猪链球菌河南分离株的生化分群与随机扩增DNA(RAPD)分型

从河南省11个猪场的送检病料中分离纯化到11株链球菌,将其进行了系统的生化分群,并应用16条随机引物做随机扩增多态性DNA(RAPD)分型。结果表明,11株猪链球菌分别属于C群(3/11)、D群(2/11)、E群(4/11)和L群(1/11),其中1株未定。在RAPD研究中,有3条引物呈现良好的多态性和稳定性,可产生稳定、复杂的指纹图谱;采用SPSSl0.0软件分析了不同菌株间的遗传距离,绘制出菌株间的亲缘关系树状图。依据遗传距离,分离的11株猪链球菌可被分为4个聚类群。     

猪链球菌荧光DNA扩增片段长度多态性检测方法的建立

利用荧光标记技术,采用2对引物初步建立检测猪链球菌荧光DNA扩增片段长度多态性方法,结果表明12株猪链球菌扩增的多态性位点数从51～98条不等,该方法能够检测猪链球菌的多态性,区分不同血清型以及同一血清型不同特性的菌株,可用于菌株鉴定及流行病学研究中细菌源的追踪。     

鸭沙门菌的随机扩增多态性DNA分析

以5株同一血清型的鸭沙门茵为研究对象，分别提取基因组DNA后，用20条随机引物对其进行RAPD分析。结果，20条随机引物中不能扩出任何条带的引物有2条，能扩出条带但扩增图谱中没有特异性条带出现的引物有10条，能扩出条带且扩增图谱具有多态性的引物有8条。对筛选到的具有多态性的8条引物进行分析，共扩增出46个DNA片段，片段大小为0．2～3．2kb，其中5个菌株共有的片段有13条，显示多态性的片段有33条。     

鸭疫里氏杆菌鸭源致病性大肠埃希氏菌和鸭沙门菌的RAPD研究

以4株不同血清型的鸭疫里氏杆菌、5株不同血清型的鸭源致病性大肠埃希氏菌和5株同一血清型的鸭沙门为研究对象，分别提取基因组DNA，利用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对其基因组DNA进行了分析。结果，从20条随机引物中筛选出了38条能在这3种菌中有较好多态性的随机引物，8个有效引物共扩增出了102个DNA片段，其中14个菌株共有的谱带仅有1条，显示多态性的片段有101个，占99．0％；对RA的4个菌株扩增出的谱带数为51条，共同片段有12条，多态性片段39条，占76．5％；对沙门菌的5个菌株扩增出的条带数为46条，共同片段为13条，多态性片段33条，占71．79／6；对大肠埃希氏菌的5个菌株扩增出的条带数为48条，共同片段4条，多态性片段44条，占91．7％。在8条引物中进一步筛选出1条引物G12，其图谱中535bp的条带为鸭疫里氏杆菌所特有，330bp的条带为沙门菌所特有，1227bp的条带为大肠埃希氏所特有，表明G12可作为分子标记用来鉴别这3种细菌。     

应用随机扩增多态性进行山羊致病性大肠杆菌的分子多态性分析

为了解山羊致病性大肠杆菌广西分离株的分子多态性,应用随机扩增多态性方法(RAPD)对山羊致病性大肠杆菌进行分型研究.从8条随机引物中筛选出4条能在10株大肠杆菌中具有较好多态性扩增的随机引物,4条随机引物共扩增出18条DNA片段,10个菌株无共有带谱,显示出良好的扩增多态性.菌株Nx31与Nx32曾被认为是同一菌株的两次分离,但是在RAPD分析中,两株细菌的带谱存在明显的差别,表明RAPD比传统的血清学分型具有更高的分辨性.     

