大蕉枯萎病病原菌的分离、鉴定和致病性测定

从表现枯萎病症状的大蕉球茎病组织中获得10株分离物,采用形态学分类方法将这些分离物鉴定为尖孢镰刀菌.利用分离物DJ1的rDNA-ITS区序列和IGS序列开展的系统发育分析迸一步确定DJ1为尖孢镰刀菌.对不同香蕉品系的致病性测定结果表明,DJ1对粉蕉(Musa sp.ABB)的致病性最强,其次是特威(Musa sp.AAA)、巴西蕉(Musa sp.AAA)和泰蕉(Musa sp.AAA),对皇帝蕉(Musa sp.AA)的致病性较弱,根据DJ1的寄主范围确定DJ1为尖孢镰刀菌古巴专化型生理4号小种.对IGS序列的进一步比对分析表明DJ1不属于热带4号生理小种菌株.这些结果为大蕉枯萎病的防治提供了重要依据和指导.     

香蕉枯萎病菌pgx4基因的克隆与序列分析

为了解pgx4基因在尖孢镰刀菌古巴专化型侵染香蕉过程中的作用,及其与尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号之间的致病力差异的关系,以尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种和4号生理小种的基因组DNA和cDNA为材料,采用PCR和RT-PCR方法扩增了2个生理小种的pgx4基因,并对扩增产物进行克隆测序后再用生物信息学软件对序列进行比对分析.结果表明:2个生理小种pgx4基因的开放阅读框均为1 395 bp,编码465个氨基酸,且前17个氨基酸均构成该基因的信号肽.通过DNAStar 7.1比对发现,尖孢镰刀菌古巴专化型2个生理小种pgx4基因的核苷酸序列存在25个碱基的差异,而其编码的465个氨基酸中,也有3个氨基酸不同,分析这些核苷酸序列和氨基酸序列的差异可能与尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种和4号生理小种在侵染蕉类不同栽培种时的识别专性寄主机制有一定关系.     

尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种fpd1基因敲除与表型分析

为了研究尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种fpd1基因的功能,构建了该基因敲除突变体并对其表型特征进行了分析。结果表明,与野生型菌株相比,fpd1基因敲除突变体生长减慢,产孢量显著降低,对巴西蕉的致病性明显减弱;fpd1基因可能在尖孢镰刀菌古巴专化型的产孢、生长发育和致病性等方面具有重要作用。本研究结果为进一步研究fpd1基因的功能和尖孢镰刀菌的致病机理奠定了基础。     

香蕉枯萎病菌假定分泌蛋白SP10的功能分析

为了研究尖孢镰刀菌古巴专化型假定分泌蛋白基因SP10的在致病过程的作用,构建SP10基因敲除菌株,分析SP10敲除菌株的表型特征。结果表明:SP10基因敲除菌株在菌丝生长、产孢和菌落形态等方面无明显变化,但SP10基因敲除菌株对巴西蕉的致病性减弱;在接种30 d后,采用共聚焦显微镜显微观察香蕉根系,结果显示,SP10基因敲除菌株可在根系维管束中定殖。上述结果表明,假定的分泌蛋白SP10参与调控尖孢镰刀菌对香蕉的致病性,但不参与该病原菌生长和发育的调控。此结果为进一步研究尖孢镰刀菌分泌蛋白的功能奠定了基础。     

香蕉枯萎病菌的致病性测定及其RAPD分析

以分离自海南、广东的18个香蕉枯萎菌菌株为试验材料,进行致病性测定及RAPD分析.结果表明,分离自粉蕉的12个菌株为1号生理小种,而分离自巴西蕉的6个菌株为4号生理小种;1号生理小种菌株侵染粉蕉的发病率与4号生理小种菌株侵染粉蕉、巴西蕉的发病率都是100%;采自海南三亚市荔枝沟镇的15号菌株为强致病性的菌株,与其它5个4号小种菌株相比,差异显著;RAPD分析能区分1号4号生理小种,菌株的地理来源,致病力;引物OPM-15能用来鉴定1号和4号生理小种.     

