猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白基因片段的克隆与表达

根据猪链球菌2型（Streptococcus suis type2)溶菌酶释放蛋白（muramidase-released protein,MRP)基因序列，设计和合成一对引物，以猪链球菌2型江苏分离株HA9801的基因组DNA为模板，通过PCR技术，扩增mrp基因304-1168bp序列，并按正确的阅读框架定向克隆到表达载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶（GST）基因的下游；将重组质粒转化入大肠杆菌BL21株，经IPTG诱导，可表达分子量为57kD的融合蛋白，用MRP抗血清进行的免疫转印分析表明，表达的融合蛋白可被MRP抗血清识别，该融合蛋白具有MRP的抗原表位，为进一步研究MRP的结构和功能奠定了基础。     

猪链球菌2型纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白 全基因的克隆及融合表达

采用发表的引物对,以猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2）江苏分离株HA9801的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白基因fbps（GenBank登录号为AY565303）克隆于pMD-T18载体构建成载体pMD-T-fbps.经内切酶酶切和测序鉴定后,将由pMD-T-fbps内切酶切下的片段定向克隆于表达载体pET-32a（＋）,得到重组质粒pfbps.将重组质粒pfbps转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21株,经IPTG诱导,可高水平地表达相对分子量为83 kD的融合蛋白.配体印迹结合试验表明,表达的融合蛋白可与人纤连蛋白结合.     

猪链球菌2型可能的毒力基因分布

通过猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2，SS2)毒力菌株HA9801与无毒力菌株12^#之间的抑制性差减杂交(SSH)实验，获得了可能与SS2菌株毒力相关的5个基因片段，分别是转录调节子(15^#，和154^#片段)，氨基酸通透酶(210^#片段)，ABC转运子(9^#片段)及表面锚定蛋白(187^#片段)。根据5个片段的序列，设计了5对引物，用PCR方法对不同来源、不同核糖型及不同毒力的35株SS2菌株进行检测。结果表明，这5个片段存在于所有的脑膜炎分离株，缺失于所有的肺炎分离株、心内膜炎分离株、败血症分离株及无毒力菌株，但其中154^#片段则在1株肺炎分离株中存在。从而表明，这5个片段可能与脑膜炎有关，可望用于脑膜炎分离株的检测。     

猪链球菌2型次黄嘌呤核苷酸脱氢酶重组蛋白的酶活性和免疫原性检测

克隆表达猪链球菌2型次黄嘌呤核苷酸脱氢酶（IMPDH）编码全基因,分析表达产物的免疫原性,并测定其酶活性。采用PCR法,从四川资阳中毒性休克综合征病人分离株05ZYH33基因组扩增IMPDH的编码基因impdh,构建重组表达质粒pET28a-impdh,转化E.coli BL21(DE3),筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,产物通过SDS-PAGE鉴定,并用western blot检测其抗原活性;最后对表达产物进行亲和层析纯化,测定其在不同pH、温度下的酶活性。impdh基因在原核细胞中得到高效表达,在最适温度和pH下具有最强酶活性。我国猪链球菌2型毒力株05ZYH33含有impdh基因,在原核系统高效表达的重组蛋白具有良好的免疫原性和酶活性。     