鸡杆菌中国分离株RAPD分型方法的建立与应用

对9株鸡杆菌进行了血清分型,并应用8条随机引物对该9株鸡杆菌和3个参考菌株(1株巴氏杆菌、1株大肠杆菌和1株链球菌)共12株细菌做随机扩增多态性DNA(RAPD)分型研究。结果显示,9株鸡杆菌分别属于血清Ⅰ型(1/9)、血清Ⅱ型(3/9)和血清Ⅳ型(5/9)。所用8条随机引物中有3条呈现良好的多态性和稳定性,可产生差异显著的指纹图谱。采用SPSS13.0软件分析了不同菌株间的遗传距离,并依此绘制出菌株间的亲缘关系树状图。12株细菌共分为4个聚类群,其中9株鸡杆菌位于同一聚类群中,且又可分为4个聚类亚群。3个参考菌株各自形成一个独立的聚类群。不同血清型的鸡杆菌菌株具有相似的指纹图,同一血清型的菌株指纹图存在差异。结果表明,RAPD基因分型是目前鸡杆菌分子流行病学调查及病原分离鉴定比较理想的方法之一。     

应用RAPD技术分析禽多杀性巴氏杆菌广西分离株的DNA多态性

应用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术，以随机引物单条或成对组合的方式对9株禽巴氏杆菌(PM)广西分离株和3个参考株的DNA进行了多态性分析。结果显示，在选用的20个引物中，有4对引物(4条引物成对组合)扩增的条带为1～16条，其长度在90～2600bp。相似指数分析显示，PM广西分离株GX2与GX4的相似指数最高，为0．97；GX7与B26T1200的相似指数最低，为0．21，C48—1标准强毒株与PM广西分离株间的相似指数为0．33～0．64。表明广西当地的流行株呈现多样性，与PM标准强毒株存在差异。     

用RAPD技术分析鸡毒霉形体广西分离株的DNA多态性

采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术，以随机引物成对组合的方式对鸡毒霉形体(MG)5株广西分离株和3株标准株DNA进行了多态性分析。结果显示，所选用的20条引物中，有3对(6条)引物扩增的条带为2—10条，大小在200—3000bp。相似指数分析显示，广西MG分离株Y2与WL、CH与Y3的相似指数最高，分别为0．92和0．86，其与H2的相似指数为0．36—0．62。3株MG标准毒株S6、K2221、K1501与广西分离株间的相似指数为0．17—0．57。表明广西流行的MG与MG标准株存在差异，当地的流行株也呈现多样性。     

应用PAPD方法对鸡败血霉形体DNA多态性的研究

用随机扩增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）方法,通过筛选的５个随机引物（ＯＰＨ－０２,ＯＰＨ－０５,ＯＰＨ－０７,ＯＰＨ－１３,ＯＰＧ－１６）,对１４株鸡败血霉形体（ＭＧ）国际标准株和国内分离株进行了ＤＮＡ多态性研究。结果表明,５个引物共产生２１种条带,其中有３个条带分别为２个菌株所特有,扩增产物片段的长度在１５０～４５００ｂｐ之间,所有菌株均有１条共同条带,以ＯＰＨ－０５扩增产物的多态性最丰富。根据样品ＤＮＡ所获得的菌株间相似性指数表明,Ｄ９６０３与Ｄ９６０７相似指数最高,Ｓ６,Ｋ３９１３和Ｄ９６０４三者相互间相似性指数最低。提示ＲＡＰＤ方法可用于霉形体遗传标记的分析。     

血清1、2、4、5型鸭疫里默氏杆菌的RAPD

以37℃摇震培养舜口烛缸厌氧培养，从12种培养基中选择出鸭疫里默氏杆茼的最优培养基和培养条件。以血清1、2、4、5型的鸭疫里默氏杆菌代表株A1、A2、A3、A4为研究对象，培养增殖后分别提取基因组DNA，利用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术，对其基因组进行了DNA分析。从20条随机引物中筛选出8条随机引物，这8条引物对4种血清型的鸭疫里默氏杆菌的扩增图谱有较好的多态性，可作为分子标记鉴别4种不同血清型的鸭疫里默氏杆菌，同时还筛选出能在4个血清型的鸭疫里默氏杆菌代表株均出现相同的特征条带，而对照茼大肠杆菌、沙门氏茼无该条带的随机引物，从而为鸭疫里默氏杆菌病的分子诊断打下了一定基础。     

