葡萄果实cDNA文库的构建及鉴定

构建葡萄果实cDNA文库是研究果实发育相关基因表达调控的基础工作.本实验从巨峰葡萄果实中提取了高质量的RNA,利用MMLV反转录酶把总RNA中的mRNA反转录成cDNA第一链,用特异引物进行LD-PCR扩增合成双链cDNA.将分级纯化的带有粘性末端双链cDNA与λTrip Ⅰ Ex2载体连接,重组载体体外包埋成为cDNA原始文库.初步鉴定原始文库的滴度为1.32×106 pfu/mL,文库扩增后滴度达1.45×1010 pfu/mL.从扩增文库中随机挑取250个克隆进行PCR鉴定,结果表明重组率为98.7%,插入片段大小在0.5～2.0 kb之间,因此,本研究成功构建了葡萄果实cDNA文库.     

甘薯高类胡萝卜素突变体农大辐14块根cDNA文库的构建及鉴定

为分析和克隆甘薯块根中类胡萝卜素生物合成的相关基因,以甘薯品种高系14号经60Coγ射线慢照射结合茎尖培养获得的高类胡萝卜素含量突变体农大辐14的块根mRNA为材料,利用Clontech SMART cD-NA LibraryConstruction Kit构建了其cDNA文库.初始文库的独立克隆为0.57×106 pfu,滴度为4.9×106 pfu/mL,重组率为88%,插入片段大小为0.3～2.5 kb,大于0.4 kb的克隆比例为70%,独立克隆数为理论值的3倍.扩增文库的滴度为5×109 pfu/mL.鉴定结果表明该文库可用于基因克隆与分析.     

巴西橡胶树茉莉酸诱导胶乳cDNA文库的构建

摘要：以巴西橡胶树热研7-33-97为材料,对橡胶树割线下方施用0.1%茉莉酸,采集胶乳,提取胶乳总RNA并纯化mRNA,构建巴西橡胶树茉莉酸诱导胶乳融合表达文库。检测表明,获得的初级文库滴度为1.9×106 pfu/ml,插入片段在0.5到5kb之间,平均大小为1kb左右;表明该文库质量合格,为今后克隆胶乳中的茉莉酸信号应答基因奠定基础。     

干旱胁迫下耐旱稻中旱3号全长cDNA文库的构建

干旱胁迫导致很多基因的表达发生变化.以干旱胁迫下的耐旱稻品种中旱3号为材料,我们用SMART技术(RNA转录5'末端模板转换技术)成功构建一个高质量的干旱胁迫诱导的节水抗旱稻中旱3号全长cDNA文库.体外包装后感染大肠杆菌XL1-Blue宿主菌,未扩展文库的滴度为1.94×10pfu/mL,重组率为85.15%.扩展后文库的滴度为1.45×1011 pfu/mL.将九噬菌体臂转入pTriplEx2质粒,从中随机挑选100个克隆,PCR扩增检测插入片段长度,结果显示文库插入片段在500～2 000 bp之间.     

小麦条锈菌诱导性小麦cDNA文库的构建及其质量评价

小麦条锈病是由小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)侵染引起的世界性气传叶部病害之一,在我国发生尤为普遍而严重,是小麦(Triticum aestivum L.)生产上最重要病害,克隆并研究小麦抗条锈病相关基因的生物学功能具有重要的应用价值和现实意义.在本研究中用中国当前毒性最强优势条锈菌小种CY32侵染诱导的小麦抗条锈病基因Yr5近等基因品系Taichung29*6/Yr5为试材,构建非亲和条锈菌小种侵染诱导的小麦cDNA文库.研究结果表明所获得的原始文库滴度0.9x106 pfu/mL,扩增文库滴度1.0x109pfu/mL,重组率98%,插入片段在0.5 kb到3.0 kb之间,多在1.0 kb左右.因此该文库可用于基因克隆与分析,为研究小麦抗条锈病相关基因提供条件.     

夏黑葡萄花及果实全长cDNA文库的构建及鉴定

构建葡萄花果全长cDNA文库是开展葡萄花及果实发育的分子机理研究的重要工作基础,有助于重要相关基因的克隆、功能分析、调控及其利用.以生产上广泛栽培、性状优良且极具代表性的夏黑葡萄为试材,应用优化的Creator SMART cDNA Construction Kit技术,构建了夏黑葡萄花和果实的全长cDNA文库.文库的滴度为1.2×106 pfu/mL,库容为6.0×106 pfu/mL.从文库中随机挑取30个克隆进行菌落PCR鉴定的结果显示:插入片段大小为1.0~3.0 kb,重组率为99%.研究结果表明,该葡萄全长cDNA文库具备较高的质量.     