尖孢镰刀菌古巴专化型fgb1基因敲除突变体的构建与表型分析

为了研究尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白β亚基编码基因fgb1的功能,构建fgb1基因敲除突变体,分析fgb1敲除突变体的表型。结果表明:敲除fgb1基因导致突变体菌落在PDA培养基上生长减慢,产孢量和菌丝分枝减少;致病性测定结果表明fgb1基因敲除突变体对巴西蕉的致病性减弱;用激光共聚焦显微镜观察感病香蕉根系,发现fgb1基因敲除突变体仍可在根系维管束中定殖。本研究结果为进一步研究G蛋白信号传导途径在尖孢镰刀菌古巴专化型中的作用奠定了基础。     

Red Fluorescent Protein Gene (DsRed) Transformation of Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4

采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化体系,成功地将红色荧光蛋白基因DsRed转入到尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种B2菌株中.在显微镜下观察连续转接6代的转化子,结果都可以观察到很强的红色荧光,表明DsRed基因在转化的B2菌株中能稳定遗传.通过PCR验证,也表明红色荧光蛋白基因DsRed已经转入到尖孢镰刀菌中.对香蕉的致病力测定结果表明,转化子与野生型菌株B2相比没有明显差异.     

香蕉枯萎病菌4号生理小种cat1基因敲除与表型分析

前期蛋白质组学研究发现尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Foc4)中的过氧化氢酶1(cat1)基因受到巴西蕉诱导上调表达,为研究cat1基因在Foc4侵染香蕉过程中的作用,利用同源重组方法敲除Foc4的cat1基因,并对获得的敲除突变体开展表型分析和致病性测定。结果表明:cat1基因缺失对Foc4的菌丝、孢子形态、菌落生长、抗渗透压胁迫和细胞壁选择性压力等没有影响;但引起菌株抵抗外源氧胁迫、细胞壁穿透能力、纤维素利用能力减弱和对巴西蕉的致病性减弱。显示cat1基因的产物通过清除香蕉分泌的活性氧在Foc4对香蕉的致病过程中起作用,并参与病原菌对寄主纤维素成分的代谢。此结果为进一步深入研究香蕉枯萎病菌的致病机理奠定基础。     

香蕉枯萎病菌ste12基因的克隆与序列分析

为了解ste12基因在尖孢镰刀菌古巴专化型侵染香蕉过程中的作用,及其与尖孢镰刀菌古巴专化型1号和4号生理小种之间的致病力差异关系,采用PCR和RT-PCR方法扩增了2个生理小种的ste12基因,并对扩增产物进行了测序及相似序列搜索和比对,还对基因编码的蛋白进行了氨基酸序列比对和分析。研究结果表明,2个生理小种ste12基因开放阅读框均为2070 bp,存在7个碱基的差异,基因同源性为99.7%。编码689个氨基酸,氨基酸序列一个有差异。根据生物信息学软件预测编码蛋白没有信号肽,具有两个相同的功能位点,分子量和PI分别为75 ku和6.47。     

香蕉枯萎病菌菌株致病力分化及其原因研究

以田间表现出枯萎病症状的香蕉和粉蕉组织中分离获得的13株尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)为试验材料,分别测定了不同菌株对香蕉(巴西蕉)和粉蕉(广粉一号)的致病力以及在不同培养液中产生的细胞壁降解酶的活性和毒素含量。结果表明:不同菌株对香蕉和粉蕉的致病力存在明显差异;相关性分析显示,不同菌株产细胞降解酶活性与相应菌株侵染引起的寄主病情指数无相关性,产镰刀菌酸的含量与寄主病情指数呈极显著正相关(r=0.9326)。认为香蕉枯萎病菌菌株间产镰刀菌酸能力的不同是导致其致病力出现分化的主要原因之一。     

香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种在几种培养基上的生长特性

测定10株分离自广东省不同香蕉种植区的香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种在不同培养基上的形态、生长速率和产孢能力的差异。结果显示,不同生理小种菌株在PDA、Komada改良培养基、粉蕉组织浸提液培养基和香蕉组织浸提液培养基上的形态、生长速率和产孢能力等特性差异不明显,不能依据这些特性区分1号和4号生理小种;但在康乃馨叶片琼脂(Carnation leaf agar,CLA)培养基上产生的孢子形态具有明显差异,4号生理小种的菌株产生典型的尖镰刀状大孢子,孢子多6个隔,长约(36.80±5.33)～(44.93±4.80)μm,宽约(3.40±0.20)～(4.27±0.25)μm,占总孢子数的比例较大,为(40.87±9.67)%～(62.50±7.84)%,而1号生理小种个体产生的大型孢子前端钝圆,弯曲程度低,多4个隔,孢子长约(22.31±3.89)～(25.01±6.16)μm,宽约(3.42±0.23)～(3.90±0.24)μm,占总孢子数的比例很小,为(2.55±1.95)%～(4.50±1.76)%。     