猪链球菌种及其主要致病血清型多重PCR检测方法的建立

根据猪链球菌谷氨酸脱氢酶基因和血清型1型、2型、1/2型、7型、9型和14型的荚膜多糖编码基因核酸序列,分别设计猪链球菌种和血清型特异性引物,建立并优化多重PCR检测方法,检测分析种属背景明确的73株菌株（其中猪链球菌49株、其他对照菌株24株）及临床分离样本94株（包括四川资阳临床分离样本45株）。其中73株种属背景明确菌株多重PCR种检测结果符合率为87.5%,6种主要致病血清型检出率可达100%。24株对照菌株在种和血清型检测均为阴性。对45株四川猪链球菌病暴发现场分离菌株进行检测,其中41株为猪链球菌2型。上述结果提示建立的多重PCR方法对猪链球菌种及主要致病血清型的检测具有较好的特异性和敏感性,可用于猪链球菌病的快速诊断和流行病学调查。     

猪链球菌多价灭活疫苗对实验小鼠免疫效果的研究

临床分离的猪链球菌经随机扩增多态性DNA分析，挑选出4株毒力强。免疫原性好且遗传距离较远的猪链球菌作为疫苗株，研制出猪链球菌病氢氧化铝胶多价灭活疫苗。该疫苗对实验小鼠安全性好，无不良反应。实验室的小鼠免疫效力试验证实该苗的保护率为100％，优于单价灭活疫苗和猪链球菌病活疫苗。     

快速鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种双重PCR方法的建立

本试验旨在建立一种快速、特异、敏感的双重PCR鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种病原检测方法。根据猪链球菌GDH蛋白和马链球菌类 M 蛋白的基因保守区分别设计引物,优化了该双重PCR检测方法的引物浓度及比例,并筛选了其最佳退火温度;用该双重PCR反应体系以其他几株阴性菌株为对照,检测了该反应体系的特异性。以新鲜培养的猪链球菌倍比稀释后进行菌落计数,对该检测方法的敏感性进行了鉴定。M-like和GDH引物的加入量均为1 μL(20 pmol/L),最佳退火温度为52.3℃;该双重PCR反应体系有较高敏感性,检测马链球菌兽疫亚种和猪链球菌的敏感度分别达100和10 CFU;特异性试验结果显示,常见的5种病原菌在该双重PCR体系中无特异性条带出现;临床应用该方法分离鉴定了1株猪链球菌和2株马链球菌兽疫亚种。本试验建立了一种能同时检测猪链球菌和马链球菌兽疫亚种的双重PCR方法,且该方法应用快速、特异且敏感。     

家蚕来源肠球菌DNA多态性的RAPD分析

运用随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)技术,对从家蚕消化道中分离的表现为生理生化特性多样性的14个肠球菌分离菌株和3个标准菌株进行了DNA多态性研究。应用筛选的8条随机引物,共扩增出625个位点,其中997%为多态性位点,表明供试菌株具有丰富的DNA多态性。对扩增结果进行聚类分析,供试菌株分为Entfaecalis、Entfaecium、Entcasseliflavus、Entavium等4个类群,与其数值鉴定结果呈相同趋势。     

猪链球菌2型多重PCR快速检测方法的建立

根据猪链球菌16SrDNA基因的种特异性基因序列和CPS基因的2型（1或／和2型）型特异基因序列设计了4条引物，建立了快速检测猪链球菌2型（1或／和2型）的多重PCR方法。利用保存的猪链球菌2型菌株和其他相关标准菌株作为参考菌株对该方法进行了敏感性和特异性试验。结果显示，所建立的多重PCR方法特异、敏感，对组织中的猪链球菌2型（1或／和2型）的最低检出水平为30CFU／mL。用所建立的多重PCR方法对采自江西、北京、珠海、天津、四川等省市的猪扁桃体样品进行了检测，并通过细菌分离和玻片凝集试验对其检测结果进行了验证，结果显示，检出阳性符合率为100％，证实建立的多重PCR方法可用于猪链球菌2型的快速检测。     

奶牛乳房炎病例中金黄色葡萄球菌RAPD-PCR基因分型的研究

用随机扩增多态性DNA 技术（RAPD）对来自2个集约化奶牛场不同奶牛乳房炎病例分出的16株金黄色葡萄球菌进行了基因分型。分别用3个寡核苷酸引物扩增，仅OLP11引物可扩增出质量良好、具有RAPD特征的条带图谱。对反应体系的退火温度、模板浓度进行了筛选，模板原倍浓度、33℃的退火温度能使所有检测菌株产生清晰、可分辨、具有较好重复性的带谱。分型结果表明，16株菌可分为2个类群，其中14株位于同一类群，大多数菌株的相关系数差距仅为0.04，这一结果提示这些菌株可能具有相同的来源和相似的遗传背景。     