白颈长尾雉圈养种群大肠杆菌耐药性及其耐药基因

对白颈长尾雉圈养条件下的38个样品进行大肠杆菌分离及PCR检定,并采用肠杆菌基因间重复共有序列PCR指纹法（ERIC）剔除各个样品的重叠分离株,检测获得的170个大肠杆菌分离株对9种抗生素的耐药性、Ⅰ型整合子携带率及其可变区抗性基因,结果显示：（1）来自白颈长尾雉的分离株对实验用的9种抗生素的抗性比率和多重耐药性远高于环境源和人源者（来自白颈长尾雉的分离株100%耐受3种及以下的抗生素,而环境源者为50.7%,人源者66.7%）;（2）来自白颈长尾雉的分离株的Ⅰ型整合子携带率（92%）高于环境源（87%）和人源（78%）;（3）来自白颈长尾雉和来自人的大肠杆菌分离株的Ⅰ型整合子可变区抗生素抗性基因检出率相同（36%）,但高于环境源（24%）;（4）携带Ⅰ型整合子的分离株对实验用的抗生素的抗性百分率一般高于不携带者,只有个别种类抗生素这种差异为非显著性差异;（5）Ⅰ型整合子可变区基因盒的基因为3类,即aadA、dfrA和未知功能的orfF;aadA、dfrA的频率相同;3类基因均以基因盒形式存在,分别是dfrA17-aadA5、dfrA12-ofrF-aadA2、dfrA12-aadA2。     

苏云金芽孢杆菌cry2Aa基因的克隆、表达与活性

B-8-G和Ly30是我国自行分离的对多种重要农业害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）菌株,经PCR-RFLP鉴定均含有cry2Aa基因.根据cry2Aa全长基因序列设计特异引物,以B-8-G总DNA为模板扩增其中的cry2Aa全长基因,与大肠杆菌（Escherichia coli）表达载体pET-21b相连接,获得含有cry2Aa全长基因的重组质粒pET2Aa,该基因在大肠杆菌BL21菌株能够正常表达65 kD蛋白.通过构建Ly30总DNA文库方法从中筛选获得cry2Aa基因,将其连接至Bt-E.coli穿梭表达载体pHT315上,转化Bt无晶体突变株HD-73中,该基因能正常表达65 kD蛋白,并形成立方体状晶体.这两种基因序列已被国际Bt基因命名委员会分别正式命名为cry2Aa9和cry2Aa10.杀虫生物活性测定结果表明cry2Aa基因表达产物对黄胫小车蝗（Oedaleusinfernlis）、尖音库蚊（Culex pipiens）、黑翅伊蚊（Aedes melanopterus）、水稻二化螟（Chilo suppressalis）和小菜蛾（Plutellaxylostella）幼虫均具有显著的毒杀作用.首次报道cry2Aa10基因表达蛋白对蝗虫、库蚊具有杀虫活性.这些基因的获得,将为高效工程菌和抗虫转基因植物的研制提供了新的基因资源.     

肉鸡H9N2亚型禽流感病毒全基因测序及遗传进化分析

根据GenBank登陆的H9N2亚型禽流感病毒（AIV）的全基因序列,设计11对引物,运用RT-PCR方法扩增A／Chicken／Zhejiang／HJ／2007(H9N2)毒株8个基因片段,并克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。基因序列比较及遗传进化分析结果表明,所克隆的8个基因片段均有HJ毒株完整的开放阅读框（ORF）,其血凝素（HA）基因蛋白裂解位点的氨基酸组成为-PSKSSR*G-,为不连续的碱性氨基酸,符合低致病性AIV HA基因裂解位点的序列特征;与QA/HK/G1/97的进化关系较近,处在同一分支。其神经氨酸酶（NA）基因在63、64、65位点上有3个氨基酸（T、E、I）缺失,在遗传进化上属于常见的CK/BJ/1/94（DK/HK/Y280/97）群系。核蛋白（NP）基因整合有同地分离的H5N1亚型流感病毒NP基因片段,进化关系较近。基质蛋白（M）基因与1999年香港感染儿童的两株流感病毒（HK/1073/99和HK/1074/99）进化关系属于同一分支。非结构蛋白（NS）基因与近年来分离的猪源H9N2亚型流感病毒进化关系相近,和1998年首次报道的猪源H9N2亚型流感病毒（SW/HK/9/98）处在同一进化分支。聚合酶蛋白（PA、PB2、PB1）中,PB1从33-47位存在15个连续碱基缺失,是首次报道该基因ORF内存在缺失,从遗传进化上和近年来分离的H5N1亚型流感病毒处在同一分支上;PA基因从遗传进化上和PB1基因类似;PB2基因与常见的流感病毒毒株的遗传进化关系较远,在相应的进化树另成分支。因此,A／Chicken／Zhejiang／HJ／2007(H9N2)是由不同流感病毒基因亚系间发生自然重排的产物。     

