玉米弯孢叶斑病菌全基因组分泌蛋白的预测与分析

为深入了解玉米弯孢叶斑病菌致病的分子机制,采用信号肽分析软件Signal P 4.1与PSORTb 3.0.2、跨膜螺旋结构分析软件TMHMM 2.0与THUMBUP、GPI锚定位点分析软件big-PI Predictor和亚细胞器蛋白定位分析软件Target P 1.1这6款软件综合预测该菌全基因组中10 372条蛋白序列,并对筛选出的分泌蛋白信号肽基本特征进行分析。结果表明,在玉米弯孢叶斑病菌全基因组编码蛋白中共发现804个具有典型信号肽的分泌蛋白,占全基因组蛋白总数的7.8%;编码这些蛋白的开放阅读框最小为219 bp,最大为7 113 bp,平均为1 252 bp;引导它们的信号肽长度分布在13~37 aa之间,平均为19 aa。信号肽中出现频率最高的氨基酸依次为丙氨酸、亮氨酸和丝氨酸。信号肽切割位点与根癌土壤杆菌、粗糙脉孢霉和马铃薯晚疫病菌一样,同属于A-X-A型。70个具有功能描述的分泌蛋白主要是和细胞代谢与转运、信号转导有关的酶类;还有一些降解细胞壁组分及与致病相关的酶类,可能与玉米弯孢叶斑病菌的毒性有关。     

香蕉MaWRKY18的克隆及表达特征分析

为了研究WRKY基因在香蕉与Foc TR4(Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4)互作中作用,利用RACE技术从香蕉中克隆获得了一个WRKY基因全长。序列分析表明,该基因包含完整的开放阅读框,编码275个氨基酸,与香蕉A基因组预测出的(XP_009392153)成员的同源性为100%,因此将其命名为MaWRKY18。MaWRKY18与MaWRKY71(ADR71866)亲缘关系近,聚类在一个分支上。RT-PCR分析表明该基因在香蕉各器官(根、球茎、假茎、叶、花和果实)中均有表达。MaWRKY18受水杨酸和乙烯诱导上调表达,受茉莉酸诱导下调表达。亚细胞定位表明该基因编码的蛋白定位在细胞核中,且C端具有转录激活活性。在Foc TR4接种后,MaWRKY18在感病品种中下调表达,在抗病品种中上调表达。结果表明克隆到的MaWRKY18可能在香蕉与Foc TR4互作过程中介导抗病性。     

香蕉枯萎病菌SIX2基因序列及特异性分析

依据侵染的香蕉品种范围不同,引起香蕉枯萎病的尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)分为4个生理小种。Foc在寄主植物木质部分泌的SIX(secreted in xylem)蛋白可能与不同生理小种侵染的香蕉品种范围不同存在密切关系,找到Foc 4号生理小种(Foc4)特有的SIX蛋白编码基因将有利于进一步分析Foc4寄主范围更广的原因,从而开展抗病育种工作。采用PCR方法比较分析了国内不同地理区域及来源于澳大利亚与南非的Foc1、Foc2、Foc3、Foc4共56株菌株中的SIX2基因,并以8个以上其他专化型或其他种或属的热带作物病原菌共39株菌株分析了Foc4 SIX2基因序列的特异性,分析了SIX2基因的灵敏度及利用其检测感病植株。仅从供试的Foc4菌株基因组DNA中扩增出SIX2基因序列,检测的DNA灵敏度达5pg/25μL,并可用于检测感病的球茎组织。Foc4中特有的SIX2基因序列为特异性鉴定感病植株病原菌种类提供了快速分子检测技术,为明确该基因是否决定性影响Foc4对寄主差异性的选择研究提供了基础。     

香蕉相似穿孔线虫Rs-flp-14基因克隆与特征分析

类FMRF酰胺多肽(FMR Famide-like peptides,FLPs)在控制寄生性线虫侵染、取食和繁殖过程中起着重要作用。在防治线虫时,FLPs信号系统经常成为药物的作用靶标。本研究以香蕉相似穿孔线虫(Radopholus similis)为材料,用RT-PCR和RACE方法,获得了类FMRF酰胺多肽flp-14基因的cDNA全长序列,命名为Rs-flp-14。此基因cDNA序列全长为569bp,包括一个357bp的开放阅读框(0RF),编码含119个氨基酸的蛋白,分子量与等电点分别为12.85KD和9.41。序列分析表明Rs-flp-14编码2个FLP肽(2xKHEYLRFG),N端具有27个氨基酸残基组成的信号肽。Southern杂交显示其为单拷贝基因。cDNA与基因组DNA重叠分析表明基因包含三个内含子,四个外显子。聚类分析表明该基因与猪蛔虫的As-flp-14同源,相似度最高(64%)。原位杂交结果显示Rs-flp-14基因表达位置在线虫的神经环部位。本研究结果将为研究该基因功能奠定基础,并为以FLPs为作用靶标的防治线虫药物提供理论依据。     

