三角帆蚌细胞周期蛋白基因筛选及其表达分析

细胞周期蛋白(cyclin)对细胞生长繁殖起到关键的调节作用。该研究采用高通量测序技术,构建了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)转录组文库,进行了cyclins基因筛选与生物信息分析,通过qRT-PCR技术,探讨其在不同组织(闭壳肌、内脏团、外套膜、斧足、心脏、血液、鳃、性腺)与性别中的表达特征。转录组测序共得到257 457条unigene(N50为1 796 bp),注释率为86.7%;通过分析,cyclin A、cyclin D2、cyclin E被筛选出,且cyclin A、cyclin D2与cyclin E蛋白的氨基酸序列均与美洲牡蛎(Crassostrea virginica)、太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)具有较高相似性。实时荧光定量分析结果表明,cyclin A、cyclin D2、cyclin E在三角帆蚌各组织中均有表达,且存在显著的组织差异:cyclin A、cyclin E基因在性腺中表达量显著高于其他组织(P<0.05),在斧足中表达量最低;cyclin D2基因在鳃中表达量最高(P<0.05),在血液中表达量最低。在同一组织的不同性别之间:cyclin A基因在性腺、闭壳肌、心脏、血液中表达存在显著性别差异(P<0.05);cyclin D2在外套膜、心脏、性腺中的表达具有显著(P<0.05)的性别差异;cyclin E在性腺、斧足、鳃、心脏中的表达具有显著(P<0.05)的性别差异;cyclin A、cyclin E基因在雌性心脏和性腺中表达量显著(P<0.05)高于雄性,而cyclin D2反之(P<0.05),cyclin D2基因在雌性外套膜表达量显著高于雄性(P<0.05),暗示cyclin A、cyclin E与性腺发育关系密切,cyclin D2可能与鳃损伤修复有关。本研究初步探究了三角帆蚌cyclin A、cyclin D2、cyclin E基因的功能,为建立三角帆蚌细胞系提供了分子基础。     

三角帆蚌中WNT4基因克隆及表达分析

为进一步了解WNT4在三角帆蚌性别决定过程中的作用,通过RACE（Rapid-amplification of cDNA ends）技术克隆获得了三角帆蚌WNT4基因的全长cDNA,共1560 bp,其中5’-UTR 396 bp、3’-UTR 24 bp,开放阅读框（ORF）为1140 bp,可以编码379个氨基酸,且该序列含有Wnt家族特有结构域。对WNT4的氨基酸序列进行同源性分析后,发现该基因在物种间的进化关系和结构功能具保守性。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析发现WNT4基因在三角帆蚌雌雄多个组织中(外套膜、闭壳肌、鳃、性腺、斧足和肝)均有表达,表明其参与了多样的生物学过程,在腮、斧足、肝中表达量较高,在性腺、闭壳肌、斧足中雌雄间有显著性差异,且雌性三角帆蚌的性腺、闭壳肌表达量显著高于雄性。原位杂交结果显示,WNT4在雌性三角帆蚌的卵母细胞上有明显的杂交信号,推测WNT4基因与性别决定相关。     

三角帆蚌KLHL10基因的特征和表达分析

为了探究KLHL10基因在三角帆蚌性别分化中的作用,利用RACE （Rapid-amplification of cDNA ends）克隆了其cDNA全长,使用实时荧光定量分析比较其在6个不同组织（性腺、鳃、肝胰腺、斧足、闭壳肌、外套膜）、早期发育阶段（1~8月龄）性腺及12、24、36月龄雌雄性腺中表达水平的差异,运用RNA干扰（RNAi）对其功能进行初步探究。结果显示KLHL10基因cDNA全长为2 361 bp,其中5''非编码区长93 bp,3''非编码区长447 bp,开放阅读框（ORF区）长1 821 bp,编码606个氨基酸;qRT-PCR结果显示KLHL10基因在精巢中高表达;早期发育阶段在6月龄时表达量最高;12、24、36月龄的表达结果显示,KLHL10基因在精巢中的表达量均高于同时期在卵巢中的表达量（P<0.05）。同时,设计KLHL10基因的3条dsRNA干扰链,结果显示RNA干扰能有效减少KLHL10基因在性腺组织的表达量。根据以上结果推测KLHL10基因在三角帆蚌中是雄性相关基因,其可能参与三角帆蚌的性别分化与精巢发育。     

三角帆蚌KLHL10基因的特征和表达分析

为了探究KLHL10基因在三角帆蚌性别分化中的作用,利用RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)克隆了其cDNA全长,使用实时荧光定量分析比较其在6个不同组织(性腺、鳃、肝胰腺、斧足、闭壳肌、外套膜)、早期发育阶段(1～8月龄)性腺及12、24、36月龄雌雄性腺中表达水平的差异,运用...     