瑞氏木霉碳源阻遏相关基因Cre1的分子改造

为了提高瑞氏木霉（Trichoderma reesei）纤维素酶的活力,用类似基因改组的方法改造其碳源阻遏相关基因cre1。以瑞氏木霉基因组DNA为模板PCR扩增cre1基因,用DNaseⅠ消化cre1基因后,回收50-100 bp的DNA片段,用T4 DNA连接酶连接,以连接产物作为模板进行无引物PCR,并将PCR产物转入瑞氏木霉原生质体,通过测定滤纸酶活的方法筛选突变菌株,并在NCBI上比对分析突变菌株的cre1基因。结果表明,筛选获得1株纤维素滤纸酶活比出发菌株提高0.7倍的突变菌株cre2-3。cre2-3菌株在液体培养基中呈棉花状,而出发菌株呈小颗粒状,菌株cre2-3发酵液的颜色比出发菌株的更黄亮。推测cre1基因与瑞氏木霉菌株的生长代谢有关。     

广西14市猪戊型肝炎的分子流行病学分析

为调查广西猪戊型肝炎（HE）的感染情况,本研究应用套式RT-PCR方法对采自广西14市43个猪场的508份3月龄左右猪只粪样及市售182份猪肝扩增猪戊型肝炎病毒（HEV）ORF2基因特异序列,并进行核苷酸序列同源性分析及遗传进化分析。结果表明,在508份猪粪样中194份可以检测到HEV RNA,阳性率为38.2%;182份猪肝样本中,33份可检测到HEV RNA,阳性率为18.1%;43个猪场中检出HEV RNA的有35个,猪场阳性率为81.4%。所获取的39株广西猪HEV ORF2基因特异序列同源性为89.9%～100%,提示在所调查的广西猪场中已较普遍存在HEV感染,所获取的39株广西HEV阳性样品均属于基因Ⅳ型。本研究结果佐证了感染猪及市售带毒猪肝脏是HEV重要的储存库和传染源,应该重视其公共卫生学意义,预防粪-口途径或者食源性HEV感染。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌缺失毒素1激活基因C(ApxIC)同时嵌合副猪嗜血杆菌外膜蛋白P2基因(ompP2)复合突变株的构建

猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)以及副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,Hps)是引起猪发病的2种病菌。本研究以APP血清5型分离株(SW1)为基础材料,通过构建重组转移载体pBOSKΔIC-1和pBOSKΔIC/ompP2,构成卡那霉素抗性基因(Kanr)和枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)的果聚蔗糖酶基因(sacB)的正负双向筛选表达盒,并筛选获得SW1株缺失毒素I的激活基因C(ApxIC),同时嵌合Hps外膜蛋白P2基因(ompP2)的复合突变株SW1ΔApxIC/ompP2。该突变株经鉴定,与SW1亲本株相比,其缺失了大小为475bp的apxIC基因,同时嵌合有大小为1107bp的Hps ompP2基因,其基本生长特性与亲本株(SW1)没有显著区别;同时在体外,连续传代10代之后缺失的apxIC基因不会发生回复突变,嵌入的ompP2基因仍能够稳定遗传。本研究成功构建了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌缺失apxIC基因并嵌合有Hps ompP2基因复合突变株,为今后研究APP和Hps新型二联疫苗打下基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌环介导等温扩增检测方法的建立与应用