抗草甘膦真菌(Candida palmioleophila)分离鉴定及其cDNA文库构建

利用瓶培养富集技术从生产草甘膦工厂排污口的污泥中筛选抗草甘膦菌株,通过菌株形态学鉴定、生理生化特性测定及18S rRNA序列分析,确定其为假丝酵母菌(Candida palmioleophila)。以供试的抗草甘膦菌株总RNA为起始模板,利用Clontech公司的SMARTer技术构建cDNA文库。文库质量鉴定表明:原始文库滴度为2.58×106cfu/mL,扩增后文库滴度为3.42×109cfu/mL,文库库容为2.58×106cfu,重组率为97.6%,插入片段范围为500bp~3kb,主要集中在1kb附近。表明构建的TY-JM的cDNA文库质量符合要求。     

巴西橡胶树地上部地下部均一化酵母双杂交cDNA文库构建及评价

缺磷是影响橡胶树产量的主要因素之一,蛋白泛素化在其中发挥了重要作用。为研究泛素化在橡胶树低磷胁迫中的调控作用,本研究分别以巴西橡胶树"热研7-33-97"组培苗地上部和地下部为材料,构建酵母双杂交文库,并对其进行了评价。首先用CTAB法大量提取橡胶树地上部和地下部总RNA,再用PROMEGA试剂盒处理获得纯化的m RNA,然后采用SMART誖技术和LD-PCR合成双链cDNA(ds-cDNA),继而通过双链特异性核酸酶(DSN)对ds-cDNA进行均一化处理,再经CHROMA SPIN+TE-400柱子纯化长片段的cDNA,最后将获得的长片段cDNA和线性化载体p GADT7-Rec共转化酵母Y187感受态细胞,构建均一化酵母双杂交文库。结果显示:地上部文库滴度8×107cfu/m L,插入片段≥0.5 kb的重组率为100%;地下部文库滴度7×107cfu/m L,插入片段≥0.5 kb的重组率为87%。该结果表明文库已成功构建,可以用于进一步实验。     

干旱胁迫下耐早稻中早3号全长cDNA文库的构建

干旱胁迫导致很多基因的表达发生变化。以干旱胁迫下的耐旱稻品种中旱3号为材料,我们用SMART技术(RNA转录5'末端模板转换技术)成功构建一个高质量的干旱胁迫诱导的节水抗旱稻中旱3号全长cDNA文库。体外包装后感染大肠杆菌XL1-Blue宿主菌,未扩展文库的滴度为1.94×106pfu/mL,重组率为85.15%。扩展后文库的滴度为1.45×1011pfu/mL。将λ噬菌体臂转入pTriplEx2质粒,从中随机挑选100个克隆,PCR扩增检测插入片段长度,结果显示文库插入片段在500~2000bp之间。     

阔褶水蛙皮肤组织cDNA文库的构建及抗菌肽brevinin-2LTs的eDNA克隆和序列分析

运用SMART技术成功构建了阔褶水蛙(Hylarana latouchii)皮肤组织全长cDNA文库,用来筛选抗菌肽及其他功能性基因.经鉴定,原始文库滴度为9.7×106 cfu/mL,重组率达到91%,插入片段大小在0.3～1.5 kb)范围内,文库扩增后的滴度为1.9×109 cfu/mL,说明所构建文库质量较高.通过该文库成功筛选出2个抗菌肽cDNA序列,此序列属于brevinin-2家族,因此命名为brevinin-2LT1和brevinin-2LT2.     

枸杞中番茄红素β-环化酶基因(LycB)的分离

以宁夏枸杞叶片为材料,采用异硫氰酸胍—酚—氯仿法提取完整的总RNA,利用PolyATract mRNA Isolation System(Promega公司)分离mRNA,然后利用Universal Riboclone RcDNA Synthesis System(Promega公司)合成双链cDNA,在cDNA末端连接上EcoRⅠ接头,并与λExCell载体连接,利用Packagene Lambda DNA Packaging System进行包装,在国内外首次构建出滴度为2.78×105 pfu/ml,重组效率为88.1%的枸杞叶片cDNA文库。用Digoxigenin(DIG)标记龙胆草LycB探针,并对枸杞叶片cDNA文库进行筛选,获得5个LycB cDNA阳性克隆。释放质粒后,进行酶切鉴定,LycB阳性克隆cDNA插入片段的大小为2.1kb左右。为利用基因工程手段来调控类胡萝卜素的生物合成奠定了基础。     

链格孢菌（Alternaria tenuissima）cDNA酵母表达文库的构建

为了解链格孢菌（Alternaria tenuissima）遗传学背景,克隆及研究该菌功能基因,根据Gateway技术构建了既能在酵母细胞中表达外源基因又能在原核细胞大量复制的酵母表达载体pRS-DEST42,构建了细极链格孢菌（A. tenuissima）cDNA酵母表达文库。经检测,该文库的平均滴度为2.44×106（cfu/ml）,文库总容量为2.44×107,阳性克性率为100%,平均插入片段约为1.38kb。细极链格孢菌（A. tenuissima）cDNA酵母表达文库是一个质量较高的表达文库,为克隆与分离全长目的基因及其功能奠定了坚实的基础。     