6株副猪嗜血杆菌基因组DNA的PCR指纹图谱研究

根据肠道菌基因闻重复一致序列，设计了一对特异性引物，采用ERIC-PCR和RAPD技术，研究了副猪嗜血杆菌6个分离菌株的指纹图谱和DNA多态性。结果表明，6个分离株的PCR指纹图谱与15个标准血清型指纹图谱相比较可分辨出4种血清型；6个分离株的RAPD研究结果均表现出多态性。有意义的是，6个菌株的多态性DNA片段也能明显将其分为4种类型的副猪嗜血杆菌，与特异性引物PCR结果相一致。该研究可作为流行病学调查和该菌的分子分型快速诊断方法的基础。     

广东地区猪链球菌的耐药性特点及四环素耐药基因携带情况

猪链球菌(Streptococcus suis,SS)是危害世界养猪业的重要细菌性病原菌之一,本研究旨在了解猪链球菌临床分离株的耐药性特点和四环素耐药基因的携带情况,为临床上该病的防控提供科学依据。本试验采用K-B法和CLSI推荐的肉汤微量稀释法检测猪链球菌广东分离株对18种抗菌药物的耐药性。结果显示,被检菌株对四环素类、磺胺类和氨基糖苷类抗菌药物表现较强的耐药性,尤其对四环素类药物的耐药率高达98.2%;对头孢菌素类药物比较敏感;菌株都耐受6种或6种以上的抗菌药物,其中以6和14重耐药菌株的数量最多,分别占20%和17%。本试验设计了4对引物检测四环素耐药基因携带情况,结果发现56株菌中以携带tetM基因为最多(85.71%)。结果表明tetM很可能是介导广东SS分离株对四环素产生极高耐药率的主要原因之一。     

猪链球菌2型前噬菌体基因的检测及其与毒力基因分布的关系

为了探究猪链球菌(Streptococcus suis,SS)2型菌株中前噬菌体基因与毒力因子分布的关系,利用生物信息学方法预测了19株已全基因测序的SS2中的前噬菌体基因分布,并设计前噬菌体保守基因引物2对,通过PCR检测前噬菌体在101株SS2菌株中的分布,并与毒力因子分布进行比较。结果表明,已全基因测序的猪链球菌2型菌株中,弱毒株含有比强毒株更多的前噬菌体片段。PCR检测显示,14株4种代表性毒力因子(sbp2',mrp,ef,sly)为阴性的菌株中均含有前噬菌体解旋酶基因和末端酶基因,而86株不完全含有这4种代表性毒力因子的菌株中不含有上述前噬菌体基因,说明猪链球菌2型菌株中毒力因子分布与前噬菌体基因分布无明显相关性。     

猪链球菌14型的分离鉴定及生物学特性研究

为了检测确定2019年5月河南某规模化猪场一栋保育仔猪发病猪群的病原,本研究从送检的发病猪关节液中分离获得1株细菌。通过细菌纯化培养、革兰氏染色、形态学观察及猪链球菌gdh基因PCR扩增,确定该分离菌株为猪链球菌。用猪链球菌分型引物对该菌株进行PCR扩增分型鉴定及软件比对分析,结果表明该分离菌株为猪链球菌14型,与猪链球菌JS14株(GenBank登录号:CP002465.1)同源性为100%。毒力基因检测结果表明,该菌株的同时携带有epf、mrp、sly、fbps、orf2毒力基因,属于高致病性菌株。小鼠致病性试验结果也证明该菌株是一株高致病性猪链球菌。药物敏感性试验结果显示,该菌株对β内酰胺类和喹诺酮类药物敏感,对氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类和磺胺类高度耐药,表现出多重耐药现象。对该菌株进行5大类24种耐药基因检测,该菌株同时携带有bla_(TEM)、aadA1、strA、strB、aacC2、aphA1、tet(B)、gyrA、parC、sul2耐药基因。该研究为后续进一步开展猪链球菌14型流行特点和致病机制研究奠定了基础,为猪链球菌14型临床防控提供了理论依据,同时具有重要的公共卫生意义。