池蝶蚌与三角帆蚌种群的遗传变异分析

采用不连续聚丙烯酰胺垂直板电泳技术和特异性染色方法,对池蝶蚌和三角帆蚌两个种群的4个年龄段和4种组织(外套膜、闭壳肌、肝脏和鳃)中的两种同工酶(EST、MDH)进行分析。结果表明,这两种贝类的同工酶具有明显的组织特异性,且三角帆蚌种群的遗传多样性较池蝶蚌种群丰富。     

池蝶蚌与三角帆蚌种群的遗传变异分析

采用不连续聚丙烯酰胺垂直板电泳技术和特异性染色方法,对池蝶蚌和三角帆蚌两个种群的4个年龄段和4种组织(外套膜、闭壳肌、肝脏和鳃)中的两种同工酶(EST、MDH)进行分析。结果表明,这两种贝类的同工酶具有明显的组织特异性,且三角帆蚌种群的遗传多样性较池蝶蚌种群丰富。     

三角帆蚌瘟病组织病理学动态变化

在人工感染三角帆蚌瘟病病料组织后第3、5、7、9、11天,运用光学显微镜和电子显微镜分别观察了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)外套膜、鳃和斧足的病理变化特征.结果表明,三角帆蚌瘟病病毒对3种器官组织有不同程度的破坏作用,外套膜和鳃的病变比较严重,斧足稍轻.光镜下,前5 d内各组织结构变化不大;从第7天开始,出现上皮组织细胞肿胀、排列紊乱、部分脱落甚至完全坏死等显著的病理变化.电镜下,前5 d细胞结构无明显病理变化,只出现了少量的病毒粒子;从第7天开始,病毒粒子数量增加,线粒体、内质网、核糖体等细胞器解体,细胞空泡化,但斧足的超微结构变化不明显.     

三角帆蚌病害及防治技术研究进展

通过20年来的发展,我国珍珠产量超过了1200t,稳居世界首位,成为又一种能够在国际市场占有重要地位的产品之一。目前,我国珍珠产量的90％以上是淡水珠,而其中95％以上是三角帆蚌生产的,但是对三角帆蚌（Hyriopsis cumingii Lea）生物学基础研究以及相关应用技术研究远远跟不上生产发展的需要。近10年来蚌病在大范围内此起彼落频繁发生,成为制约淡水珍珠养殖发展的主要瓶颈之一。本文通过对三角帆蚌蚌病及其防治技术的最新研究和进展情况进行综述,为进一步发展淡水珍珠业提供基础资料。     

三角帆蚌病害及防治技术研究进展

通过20年来的发展，我国珍珠产量超过了1200t，稳居世界首位，成为又一种能够在国际市场占有重要地位的产品之一。目前，我国珍珠产量的90％以上是淡水珠，而其中95％以上是三角帆蚌生产的，但是对三角帆蚌（Hyriopsis cumingii Lea）生物学基础研究以及相关应用技术研究远远跟不上生产发展的需要。近10年来蚌病在大范围内此起彼落频繁发生，成为制约淡水珍珠养殖发展的主要瓶颈之一。本文通过对三角帆蚌蚌病及其防治技术的最新研究和进展情况进行综述，为进一步发展淡水珍珠业提供基础资料。     

三角帆蚌AMP基因cDNA全序列的克隆及分子特征研究

以三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）为研究材料,根据实验室构建的三角帆蚌cDNA文库中已标注的EST序列, 利用RACE克隆了三角帆蚌AMP基因的cDNA全序列。该cDNA序列全长为970 bp,5′端非翻译区123 bp,3′端非翻译区526 bp,开放阅读框（ORF）长为300 bp,共编码99个氨基酸,包含一段由27个氨基酸组成的信号肽和72个氨基酸的成熟肽,分子量为10 924.7 u。氨基酸序列分析表明,该序列存在明显的跨膜结构和疏水区。同源性分析表明,该基因编码的蛋白与海兔（Aplysia californica）theromacin氨基酸序列的相似度最高为56%,而与贻贝等中发现的抗菌肽defensins、mytilins、myticins和mytimycins相似度较低,推测属于抗菌肽theromacin基因家族。Jpred3软件对三角帆蚌AMP蛋白的二级结构预测结果表明,在第2～22、57～62氨基酸残基处存在α螺旋,因此,三角帆蚌的AMP蛋白是包含跨膜螺旋的膜蛋白。为进一步研究该基因的表达、功能及三角帆蚌病害防御奠定了分子基础。     