本文建立了敏感、特异的胸膜肺炎放线杆菌环介导等温扩增检测方法。以1型胸膜肺炎放线杆菌ApxIV基因片段为靶序列设计了一组引物,并建立了LAMP反应体系,在63℃等温条件下反应45min,最低能检测到102个拷贝的目的基因,敏感性是PCR方法的10倍。通过对1～10型胸膜肺炎放线杆菌、多杀巴氏杆菌、链球菌、支原体等18种病原微生物的检测,证明该法具有很强的种特异性。另外,通过对8头实验感染猪和127份临床发病猪的鼻拭子的检测发现,该法对鼻拭子中胸膜肺炎放线杆菌的检出率为100%,优于PCR方法。     

鸡传染性支气管炎病毒（IBV）广西流行株3＇端非编码区序列分析

本研究应用RT-PCR方法扩增出分离自广西的26株鸡传染性支气管炎病毒（IBV）以及参考株M41和疫苗株H120、Ma5和4/91的3＇端非编码区（3＇UTR）的cDNA,并对其进行了克隆、序列测定、比较及其系统进化分析。序列分析结果表明,与Beaudette株的3＇UTR序列相比较,26株分离的IBV中有1株和3株的分离株3＇UTR序列分别插入了23个和2个碱基,另外有12株、6株、1株、2株和1株的分离株3＇UTR序列分别缺失了1个、2个、22个、29个和84个碱基,不同毒株之间碱基数量最大相差达107个碱基。系统进化分析结果表明,26株分离株可分为4群,其中21株属于第Ⅰ群,与经典疫苗株H120的核苷酸同源性均较低（54.4%～75.5%）;3株与4/91同属于第Ⅱ群;1株与H120同属于第Ⅲ群;另外1株单独属于Ⅴ群。综上所述,广西流行IBV的绝大部分毒株在3＇UTR序列上与目前常用的疫苗株相比都发生了很大的变异,而且存在多种形式的碱基缺失和插入现象。由此,我们认为流行株的变异可能是疫苗不能提供有效保护的主要原因。     

实时荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌方法的建立

建立了一种检测Ⅱ型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2)的实时荧光PCR(real-time fluorescence polymerase chain reaction)方法。用Primer Express2.0和Oligo6.0设计针对Ⅱ型猪链球菌荚膜抗原基因簇中cps2I基因的引物和Taqman荧光探针。通过常规PCR方法扩增得到81 bp DNA片段，克隆到pMD18-T载体，测序表明得到的序列为目的基因片段。在Lightcycler荧光PCR仪上对Ⅱ型猪链球菌的扩增曲线表明，该实时荧光PCR具有良好的特异性，可成功地扩增Ⅱ型猪链球菌，而参考猪链球菌(S.suis)、大肠杆菌(Escherichia coli )、沙门氏菌(Salmonella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureu)、志贺氏菌(Shigella)、单增李斯特氏菌(Listeria monocytoge)和空白对照都是阴性；该检测方法可达到检测10个细菌的灵敏度，反应过程仅需30 min完成；在两个不同时间检测同一浓度的菌液，每次做20个重复，2次检测所得的Ct (threshold，阈循环)值之间无统计学差异(P > 0.05)，方法稳定性好。该实时荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌的方法可用于出入境检疫和动物防疫监督部门的疫情监测。     

