大麦黄矮病毒PAV中国分离物外壳蛋白基因的克隆及同源性分析

 大麦黄矮病毒PAV株系由麦长管蚜和禾谷缢管蚜传毒。本研究通过RT-PCR、克隆和序列测定后,确认所得到的我国小麦PAV分离物的外壳蛋白基因片段由600个核苷酸组成,编码199个氨基酸。序列同源性比较结果显示,与BYDV的其它株系典型分离物的外壳蛋白基因同源性最高为74.5%,而与国外发表的PAV 8个分离物的CP基因核苷酸同源性为81%左右,且同源性比较的分值也较其它株系高。氨基酸序列的比较中,仅在46到60位氨基酸差别较大。     

大麦黄矮病毒GPV株系ORF4基因在大肠杆菌中的表达及特异抗血清的制备

 根据已报道的大麦黄矮病毒GPV株系(BYDV-GPV)相关基因序列设计合成引物,利用RT-PCR方法获得ORF4基因,并将其克隆到原核表达载体pET-5a中。经IPTG诱导、SDS-PAGE分析,结果表明:ORF4基因在大肠杆菌BL21(DE3) pLysS中获得了高效表达,分子量为17 kDa。以回收的表达产物为抗原免疫家兔,制备了BYDV-GPV 17kDa蛋白的特异性抗血清。Western blot检测结果,制备的抗血清可用于检测BYDV-GPV侵染后在燕麦体内表达的17 kDa蛋白。     

大麦黄矮病毒GPV株系外壳蛋白基因在E.coli中的表达及抗血清制备

 病毒外壳蛋白基因经适当引物逆转录成cDNA后,应用聚合酶链反应(PCR)扩增,得到大麦黄矮病毒(BYDV)GPV株系的外壳蛋白(CP)基因。将此基因克隆至表达载体pMal,转化E.coli TB1,诱导表达了携带外壳蛋白的融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白量的7%,此融合蛋白的分子量约为60kD,经亲和层析纯化后免疫家兔,获得BYDV-GPVCP的抗血清。     

大麦黄矮病毒PAV血清型免疫电镜检测

用免疫电镜技术对大麦黄矮病毒PAV 血清型进行了检测。病毒粗提液经过抗体IgG 的诱捕、修饰后,在电镜下观察到病毒粒体。病毒在抗体的诱捕下,产生了明显的聚集效应。单个病毒粒体周围有抗体环,病毒二聚集体之间有抗体桥存在。病毒粒体表面结构清晰,而且能够清楚地看到抗体分子与病毒表面突起的结合     

水稻瘤矮病毒P12蛋白抗血清制备及其应用

为了进一步研究水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)P12的功能,将RGDV-GX P12编码区亚克隆至原核表达载体,并导入大肠杆菌诱导表达;重组的P12融合蛋白经Ni-NTA His·Bind Resins纯化后用于免疫小鼠制备抗血清,并进行Western blotting分析。结果显示,约41 kD大小的RGDV P12融合蛋白可在大肠杆菌中高效表达;利用该重组蛋白所制备的抗血清可特异地与融合表达和非融合的P12蛋白发生强烈的免疫学反应。利用该特异性抗血清在病毒粒子样品中检测不到P12蛋白,而在病株总蛋白样品中可检测到1条与预期大小一致的明显条带,表明RGDV P12是一种非结构蛋白。     

薤花叶病毒外壳蛋白抗血清制备及其与相关病毒血清学关系

为研究薤花叶病毒（Scallion mosaic virus，ScaMV）与其它一些马铃薯Y病毒属成员之间的血清学关系，先构建原核表达载体pSB-ScaMV-CP，然后确定该质粒能在大肠杆菌BL21 plys S过量表达目的蛋白，最后用两次制备SDS-PAGE电泳分离纯化的CP免疫小鼠，获得的抗血清效价为1：1024。Western blot分析表明，ScaMV CP抗血清能与病毒自身CP有较强的特异性反应，与芜菁花叶病毒（TuMV）、水仙黄条病毒（NYSV）、小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）和芋花叶病毒（DsMV）CP有较弱的反应，与其它15种马铃薯Y病毒属病毒CP无反应。     

甘蔗黄叶病毒运动蛋白的原核表达和抗血清制备

甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)属于黄症病毒科(Luteoviridae)、马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus),主要由蚜虫传播,能够侵染甘蔗、玉米等多种作物,引发严重的植物病害。本研究将编码ScYLV运动蛋白(Movement protein,MP)的基因连接到pDB-His-MBP原核表达载体上,转化到大肠杆菌菌株Rosetta中,经IPTG诱导,表达分子量大小约为70 kDa的融合蛋白,将纯化后的融合蛋白制备多克隆抗血清。利用western blot检测抗血清的效价为1∶128 000,灵敏度为1∶256,抗血清不与马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)的其它病毒以及黄症病毒属(Luteovirus)病毒发生交叉反应,具有很好的特异性。本文制备的ScYLV MP抗血清可以用于ScYLV的检测,并为深入研究ScYLV与寄主的相互作用等问题提供材料基础。     