巴西蕉诱导的香蕉枯萎病菌1号和4号小种致病相关基因表达分析

目前对于香蕉枯萎病菌的致病分子机制尚不十分清楚。为了阐明枯萎病菌的致病分子机制,从香蕉枯萎病菌1号(Foc1)和4号小种(Foc4)的比较蛋白质组学分析发现的表达量差异较大的蛋白中,选取了9个致病相关蛋白或潜在的致病基因,利用荧光定量PCR方法进行基因表达谱分析。结果显示：与对照相比,巴西蕉处理的Foc4中,上调表达的基因有：酰胺转移酶基因（amidotransferase）、线粒体过氧化物还原酶基因（mitochondrial peroxiredoxin）、几丁质酶基因（chitinnase 1）、羧肽酶基因（carboxypeptidase cpds）,差异表达不明显的有腺苷激酶基因（adenosine kinase）、NADP-依赖型甘油脱氢酶基因（NADP-dependent glycerol dehydrogenase）、磷酸甘油酸激酶基因（phosphoglycerate kinase）、谷胱甘肽还原酶基因（glutathione reductase）、酰胺酶基因（amidase family protein）。Foc1中,与对照相比,上调表达的基因有：腺苷激酶基因、NADP-依赖型甘油脱氢酶基因,下调表达的基因有：酰胺转移酶基因、羧肽酶基因。综合分析显示,酰胺转移酶、过氧化物酶、几丁质酶、羧肽酶基因可能在Foc4的致病作用中起作用。     

香蕉枯萎病菌2个生理小种MAPK基因的克隆及序列分析

为了解香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)1号生理小种(race 1)和4号生理小种(race4)丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)基因focMK1,focMK4的序列差异,根据番茄枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)的MAPK基因相关序列设计引物,利用PCR和RT-PCR技术,分别克隆了香蕉枯萎病菌2个生理小种的基因序列和开放阅读框。结果表明,所获得的2个MAPK基因均含有3个内含子和4个外显子,2个基因序列只有一个碱基差异,编码氨基酸355个,氨基酸组成无差异;根据生物信息学软件预测编码蛋白没有信号肽,具有2个功能位点,分子量和pI分别为41ku和6.47。该基因编码的蛋白具有高度保守性,与大多数植物致病菌的同源性都在90%以上,不同病原镰刀菌间的同源性接近100%。     

我国燕麦秆锈菌生理小种与毒力分析

为了解当前我国燕麦秆锈菌生理小种及其毒力现状,利用12个北美燕麦秆锈菌单基因鉴别寄主,对2013年采集的7份和2012保存的4份燕麦秆锈病标样进行小种与毒力鉴定,并用Pg a-code字母命名系统命名小种,以16个单基因系测定毒力频率。结果表明,从11份燕麦秆锈菌标样中分离成活了26个单孢子堆菌株,鉴定出TKR、TJM和TKM三个生理小种,出现频率分别为61.6%、30.8%和7.6%。26个菌株对Pg 6和Pg 15无毒力,对Pg 10、Pg 13、Pg a和Rodney 0的毒力频率分别为69.2%、61.6%、61.6%和84.6%,对Pg 1、Pg 2、Pg 3、Pg 4、Pg 8、Pg 9、Pg 12、Pg 16和Marvellous毒力频率高达100%。说明当前我国燕麦秆锈菌优势小种为TKR,次优势小种为TKM;Pg 6和Pg 15为有效抗病基因,Pg 1、Pg 2、Pg 3、Pg 4、Pg 8、Pg 9、Pg 12、Pg 16和Marvellous则为无效抗病基因,Pg 10、Pg 13、Pg a和Rodney 0对我国燕麦秆锈菌具有一定的区分作用。     

香蕉枯萎病菌1号生理小种遗传转化体系的建立

利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化方法,建立香蕉枯萎病菌1号生理小种(Fusariumoxysporum f.sp cubense race 1)遗传转化体系,并对影响转化效率的因子进行优化,明确了高效转化的条件为:农杆菌OD600为0.15,AS诱导浓度为150μmol/L,诱导时间为7 h,Focr1-N2孢子浓度为1×106个/mL,潮霉素B筛选的浓度为150μg/mL,诱导培养基pH值为5.5,共培养温度为25℃,共培养时间为48 h为最佳条件。构建了包含1 200个突变体的突变体库,并对1 200个突变体进行了致病性测定,初步筛选出致病性丧失突变体20个,致病性显著减弱突变体18个,致病性严重增强突变体53个。     