FoAP1基因在香蕉枯萎病菌致病过程中的功能分析

 为了探究AP1转录因子在尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Foc4)中是否参与香蕉枯萎病的致病过程，借助尖孢镰刀菌Fo5176菌株(GenBank序列号:AFQF01001482.1)全基因组序列，通过PCR和RT-PCR技术克隆获得了Foc4中AP1转录因子的基因组DNA和cDNA编码序列.利用PEG介导的原生质体转化法获得AP1基因敲除转化子。利用qRT-PCR分析AP1可能调控的下游基因表达。利用灌根法(直接在根部浇菌)检测了AP1缺失突变体的致病能力。结果表明Foc4的AP1转录因子cDNA编码序列长1770bp，编码63.9kDa(589aa)蛋白，是一个典型的bZIP型转录因子，命名为FoAP1;FoAP1缺失突变体的气生菌丝大量减少，菌丝的入侵生长受到严重限制。对外源氧化胁迫不敏感，但致病能力减弱。     

禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)纤维素结合 蛋白基因(Ha-cbp-1)的克隆和序列分析

 禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)是中国小麦上的重要病原线虫。纤维素结合蛋白基因是一种重要的植物线虫寄生和致病相关基因。用同源克隆的方法从禾谷孢囊线虫寄生前二龄幼虫中克隆出一种纤维素结合蛋白新基因Ha-cbp-1（GenBank 注册号GQ178086）cDNA序列。Ha-cbp-1基因cDNA包含1个开放阅读框,编码131个氨基酸残基的蛋白质,预测蛋白由1个长度为18氨基酸残基的信号肽和1个纤维素结合区域（CBD）组成。Ha-cbp-1的基因组DNA序列含有2个内含子。预测的禾谷孢囊线虫纤维素结合蛋白（HA-CBP-1）序列与大豆孢囊线虫纤维素结合蛋白（HG-CBP-1）序列有60%的同一性和76%的相似性,与甜菜孢囊线虫纤维素结合蛋白（HS-CBP-1）序列有60%的同一性和75%的相似性。本研究首次从禾谷孢囊线虫中成功克隆出CBP蛋白基因。     

辣椒轻斑驳病毒湖南分离物的全基因序列测定及结构分析

采自湖南地区的辣椒轻斑驳病毒Pepper mild mottle virus(PMMoV)样品经单斑分离后,根据已经报道的PMMoV序列基因保守区设计6对简并引物,采用片段重叠法和RACE方法扩增、克隆获得一个全长为6 356bp的湖南分离物(PMMoV-HN1,登录号:KP345899)全基因组序列,编码4个蛋白,分别为126kD蛋白(70~3 423nt)、183kD蛋白(70~4 908nt)、28kD蛋白(4 909~5 682nt)和17.5kD蛋白(5 685~6 158nt),5′-非编码区(5′-UTR)和3′-非编码区(3′-UTR)分别含有69和198个碱基,其中5′-UTR存在一个序列为m7G5′pppG的甲基化核苷酸帽子结构。一致性分析发现PMMoV-HN1与PMMoV其他分离物的核酸一致性为94%~99%,编码的氨基酸一致性为94%~99%。全基因组序列系统进化分析表明PMMoV-HN1分离物与中国首次报道的PMMoV-CN分离物亲缘关系最近。本研究是国内报道的第二例PMMoV全基因组序列。     

烟草蚀纹病毒山东分离物全基因组序列的克隆和保守性分析

为利用RNA介导的病毒抗性策略,培育抗性稳定或抗多烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus,TEV）株系的转基因植株,采用RT-PCR及5＇-RACE方法克隆了烟草蚀纹病毒山东分离物TEV-SD1的全基因组序列。TEV-SD1全基因组核苷酸序列长度为9494 bp,包含1个9165 bp的开放阅读框架（open reading frame,ORF）,编码3054个氨基酸。将TEV-SD1基因组序列与GenBank中已公布的4个TEV全基因组序列和11个外壳蛋白（coat protein,CP）基因序列比对分析发现,各分离物CP基因间的核苷酸和氨基酸序列平均相似性分别为96.65%和98.31%,高于其它功能基因间的相似性;各分离物CP基因3＇端核苷酸序列相似性平均为96.55%,高于5＇端序列。聚类分析发现TEV在自然界中的分子变异与其寄主关系密切。     