油脂形成期棉花种子全长cDNA文库的构建

 提取海岛棉7124开花后25～35 d胚的总RNA,利用SMART技术,经21轮LD-PCR扩增获得全长双链cDNA,经SfiⅠ酶切、层析柱分离后,收集500 bp以上的片段与pDNR-Lib载体连接并转化到感受态DH10B细胞,构建了棉花种子全长cDNA文库。所构建的原始文库库容为5×10⁶,文库滴度为1.5×10⁸ cfu·mL^-1。在文库中随机挑取180个克隆进行PCR检测,结果显示,文库中插入片段长度为0.5～2.5 kb,将挑取的180个单克隆进行EST测序,无空载序列,说明文库重组率为100%;序列分析结果表明,其中与油脂形成相关的EST有13条。以上数据说明构建的文库质量较高,为进一步从文库中分离棉花脂肪酸代谢关键基因,提高棉花含油量奠定了基础。     

小金海棠抑制性消减cDNA文库的构建及文库质量分析

构建小金海棠抑制性消减文库,为进一步大量筛选、克隆苹果铁高效基因、果树转基因工程奠定基础。试验是在提取水培条件下小金海棠缺铁(EDTA-Fe2＋,4μmol/L)和正常供铁(EDTA-Fe2＋,40 μmol/L)的根的总RNA,经过LD-PCR扩增双链cDNA后,利用抑制性消减杂交(SSH)方法,通过两轮杂交和两次抑制性PCR,构建了小金海棠缺铁条件下包含1200个独立克隆的消减cDNA文库。用菌落PCR检测,结果显示插入片段大小范围在300~800bp之间,提取质粒进行PCR和质粒RsaⅠ酶切同样也得到一致性的结果。     

水分胁迫柠条锦鸡儿叶片均一化全长cDNA文库的构建及EST分析

柠条是包括内蒙古在内干旱荒漠草原上的优势建群植物,具有极强的耐旱(寒)力,为了研究其抗逆机理,挖掘和利用其抗旱基因,用Trizol法从经过干旱处理的柠条当年新生幼嫩枝叶中提取总RNA,分离纯化mRNA,采用SMART技术反转录合成双链cDNA,DSN技术进行均一化,构建了柠条全长cDNA文库。经检验,文库的滴度为1.5×106 cfu/mL,重组率为93.75%,90%以上插入片段的长度为1.0～2.0 kb。从文库中随机挑取3200个克隆进行5’测序,得到3020个有效EST,合成2429个unigenes,其中,singlets 2229条,占总有效序列的91.76%,经与数据库比对,发现了脱水素、抗旱相关转录因子等多个抗旱相关基因。     

木薯干旱胁迫下离区发育相关基因MeAP2-2酵母单杂交文库构建及其上游调控基因的筛选

为了研究干旱胁迫下调节木薯叶片脱落相关的重要节点基因及其分子调控网络,以‘华南5号’木薯为实验材料,通过采用酵母单杂交筛选系统,将MeAP2-2启动子中激素与胁迫相关的元件串联后整合入酵母染色体,构建诱饵菌株;采用SMART技术进行离区cDNA文库的构建,将离区cDNA与pGADT7-Rec表达载体共同转化诱饵菌株,通过同源重组在酵母细胞内筛选MeAP2-2的上游转录调节因子;利用酵母菌落PCR法获得阳性克隆中的cDNA插入片段,测序后在JGI网站进行Blast分析。结果表明,构建的cDNA文库库容为1.5×106,插入片段大小为250~3000 bp。cDNA 插入片段经测序和Blast同源性分析和定量PCR分析,筛选出1个Metallothionein protein,1个Core histone protein,1个Heavy-metal-associated protein与MeAP2-2相关的调节因子。实验结果证明酵母单杂交文库构建成功,初步筛选获得了调节MeAP2-2的上游调节因子。为研究木薯干旱胁迫下离区发育的信号转导通路奠定了基础。     

黄萎病菌诱导海岛棉全长cDNA文库构建及EST分析

采用SMART技术构建了海岛棉黄萎病菌诱导下根全长cDNA文库,并进行了质量鉴定和EST序列分析。结果表明,文库的重组率为92.3%,库容量为1.1×106pfu·mL-1,平均插入片段大于1.5 kb。生物信息学分析表明该文库包含大量抗病调节基因和抗病防御基因。COG功能分类发现了多个参与信号转导、防御反应、细胞骨架以及次生代谢产物合成与分解等不同功能类别的基因成员。文库中出现的高丰度表达基因主要有病程相关蛋白(PR蛋白)、谷胱甘肽硫转移酶基因(GST)、亲环素蛋白、短链乙醇脱氢酶、抗坏血酸过氧化物酶及转录因子等。文库的构建为深入研究棉花抗黄萎病分子机制奠定基础。     

山羊基因组文库的构建研究

构建了山羊基因组文库,为筛选山羊乳蛋白基因,构建山羊乳蛋白基因定点整合的转基因敲入载体奠定基础。全血提取基因组DNA,Sau3AΙ部分酶切,分级分离回收15~23 kb片段,将片段插入Lambda BlueSTAR BamHΙ vector,连接并包装后,NotI酶切鉴定。结果表明,文库滴度为3.4×106;共得到1.7×106个有效克隆,插入片断长度在15~23kb范围,成功构建了西农萨能奶山羊基因组文库。