2011年西藏地区小麦条锈菌生理小种群体结构分析

为了解西藏地区小麦条锈菌生理小种群体结构,2011年对采自西藏地区的130份小麦条锈菌标样进行鉴定并进行了群体结构分析。结果表明,西藏地区小麦条锈菌群体结构复杂,小种类型丰富;共监测到26个小种(类型),分别是CYR17、CYR18、CYR19、CYR20、CYR26、Lov10-2、Lov10-3、Lov10-14、Lov10-15、Lov13-4、CYR31、CYR32、HY-6、HY-13、CYR33、Su11-1、Su11-2、Su11-3、Su11-4、Su11-5、Su11-6、Su11-8、Su11-10、Su11-25、Su11-35、Su11-45。其中,CYR32频率最高,达到31.54%;其次为CYR33,频率为28.46%;跟随其后的Su11-1和Su11-4频率均为6.15%。这4个小种为西藏地区优势小种,是当前西藏地区抗条锈病育种的主要考虑对象。其他小种(类型)频率均低于5%。毒力频率分析表明,Yr1、Yr3、Yr6、Yr9、YrA等抗性基因在西藏地区已经失效。     

小麦对秆锈菌新小种Ug99的抗性研究进展

为了及时了解国际小麦育种的发展动态,介绍了国外在小麦秆锈病新小种Ug99抗性方面的研究进展,主要包括成立国际锈病研究协作网,负责全球范围的小麦锈病研究;基本明确了Ug99的可能传播路线;在肯尼亚对17个国家和组织的4157份小麦品种进行了抗性鉴定,337份表现抗病,为抗病育种提供了重要亲本;明确了现有抗性基因的利用价值,建议利用Sr2、Sr24、Sr26、Sr36、SrTmp和来自1A／1R易位的未知抗性基因,采用持久抗性与主效基因相结舍的策略,通过分子标记辅助选择提高品种选育效率。最后提出了国内技术储备的主要内容。     

Race diversity and virulence complexity ofPhytophthora infestans in Nepal

Summary A total of 251Phytophthora infestans isolates collected during 1999–2000 potato growing seasons from nine potato growing areas of Nepal were tested for virulence using a set of eleven potato differentials. The virulence test revealed the presence of 30 races with the most frequent being 4.11, 4 and 11. Twenty-nine percent of isolates belonged to simple races having none to one virulence factor, whereas 71% had complex virulence factors governed by 2 to 7 genes. Gleason and Shannon indices of 5.24 and 2.59, respectively, showed a moderate level of diversity in NepaleseP. infestans populations. Shannon indices comparison among regional populations revealed significant differences (t-test, P<0.001) in the diversity. The population from hills were the most diverse followed byterai and the high hill populations. The virulence complexities were minimal in Nepalese populations. The implications of these findings in association with the potato cultivation system in Nepal are discussed.     

中国水稻白叶枯病菌小种C8菌株无毒基因的分离及功能鉴别

 白叶枯病菌与水稻间的互作符合基因对基因模式,不同小种中存在特异的avrBs3/pthA家族基因。对中国水稻白叶枯病菌小种C8菌株基因组DNA进行BamHⅠ酶切和Southern杂交,发现了其特有的约6.0 kb大小、含avrBs3/pthA家族基因的信号条带。经文库筛选、Southern杂交和限制性酶切分析,获得了C8小种avr/pthC8a基因。将该基因导入菲律宾小种6 的代表菌株PXO99A中,发现avr/pthC8a可使PXO99A丧失对水稻品种Asominori（携有成株期抗性基因Xa17）的毒性,暗示avr/pthC8a可能是与Xa17相应的无毒基因。序列分析发现,avr/pthC8a基因大小为3816 bp,编码1272个氨基酸,由102 bp编码的34个氨基酸重复单元在基因内的重复数为20.5个,其3′端的BamHⅠ酶切位点由GGATCC突变为AGATCC,其他特征均与avrBs3/pthA家族的成员相似,即C端存在1个亮氨酸拉链、3个核定位信号和1个酸性转录激活域。avr/pthC8a基因3′端的BamHⅠ酶切位点发生突变在avrBs3/pthA家族基因中鲜有报道。中国C8小种avr/pthC8a基因的发掘,为进一步了解水稻黄单胞菌毒性变异以及avrBs3/pthA家族基因的进化提供了理论依据。