甘薯病毒G CH株系和CH2株系中国分离物基因组全序列克隆及结构特征分析

为明确甘薯病毒G(sweet potato virus G,SPVG)CH株系中国分离物SPVG-CH-Ch1和CH2株系中国分离物SPVG-CH2-Ch1的基因组结构特征及遗传变异情况,利用RT-PCR和RACE方法克隆获得分离物SPVG-CH-Ch1和SPVG-CH2-Ch1的基因组全序列,应用DNAMAN软件对基因组全序列及不同编码区序列进行分子变异分析,并基于多聚蛋白基因序列利用MEGA 7软件进行系统进化分析。结果表明,分离物SPVG-CH-Ch1和SPVG-CH2-Ch1的基因组分别包含10 813个和10 834个核苷酸,均包含1个开放阅读框,由10 467个核苷酸组成,编码含有3 488个氨基酸残基的多聚蛋白。分离物SPVG-CH-Ch1与SPVG-CH2-Ch1之间的基因组全序列核苷酸一致性为78.6%,二者与GenBank中登录的其它SPVG分离物基因组全序列核苷酸一致性分别为78.6%～99.1%和77.9%～98.6%,其中SPVG-CH-Ch1与IS103分离物(KM014815)的核苷酸一致性最高,为99.1%,与WT325分离物(KF790759)的核苷酸...     

柑橘大实蝇低覆盖度基因组及其分析

为探究柑橘大实蝇Bactrocera minax的全基因组信息,以海关口岸截获的柑橘大实蝇样本为材料,提取DNA后构建350 bp短片段文库,采用Illumina二代测序平台开展全基因组测序,进行基因组组装、完整性评估和注释分析。结果表明,柑橘大实蝇的基因组大小为368.14 Mb,重复序列占比为16.27%,杂合率为0.79%,属于中等杂合度基因组。基因组组装得到43 124条contigs,contig N50长度为94 994 bp。BUSCO评估显示,组装的基因组可完整覆盖98.80%昆虫保守的单拷贝直系同源基因,表明该组装的完整性很高,可以满足后续分析。通过EVM注释流程整合了从头预测、同源预测和基于转录组预测等不同方法的注释结果,共预测到35 655个蛋白编码基因,其中24 343个基因有功能注释。     

葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)全基因组分泌蛋白的预测及功能分析

葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)是引起多种果树和林木枝干溃疡病和果实腐烂病的重要病原菌.为明确葡萄座腔菌的致病机理,采用SignalP、WoLF PSORT、TMHMM、GPI-SOM等软件,对葡萄座腔菌全基因组14 998条蛋白序列进行了分泌蛋白预测和功能分析.结果表明B.dothidea...     

香蕉枯萎病菌myosin-1基因的功能分析及外施dsRNA介导的抗性评估

 香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense,Foc)引起的香蕉毁灭性土传病害,其中 4号生理小种(Foc4)能感染几乎所有的香蕉品系,危害最严重。SMART在线软件分析myosin-1基因具有肌球蛋白马达蛋白(myosin motor domain, MMD),肌动蛋白尾结构TH1(myosin tail)和 Src家族同源结构域SH3(src homology domain 3),与禾谷镰刀菌中氰烯菌酯靶标基因myosin-5具高度的蛋白同源性,相似性高达83%。利用Split-marker基因重组技术获得Foc4的myosin-1基因敲除突变体,Δmyosin-1突变株丧失了对氰烯菌酯的敏感性,菌丝生长缓慢,产孢量减少且孢子畸形,对香蕉致病力严重下降,证实myosin-1是氰烯菌酯在Foc4中的作用靶标基因。外施靶向myosin-1体外转录的dsRNA,能抑制菌丝的生长,降低菌丝活性;菌丝膨胀扭曲分枝增多,出现典型的球状结构,与氰烯菌酯处理后的表型一致。在盆栽活体人工接种实验中,体外施用dsRNA可以明显抑制枯萎病外部症状的发展,推迟发病时间,赋予寄主抗性,结果说明体外施用dsRNA可以作为新型杀菌剂防治香蕉枯萎病。综上,myosin-1基因作为氰烯菌酯在Foc4中的靶标基因具有高度的序列保守,在调控菌丝生长发育,产孢以及致病力等方面发挥重要作用,而外施dsRNA具有防治香蕉枯萎菌的巨大潜力。     

甜瓜粉霉病菌效应蛋白编码基因的预测与分析

 粉霉病是一种严重影响甜瓜果实品质并造成经济损失的采后病害,效应蛋白在病原真菌致病机制中发挥着重要作用。为获得引起甜瓜粉霉病病原菌粉红单端孢(Trichothecium roseum)的效应蛋白,本研究利用一系列生物信息分析软件(SignalP, TMHMM, Protcomp, big-PI Predictor, TargetP和Blastp)对该菌进行效应蛋白预测与分析,并采用实时荧光定量PCR检测其中6个候选效应蛋白编码基因在离体诱导培养和接种果实时的表达模式。结果表明:从T. roseum的9 760个蛋白序列中预测得到154个候选效应蛋白,其中64个具有功能注释,其余为功能未知蛋白;候选效应蛋白的信号肽长度在14~30 aa之间,且大部分是由信号肽酶I型进行识别;信号肽中出现频率最高的氨基酸依次为丙氨酸、亮氨酸和丝氨酸;其中5个候选效应蛋白编码基因在离体诱导条件下和接种果实时表达量均显著升高,说明其可能为真正的效应蛋白。本研究预测获得了T. roseum中的效应蛋白,实时荧光定量PCR分析说明效应蛋白编码基因参与了T. roseum侵染甜瓜果实的致病过程,这些结果为进一步分析效应蛋白的功能与致病机制奠定了基础。     

