的灵敏度和特异性,进一步测定了对田间疑似病样的检测准确性。结果表明,建立的RPA检测方法仅能从感染CLCuMuV的样品中扩增出目的条带,而感染同属的其他5种病毒的样品中未扩增出目的条带。该方法检测灵敏度是常规PCR的10倍,且对田间疑似病样的检出结果与PCR试验结果一致。因此,本研究所建立的CLCuMuV RPA快速检测方法具有特异、灵敏、准确、操作简便、无需特殊设备等优点,这些为CLCuMuV的快速检测提供了一种新技术。