三角帆蚌IGF2基因的亚细胞定位及重组蛋白促体外细胞活性分析

胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factors 2, IGF2)在多种细胞生长、分化和合成代谢的调节中发挥重要的调控作用。本研究成功构建了淡水珍珠贝三角帆蚌IGF2的重组质粒pEGFP-IGF2和pET32a-IGF2,通过pEGFP-IGF2-细胞转染,表明该蛋白定位在细胞质与细胞核中。将pET32a-IGF2转化到BL21 (DE3)中进行蛋白诱导表达,成功得到其原核表达载体,SDS-PAGE检测显示,在约25kD处有一条清晰的条带,符合目的条带大小（26.27kD）,且主要表达于上清液中。为研究重组蛋白IGF2对三角帆蚌细胞活性的作用,本研究通过CCK8细胞活性测定,进一步探讨了添加不同浓度重组目的蛋白（0 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、7.5 μg/mL、 12.5 μg/mL、17.5 μg/mL、 22.5 μg/mL）培养的三角帆蚌外套膜细胞增殖活性。结果显示,三角帆蚌IGF2重组蛋白能显著促进三角帆蚌外套膜细胞的增殖活力（P＜0.05）,且在其浓度为12.5 μg/mL时对三角帆蚌外套膜细胞的促生长效果最佳,这为促进三角帆蚌外套膜细胞传代、细胞系建立奠定了基础,也为下一步探究IGF2在贝类中的功能提供依据。     

不同藻类对三角帆蚌能量代谢相关指标的影响

在水温21 ℃时,测定暴露于相同密度8种不同藻类条件下,一龄三角帆蚌对藻类的同化率、排氨率和耗氧率,实验周期为24 h。结果显示,在相同密度下,三角帆蚌对硅藻的同化率最高,为 0.660±0.003;明显高于绿藻和蓝藻（0.142±0.003和0.095±0.004）;摄食蓝藻的三角帆蚌排氨率和耗氧率最大,分别为（1.346±0.024） μg/（g·h）和（25.78±0.237） μg/（g·h）。摄食绿藻的排氨率最小,为（0.795±0.015） μg/（g·h）,摄食硅藻的耗氧率最小,为（13.307±0.127） μg/（g·h）。耗氧率与排氨率比值（O∶N）揭示三角帆蚌摄食硅藻后,其呼吸代谢底物主要以蛋白质为主;当饵料改变为蓝藻和绿藻时,O∶N比值开始明显变高,表明其呼吸代谢底物由以蛋白质为主转变为以脂肪和蛋白质为主。蓝藻和绿藻类浮游植物对三角帆蚌具有一定的胁迫效应。     

基于蛋白质组学的三角帆蚌珍珠囊形成相关免疫因子研究

采用iTRAQ及生物信息分析技术研究三角帆蚌珍珠囊及外套膜外膜组织蛋白组差异,筛选其与珍珠形成和生长进程中的免疫调节因子,并通过数字基因表达谱,分析了外套膜插核进程中免疫相关因子的mRNA表达水平。研究结果表明,1871个蛋白被鉴定到,其中显著性差异表达蛋白119个(P<0.05),包括上调蛋白74个,下调蛋白45个;分析发现差异表达蛋白主要具有结合、催化、结构分子、运载体、调节酶等活性,主要富集于次生代谢、变形虫病、糖酵解与糖异生、近端小管碳酸氢盐回收、心肌病、甲烷代谢、脂肪细胞因子pathway。进一步筛选获得免疫相关蛋白37个(19个上调蛋白和18个下调蛋白),其主要富集于Notch、Hippo、NF-κB、TGF-β等信号通路,参与免疫球蛋白、凋亡、损伤愈合以及炎症反应。对上调蛋白中的MRC1、LBP、EPX、FcGBP以及下调蛋白中的CD109、CNN3、NOTCH3、LAMB2等在外套膜以及插核后5、20 thd的插核组织和50、90 thd的珍珠囊组织中mRNA表达量进行分析验证,表达与蛋白水平表达趋势相同,对后续将进一步关注不同免疫相关蛋白间的相互作用及其潜在关联,为阐述贝类免疫系统调节网络研究提供基础资料。     