有机物料对白土土壤胡敏酸结构特征的影响

【目的】研究有机物料施入对白土土壤的腐殖质含量组成和胡敏酸(HA)结构特征的影响,为明确不同腐殖质组分对土壤肥力的影响提供理论依据。【方法】供试土壤为江苏省溧阳市南渡镇"白土改良大田示范试验核心区"的南方中低产水稻土(白土)。试验设秸秆还田(ST)、施有机肥(OM)和对照(CK,不施有机物)3个处理,培肥3年。同时采集试验田周围相邻的江苏省耕地质量监测点(2007~2013年)的每年施化肥(LAF)和长期不施肥(NF)的两种处理土壤进行比对研究。分别测定土壤的基本理化性质及其腐殖质含量的组成,并提取土壤胡敏酸(HA)固体样品利用红外光谱和元素分析来进行结构表征。【结果】秸秆还田和施有机肥处理的有机碳、全氮含量明显高于对照;与对照相比,施有机物料土壤HA的E4/E6比值增加,且秸秆还田施有机肥对照。红外光谱显示,试验区域和耕地监测点的不同处理土壤HA均在1650 cm-1处(酰胺I带)和1550 cm-1处(1500~1580 cm-1酰胺II带伸缩振动)有特征吸收。施有机肥和秸秆还田处理土壤HA的2920/1720、2920/1650比值显著大于对照。在元素组成上,OM、ST处理的土壤腐殖质(HA)中C、H、N的含量比均高于CK,相对长期施化肥(LAF)和不施肥(NF)的土壤有明显提高,而氧元素的含量呈降低的趋势;OM和ST处理土壤HA的[H]/[C]和[O]/[C]原子数比均低于CK;与LAF和NF处理相比,试验区域各处理土壤腐殖质的[H]/[C]和[O]/[C]原子数比均有明显降低。【结论】有机物料施入土壤后可增加土壤有机碳含量,改善土壤理化性质,提高作物产量和品质,且施入土壤的有机物料可转化为新的腐殖质,降低土壤的腐殖化程度。土壤腐殖质(HA)的红外光谱分析说明,白土土壤HA具有明显的酰胺类化合物特征。有机物料施入后使得土壤脂族性增强,羧基量减少,芳香度降低;秸秆还田和施有机肥处理与对照相比,土壤HA的[H]/[C]和[O]/[C]比均有下降的趋势,且HA的氮素含量明显增加,这显示有机物料施入后白土土壤腐殖质发生"脱水"过程,同时也反映了白土土壤腐殖质形成的特征。     

银杏内生真菌刺盘孢遗传多样性的初步分析

为了研究银杏内生真菌的刺盘孢菌株的遗传分化,选用了分离自江苏5个县市的14个菌株,利用RAPD技术进行遗传多样性分析。从20个随机引物中筛选出5个引物,扩增出62条DNA带,在此基础上分析并建构了遗传相关聚类图。结果表明,不同地区的刺盘孢菌株其遗传差异性不同,14个菌株可聚为两大类,其中启东、邳州的6株聚为一类,南京、南通和泰兴的8株又聚为一类。所有的14个菌株的相似性系数范围在46%~89%。     

近年来大肠杆菌K88ac菌毛的变异和生物学特性

2000~2005年，从猪大肠杆菌病 (colibacillosis)中分离到一些表达K88菌毛的大肠杆菌(Escherichia coli )，这些分离株只与K88 a因子单抗反应，而不与K88 b、c和d因子单抗反应。分离的菌株 (13/16)以O149为常见血清型，且全部拥有STb毒素基因，通过K88常规血清交叉吸收试验、SDS-PAGE和Western印迹，表明这些菌株不仅与K88ac参考菌株C83907制备的c因子血清反应，而且与以分离株SEC586制备且经K88ab、K88ac和K88ad参考菌株吸收后的血清也反应，表明这些分离株仍为K88ac大肠杆菌。对新近分离的SEC464、SEC525、SEC586、SEC799和EC910株及80年代我国分离的TM128株的K88主要亚单位结构基因faeG进行克隆、测序，发现新近分离株的faeG基因由846对核苷酸组成，编码菌毛主要亚单位的261个氨基酸及21个氨基酸的信号肽，比国内外报道的K88ac FaeG亚单位 (262个氨基酸)少了一个氨基酸，比K88ab、K88ad (264个氨基酸)少了3个氨基酸。TM128株的FaeG氨基酸序列与K88ac(M29375)的同源性为100.0%，SEC464、SEC525、SEC586、SEC799和SEC910株的FaeG亚单位氨基酸序列的同源性为97.7%~99.6%，它们与K88ac的同源性为94.6%~96.6%；与K88ab的同源性为90.0%~91.6%；与K88ad的同源性为87.0%~88.9%。 结果表明新分离的K88ac大肠杆菌黏附素主要亚单位已发生了部分变异。     