水稻黑条矮缩病毒p8蛋白的原核表达、抗血清制备及其特性

水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)p8蛋白由其基因组片段S8编码,根据RBSDV浙江分离物S8序列(AJ297431)设计特异性引物扩增编码p8蛋白N端部分的片段,并亚克隆至原核表达载体pET-32a ,然后以大肠杆菌BL21plysS为宿主菌进行高水平地表达,利用纯化的p8蛋白免疫小鼠,制备了p8蛋白的特异性抗血清。Western blot分析表明,p8蛋白在水稻病株中含量较为丰富,易于检测,而且p8蛋白参与病毒粒子的组成,表明p8是一个病毒结构蛋白。ELISA检测显示p8蛋白的抗血清可与不同来源的水稻、小麦、玉米病汁液发生强烈的血清学反应,表明该抗血清适用于RBSDV田间病株的快速诊断。     

百合斑驳病毒外壳蛋白基因原核表达、抗血清制备及其应用

为了建立百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)的快速检测方法,采用RT-PCR方法从感染LMoV的百合叶片中克隆该病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因,然后连接到原核表达载体pET28a(+)上,导入大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)并诱导表达,以表达的重组蛋白为抗原制备该病毒的抗血清。结果显示:LMoVCP全长为822 bp,编码274个氨基酸;SDS-PAGE及Western blot检测结果表明,经IPTG诱导得到了分子量约为34 kD带有HIS标签的目的蛋白;用该蛋白制备的抗血清经间接ELISA和Western blot检测结果显示,其效价为1∶51 200,具有较高的特异性,可用于感染LMoV百合的检测,其检测结果与RT-PCR检测结果一致。     

玫瑰叶畸形病毒外壳蛋白基因原核表达与抗血清制备

玫瑰叶畸形病毒(rosa rugosa leaf distortion virus, RrLDV)属于番茄丛矮病毒科Tombusviridae天竺葵环斑病毒属Pelarspovirus, 能够引起月季叶片畸形、黄化以及提前衰老等症状, 是危害月季的病毒之一。为建立玫瑰叶畸形病毒的快速检测方法, 采用热硼酸盐法提取发病月季叶片总RNA, 通过RT-PCR扩增该病毒外壳蛋白基因, 连接至原核表达载体pDB-His-MBP上, 导入大肠杆菌Escherichia coli BL21以IPTG, 诱导蛋白表达, 获得浓度为8 mg/mL的重组蛋白, 制备了兔多抗血清。Western blot检测血清效价为1∶2 048 000, 当效价为1∶1 000时, 灵敏度为1∶1 024。血清学检测结果与RT-PCR检测结果一致, 表明该抗血清可用于RrLDV的检测, 有利于检测该病毒的发生和分布。     

玉米黄花叶病毒运动蛋白的原核表达纯化与抗血清制备

为实现对玉米黄花叶病毒（maize yellow mosaic virus,MaYMV）的血清学检测,丰富该病毒的检测方法,将编码MaYMV运动蛋白（movement protein,MP）的基因连接到原核表达载体pDBHis-MBP上,将构建成功的原核表达质粒转化到大肠杆菌Escherichia coli中诱导表达融合蛋白,将纯化后的融合蛋白对新西兰大白兔Oryctolagus cuniculus进行免疫并制备MaYMV MP多克隆抗血清,并采用Western blot对抗血清的效价、灵敏度和特异性进行检测。结果显示,利用成功构建的原核表达载体经诱导表达获得分子量大小约为62 kD的融合蛋白,纯化后对新西兰大白兔进行免疫获得MaYMV MP抗血清,该抗血清的效价为1∶128 000,灵敏度为1∶32,且该抗血清能够特异性地检测到本氏烟Nicotiana benthamiana中瞬时表达的MaYMV MP,而不与马铃薯卷叶病毒属Polerovirus及黄症病毒属Luteovirus的其他病毒发生血清学交叉反应,证明该抗血清具有良好的特异性。表明本研究制备的MaYMV MP抗血清能特异性...     

番茄环纹斑点病毒核壳体蛋白抗血清制备及其血清学特性分析

 番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus, TZSV)是番茄斑萎病毒属的一个新种,对云南番茄、辣椒生产造成严重危害。用RT-PCR 从感病番茄中扩增得到长度为837 bp TZSV 的核壳体蛋白基因(N 基因),将其克隆到原核表达载体pET-28a( + ),获得重组原核表达载体pET-TZSV-N,在大肠杆菌BL21 中表达,SDS-PAGE 分析表明,该载体高效表达33kDa 的融合蛋白;以纯化的融合蛋白作为抗原免疫家兔制备TZSV 核壳体蛋白(N 蛋白)的多克隆抗体,间接酶联免疫测定(ID-ELISA)表明效价为1 / 6 000;Western blot 分析表明,该抗血清能与西瓜银色斑驳病毒(WSMoV)血清组的辣椒褪绿病毒(CaCV)反应,而与番茄斑萎病毒(TSWV)、凤仙花坏死斑病毒(INSV)无血清交叉反应,说明获得的抗血清能用于WS-MoV 血清组成员的检测,TZSV 属于WSMoV 血清组成员。     