香蕉枯萎病菌TR4原生质体转化和基因敲除体系构建

正香蕉枯萎病是一种典型的维管束和土传真菌病害,也是最具毁灭性的植物病害之一~([1])。香蕉一旦感病,很难结果,而且目前尚无有效的防治措施~([1])。因此,研究植物病原菌侵染进程和致病机制,可以拓宽思路以寻求植物病害防治新途径。香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)侵染所致~([1])。对生产影响最大的Foc是侵染包括大蜜哈、     

稻曲病菌Six1类效应蛋白UvSix1-1的功能研究

 稻曲病菌在侵染过程中会分泌大量的效应蛋白来帮助其侵染。本研究鉴定到一个稻曲病菌效应蛋白UvSix1-1,同源序列比对及系统发育分析发现其具有Six1蛋白保守的氨基酸位点,并与多个病原菌中的Six1蛋白具有同源性。进一步研究发现UvSix1-1可以抑制Bax、XEG1和INF1引起的烟草叶片细胞坏死,并且其预测的信号肽区域具有分泌功能,在烟草上瞬时表达UvSix1-1可以促进辣椒疫霉的定殖。对不同稻曲菌株中的序列进行分析,没有发现序列多态性,说明该基因非常保守。以上研究结果表明,UvSix1-1在病原菌侵染过程中发挥作用,研究结果为稻曲病菌效应蛋白的研究提供参考。     

基于RNA-seq的香蕉枯萎病菌转录因子FoSwi6敲除突变体的转录组分析

丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinase,MAPK)信号通路转录因子FoSwi6在调控香蕉枯萎病菌4号生理小种(Fusarium oxysporumf.sp.cubense race 4,Foc4)的生理特性和致病性方面发挥着重要作用.为解析转录因子FoSwi6的转录调控机制...     

Sequence variation in the putative effector gene SIX8 facilitates molecular differentiation of Fusarium oxysporum f. sp. cubense

Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc), causal agent of fusarium wilt of banana, is among the most destructive pathogens of banana and plantain. The development of a molecular diagnostic capable of reliably distinguishing between the various races of the pathogen is of key importance to disease management. However, attempts to distinguish isolates using the standard molecular loci typically used for fungal phylogenetics have been complicated by a poor correlation between phylogeny and pathogenicity. Among the available alternative loci are several putative effector genes, known as SIX genes, which have been successfully used to differentiate the three races of F. oxysporum f. sp. lycopersici. In this study, an international collection of Foc isolates was screened for the presence of the putative effector SIX8. Using a PCR and sequencing approach, variation in Foc‐SIX8 was identified which allowed race 4 to be differentiated from race 1 and 2 isolates, and tropical and subtropical race 4 isolates to be distinguished from one another.     

条锈菌效应子Pst30抑制植物的胼胝质和活性氧积累

 条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f. sp. tritici,Pst)导致的小麦条锈病严重威胁着我国的小麦生产安全。解析病菌的致病机理,对开发病害防控技术与策略具有重要的指导意义。研究发现效应子是病菌重要的致病因子,揭示效应子调控寄主免疫机制可加深对病菌的认知。本课题组前期在全基因组筛选条锈菌效应子中获得了一个候选效应子基因Pst30,该基因所编码的蛋白N-端含有分泌肽,无明显功能结构域。qRT-PCR分析显示Pst30在条锈菌侵染小麦后12 h诱导表达,72 h诱导表达至高峰。利用农杆菌侵染在烟草中瞬时表达Pst30^ΔSP-GFP融合蛋白,发现Pst30^ΔSP定位在细胞质。在烟草中瞬时表达该效应子能够显著抑制Bax诱导的细胞坏死。利用细菌的Ⅲ型分泌系统在小麦中瞬时表达Pst30,能够抑制荧光假单胞杆菌引起的胼胝质积累,导致由无毒性条锈菌小种CYR23引起的小麦过敏性坏死面积和活性氧积累减少,菌丝面积和长度增加。推测小麦条锈菌效应子Pst30可抑制寄主植物的PTI(PAMP-triggered immunity, PTI)和ETI(Effectors-triggered immunity, ETI),促进自身的侵染。