三角帆蚌生长性状和内壳光泽度与所育有核珍珠光泽度相关性分析

光泽度为衡量珍珠价值上限的指标,为了研究三角帆蚌供片蚌和育珠蚌对有核珍珠光泽度的相对贡献,以白蚌（内壳主体色为白色的三角帆蚌）为材料,以壳长和外壳青色为选择性状,设置不同选择策略,建立8 组三角帆蚌群体,在每组群体随机选出供片组和育珠组,开展组合插核手术。经18个月培育,发现不同育珠组合中,供片蚌和育珠蚌同时来自 Ⅰ 组选择群体的YAA育珠组合所育珍珠光泽度值最大,比YGG、YHH产珍珠光泽度分别提高15.46%、21.51%;不同组供片蚌培育珍珠的光泽度差异显著,供片蚌内壳光泽度与珍珠光泽度呈极显著正相关（ r = 0.717 ~ 0.939 ）,建立供片组内壳光泽度和珍珠光泽度回归方程为：y=16.81+0.93x(R^2=0.777),供片蚌生长性状与珍珠光泽度相关性不显著;不同组育珠蚌培育珍珠的光泽度差异显著,但育珠蚌生长性状和内壳光泽度与珍珠光泽度不存在显著相关性。以上结果说明幼蚌期选育外壳颜色青色的三角帆蚌,达到了提升珍珠光泽度的目标,可作为选育产高光泽度珍珠三角帆蚌的间接性状,供片蚌内壳光泽度与珍珠光泽度显著相关,以其作为目标性状更优。     

三角帆蚌所育不同颜色珍珠及其相关组织金属元素种类和含量差异分析

为研究Mn、Mg、Fe、Cu、Zn、Co这6种金属元素对珍珠颜色的影响,选用产自同一养殖池塘的三角帆蚌,比较分析这6种金属元素在内壳色为深紫色、浅紫色和白色的三角帆蚌中分别培育的紫色和白色珍珠中的含量差异,并分析金属元素含量与珍珠L,a,b颜色参数的相关性。结果显示:Mn、Mg、Fe、Co 4种金属元素在深紫色珍珠中均呈现最高含量,在白色珍珠中未检出Fe; Cu除了在三角帆蚌内壳色为浅紫色的珍珠中稍有体现之外,其余组均未检出;Zn在所有颜色珍珠中均未检测出。通过金属元素含量与珍珠颜色参数相关性分析发现,在各颜色育珠蚌组中,所育珍珠的Fe含量均与dE值呈正相关(R~20.83),Mg含量均与L值呈负相关(R~20.80),Mn含量则均与a值呈正相关(R~20.64),仅在深色蚌组中发现,所育珍珠的Co含量与L值的负相关性最高(R~20.94)。进一步比较分析了深紫色、浅紫色和白色三角帆蚌不同部位外套膜以及间液的金属元素含量,深紫色蚌组不同位点外套膜Fe含量存在显著性差异(P0.05),1号位点含量最高;不同壳色蚌的2号位点外套膜Mn、Co含量存在显著性差异(P0.05),其中白色蚌Mn含量显著高于其他两组,深紫色蚌Co含量显著高于其他两组。在白色蚌组的间液中,Mg含量存在显著性差异(P0.05)。综上所述,淡水紫色珍珠的颜色深浅与Fe、Mg、Co、Mn含量存在相关性。     

早期选择对三角帆蚌紫色选育品系幼蚌生长的影响

为了降低三角帆蚌良种选育过程中的工作量和加快选育进程,对三角帆蚌的早期选择效应进行了研究。通过对稚蚌的选择,考察了其对紫色选育品系幼蚌生长的影响。结果显示,选择组5 cm以上个体的比例达到65.20%,比对照组提高了26.80%,而4 cm以下个体下降了16.80%。通过进一步卡方检验(χ2=118.980,P0.01)表明,选择组与对照组的蚌体规格具有极显著差异。表明早期选择对三角帆蚌幼蚌的生长具有显著影响,早期选择效应显著。     

添加类胡萝卜素对三角帆蚌总类胡萝卜素含量及贝壳珍珠质颜色的影响

三角帆蚌贝壳珍珠质颜色与体内总类胡萝卜素含量(total carotenoids content,TCC)密切相关。为研究养殖中添加β-胡萝卜素对三角帆蚌总类胡萝卜素含量(TCC)及贝壳珍珠质颜色的影响,选用不同颜色选育系(紫色选育系和白色选育系)的三角帆蚌进行了为期40 d的养殖实验。通过设置4种浓度梯度(5、10、20、40 mg/L)分别进行添加实验。结果显示,随着类胡萝卜素添加量的增加,三角帆蚌肝胰腺和外套膜组织中TCC也相应增加,但不同颜色选育系三角帆蚌对类胡萝卜素的累积效果差异显著(P0.05),实验40 d后,紫色选育系三角帆蚌贝壳珍珠质的各颜色参数(L*、a*、b*、C*和ΔE)之间均无显著差异,其中不同实验组之间随着类胡萝卜素添加量的增加,紫色选育系三角帆蚌边缘壳珍珠质颜色参数值a*、b*和C*呈现上升趋势,但无显著变化(P0.05)。白色选育系三角帆蚌各实验组贝壳珍珠质的颜色参数值之间差异均不显著(P0.05)。综上,紫色选育系三角帆蚌体内能够富集更高含量的类胡萝卜素,而白色选育系三角帆蚌对类胡萝卜素的富集能力较弱。