广西桑树细菌性枯萎病菌致病力和遗传多样性分析

从广西9个县市采集具有典型枯萎症状桑树样品和发病田块土壤样品,经分离纯化获得致病性菌株105株。依据在桑树品种桂桑优12的致病性强弱,将广西桑树细菌性枯萎病菌株分为强致病力（57株）、中等致病力（17株）和弱致病力（31株）三种致病型。对48个代表性致病菌株进行16S rDNA和rpoB基因序列测定,同源性分析和系统进化树分析结果显示,这48个菌株分别为阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae（16株）、阿氏肠杆菌（E.asburise）（13株）、桑肠杆菌（E.mori）（7株）、产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）（3株）以及未确定种的肠杆菌属（Enterobacter sp.）3株、克雷伯氏菌属（Klebsiella sp.）6株。阿氏肠杆菌和阴沟肠杆菌出现的频率最高,是广西的优势菌株。研究结果表明,广西桑树细菌性枯萎病菌具有丰富的遗传多样性。     

猪舍环境适宜性模糊综合评价

猪舍环境是影响猪健康水平、生长和繁殖的重要因素,对养猪生产起着决定性作用,受到广泛的关注。然而,猪舍环境是由多个环境因子相互耦合而形成的复杂的非线性时变系统。对各环境因素适宜性的描述并不是一个确定的数值,而是在一定范围内的模糊概念。目前,针对猪舍环境优劣评价大多仅限于单一环境因素,缺少基于多个环境因素的猪舍环境适宜性综合评价研究。因此,该文构建了评价指标体系和权重,根据猪舍养殖环境标准建立各环境因子的隶属度函数,提出了基于模糊集理论的猪舍多环境因子适宜性综合评价方法。以美国普渡大学 SERB 猪舍环境监测的24组数据为例对该文提出的方法进行了验证,结果表明,该文建立的猪舍环境适宜性模糊综合评价方法比单一环境因素的评价更加全面,能科学合理地反映出猪舍环境质量状况,可以很好地为猪舍环境调控提供数据参考。     

航恢七号空间诱变变异株系的稻瘟病抗性研究

本研究对卫星搭载水稻品种航恢七号SP3代株系进行稻瘟病抗性鉴定研究,并对抗性变异株系作分子生物学分析。结果表明,250个航恢七号SP3代农艺经济性状优良株系经接种后,抗性变异株系H24对菌株GD3286表现抗性分离,分离比例为119∶108,其抗性遗传可能受2对互补抗病基因控制,且在SP4代仍存在抗性分离;H24SP5代株系的抗谱较原种对照显著提高,其抗谱达到84.4%,而原种对照的抗谱仅为40.6%,且H24对部分致病谱较广或专化性致病菌株表现抗病突变。经全基因组内微卫星多态性分析,H24与原种对照间未表现DNA多态性。     

Chemical structures of manure from conventional and phytase transgenic pigs investigated by advanced solid-state NMR spectroscopy

Nonpoint phosphorus (P) pollution from animal manure is becoming a serious global problem. The current solution for the swine industry includes the enzyme phytase as a component in oil meal and cereal grain-based swine diets. A long-term approach is the production of transgenic phytase pigs that express phytase in the salivary glands and secrete it in the saliva. This study provides a detailed comparison of chemical structures of manure from conventional pigs and transgenic pigs that express phytase under growing and finishing phases using new solid-state NMR techniques. Spectral editing techniques and quantitative NMR techniques were used to identify and quantify specific functional groups. Two-dimensional (1)H- (13)C heteronuclear correlation NMR was used to detect their connectivity. Manure from conventional and transgenic pigs had similar peptide, carbohydrate, and fatty acid components, while those from transgenic pigs contained more carbohydrates and fewer nonpolar alkyls. There was no consistent effect from diets with or without supplemental phosphate or growth stages.