小麦蓝矮植原体SWP1效应蛋白的抗血清制备及检测应用

 小麦蓝矮病是西北冬麦区一种重要的植原体病害,造成严重的产量损失。为进一步探究小麦蓝矮植原体的致病机理,通过原核表达获得其致病因子SWP1的重组蛋白并制备抗血清。将PCR扩增到的SWP1基因片段插入到原核表达载体pET-30a(+)上,导入E.coli BL21 (DE3)中,表达出约12 kDa含His标签的融合蛋白。用纯化的融合蛋白注射大白兔皮层,获得了特异性较强的SWP1抗血清,其效价为1∶4 000,并成功应用于SWP1在本氏烟中的检测。制备的抗血清在SWP1蛋白结构、功能及其与寄主的互作研究中具有重要意义。     

小麦矮缩病毒外壳蛋白基因的原核表达、抗体制备及应用

 小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus,WDV)引起的小麦矮缩病是近年来我国小麦生产中的一种重要病毒病害,急需研发快速精准的检测技术用于预测预报和病毒-介体相互作用的研究。本研究应用Gateway重组技术构建了外壳蛋白基因(Coat protein, CP)的原核表达载体,将重组表达载体转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导获得CP基因原核表达蛋白。以重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备得到了相应的抗体,Western blot检测表明制备的抗体能与CP重组蛋白、感病小麦和带毒叶蝉特异性结合,说明获得的抗体特异性高。用获得的抗体进行免疫荧光标记,观察到病毒分布在介体叶蝉的前中肠和中中肠部位,为WDV的预测预报和介体条沙叶蝉传毒机制的研究奠定了基础。     

马铃薯X病毒运动蛋白基因的原核表达、抗血清制备及应用

构建马铃薯X病毒运动蛋白(P25)原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达融合蛋白,所表达的P25蛋白经SDS-PAGE电泳纯化后免疫小鼠,抗血清效价为1∶4000,抗血清与PVX有特异性反应(P/N>2),且具有较强的反应特异性,而与PVY、TMV均不发生反应.该方法制备的抗血清可用于ELISA检测PVX感病植株及Western blot检测转基因植株.     

231份麦类种质资源对大麦黄矮病毒的田间抗性鉴定

为明确不同麦类种质资源对大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf viruses,BYDV)的抗性差异,于2015—2016年连续两年采用堆测法在田间人工接种鉴定了231份麦类种质资源的抗病性。结果表明,不同麦类种质资源对BYDV引起的黄矮病的抗性存在较大差异,2015—2016年,克群、加麻白芒麦、墨沙、绿见口和灰木头的平均病情指数分别为20.40、22.28、23.08、22.34和13.08,对黄矮病表现出较好的抗性;团结红壳麦-K、红矮子、定兴寨、旱地小麦、小红狼、榔头麦、峥白毛、金包银、红四楞、赤壳须麦及和穗板麦的平均病情指数分别为74.68、71.62、70.36、68.44、65.17、64.74、63.29、60.97、55.78、56.42和53.21,均大于50.00,表现为高感;其余种质资源的平均病情指数在25.00~50.00之间,表现为感病。此外,长芒芒、冰糖色小麦、苏麦、红皮麦、小红穗和青兰麦初期表现感病,后期可恢复健康,有一定的耐病性。抗病性不同的麦类种质资源感染BYDV后,对产量的影响差异很大,其中抗病资源绿见口的产量损失率最低,为8.87%,耐病资源长芒芒、冰糖色小麦、苏麦、红皮麦、小红穗和青兰麦的产量损失率依次为16.90%、17.40%、15.04%、13.13%、18.94%和11.57%,而感病资源和穗板麦的产量损失率达43.57%。     

本生烟病程相关蛋白PR-10的原核表达及抗血清制备

病程相关蛋白(Pathogenesis-related proteins,PRs)是植物受生物或非生物胁迫后诱导并积累的一类蛋白质,具有抗病抗逆的多种功能。为检测本生烟病程相关蛋白10(Nicotiana benthamiana Pathogenesis-related protein 10,NbPR10)的表达,制备其抗血清,并用以探究其可能的特性和功能。将已有的NbPR10基因构建到原核表达载体p GEX-KG中获得重组质粒p GEXKG-NbPR10,转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.2 m M IPTG诱导表达分子量约44 k Da的融合蛋白(含GST标签),用GST亲和柱纯化获得纯化的融合蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原免疫家兔制备NbPR10蛋白的抗血清,经Western blot测定抗血清效价达1∶10 000,能至多检测到稀释比例为1∶320的转基因本生烟叶片中的PR10蛋白或1 ng原核表达的蛋白,且能检测到本生烟根和茎中的PR10蛋白,证明PR10在本生烟根和茎中表达量较在叶部高,为进一步研究NbPR10蛋白的功能提供参考。