Bt玉米杀虫蛋白含量的时空表达及对亚洲玉米螟的杀虫效果

 利用ELISA方法对2个转Cry1Ab基因抗虫玉米品种MON810和Bt11在不同生育期、不同组织器官中杀虫蛋白的表达量进行了分析,利用室内生测方法研究了不同组织器官对亚洲玉米螟初孵幼虫杀虫效果,并分析了杀虫蛋白表达量与杀虫效果的相关性。结果表明,Cry1Ab杀虫蛋白在Bt玉米MON810和Bt11的不同生育期和组织中的表达量呈明显的时空动态变化,以营养生长阶段的心叶组织表达最高,分别为1880.6和1473.1ng·g-1,生殖生长阶段的花粉含量最低,分别为52.3和73.3ng·g-1。随着叶片的生长,     

Cry1Ab蛋白对拟环纹豹蛛生长发育的影响

[目的]探明Cry1Ab蛋白通过培养基-果蝇-拟环纹豹蛛这一食物链的传递,最终在拟环纹豹蛛(Pardosa pseudoannulata)体内的富集情况以及毒蛋白随食物链的传递在各营养级中的变化规律。[方法]采用酶联免疫技术(ELISA)测定Cry1Ab蛋白在拟环纹豹蛛和果蝇中的含量。[结果]Cry1Ab蛋白对不同龄期拟环纹豹蛛的体长、背甲宽、中眼域宽、腿长等生长指标不存在显著性差异,但对体重产生一定的影响,使得其体重略有下降的趋势。在0~10 d Cry1Ab蛋白在拟环纹豹蛛体内不断累积,但10 d后拟环纹豹蛛体内Cry1Ab蛋白含量逐渐降低。[结论]Cry1Ab蛋白在拟环纹豹蛛体内具有富集效应。     

用Envirologix Cry1Ab/Cry1Ac试剂盒快速测定转基因水稻Bt杀虫蛋白含量的研究

 用 Envirologix Cry1Ab/Cry1Ac平板试剂盒检测了两个转 cry1Ab的水稻品系克螟稻 1号 ( KMD1)、克螟稻 2号 ( KMD2 ) ,及未转化的对照品种秀水 11米粒中的 Bt杀虫蛋白含量。结果表明 ,该试剂盒标样制作的标准曲线相关系数为 0 .985～ 0 .998,在 0 .0 5或 0 .0 1水平上显著。同批次试剂盒的不同试验及不同批次试剂盒的测定值均差异不显著。最低检测剂量达 0 .5 ng/g,每次测试时间比 Western dot blotting方法缩短约 2 h。试验表明 ,该试剂盒是定量检测转基因水稻 Bt毒蛋白表达的一种理想产品     

Cry1Ia和Cry2Ab融合蛋白的表达

[目的]苏云金芽孢杆菌表达的杀虫蛋白Cry1Ia和Cry2Ab对鳞翅目和鞘翅目昆虫具有较好的杀虫活性。为充分利用已有Cry蛋白,本文构建了两者的融合蛋白,并对融合蛋白的原核表达进行检测。[方法]本文将两个基因的编码基因,按照两种先后顺序拼接起来,获得cry1Ia-cry2Ab融合基因和cry2Ab-cry1Ia融合基因。另外,将Cry1Ia蛋白N端第一个α-螺旋(73个氨基酸)的编码序列删除后,接入cry2Ab基因5'端,获得第三个融合基因cry1IaD73-cry2Ab。将3个基因分别插入pHT304载体,并由cry1Ac基因的启动子和终止子调控其在Bt细胞中表达。[结果]SDS-PAGE结果显示,Cry1Ia-Cry2Ab、Cry2Ab-Cry1Ia和Cry1IaD73-Cry2Ab三个融合蛋白均能够在Bt细胞中表达,其测定分子量与预期大小一致,分别约152kDa、152kDa和144kDa。蛋白印迹法分析发现,在表达过程中,三种融合蛋白均有一定比例的降解。另外,不同温度对融合蛋白的表达也有不同程度的影响。[结论]本研究构建了3种融合杀虫基因并在Bt细胞中成功表达,为进一步解析这类融合蛋白的杀虫活性和机理奠定了基础。     

环境条件对转基因高粱Cry1Ab蛋白含量的影响

用Cry1Ab/Cry1Ac板式试剂盒测定了不同光照时间、不同温度和不同水平氮肥处理下,Cry1Ab蛋白在转基因高粱中的表达水平。结果表明,不同光照长度处理的Cry1Ab蛋白含量有较大差异,其顺序为12 h>16 h>18 h>14 h>10 h;不同温度处理对Cry1Ab蛋白含量也有较大差异,为25℃>30℃>20℃>35℃>40℃;不同施肥水平下对Cry1Ab蛋白量也有较大影响,作基肥的以300 kg.hm-2纯氮效果最佳。     

鸡肌肉发育相关miR-133a-5p分析和关键靶基因筛选

为筛选miR-133a-5p影响鸡肌肉发育的关键靶基因,本研究利用在线数据库预测miR-133a-5p靶基因,并对靶基因进行富集分析和构建蛋白-蛋白相互作用(Protein-protein interaction,PPI)网络,寻找网络图中有意义的模块。通过单因素方差分析,比较分析肌肉和其他组织中的miR-133a-5p表达量;再依据microRNA与靶基因负相关的作用机制,将miR-133a-5p靶基因与肌肉中相对下调基因取交集,筛选关键靶基因。最后,通过RNA22 v2对筛选结果进行评估。结果表明:1)共获得157个靶基因;2)GO富集分析显示,靶基因参与多个生物合成过程的调控和代谢过程;KEGG富集结果包括MAPK信号通路等多种信号通路,也包括肌动蛋白细胞骨架等与肌肉发育直接相关的通路;3)PPI网络图共筛选到4个有意义模块,涉及17个基因;4)miR-133a-5p在肌肉中表达显著上调(相对肺、肝脏和肾脏),与肌肉相对下调基因取交集后,筛选到SOX5(SRY-box 5)、PRTFDC1(Phosphoribosyl transferase domain containing 1)、THRB(Thyroid hormone receptor beta)、THBS2(Thrombospondin 2)和ARRDC3(Arrestin domain containing 3)5个基因;5)在GSE93855的表达谱中,PRTFDC1和THRB在肌肉中表达量最低,而RNA22 v2评估结果显示,仅SOX5和THRB存在P<0.05的结合位点。综上,miR-133a-5p很可能是通过SOX5、PRTFDC1、THRB、THBS2和ARRDC3影响肌肉发育,其中SOX5和THRB尤为重要。本研究为进一步研究鸡miR-133a-5p提供了理论基础和数据支撑。     

两种转Bt基因棉杀虫蛋白Cry1Ac表达量的检测

用EnvirologixCry1Ab/Cry1Ac平板试剂盒检测了两种转Cry1Ac基因的棉花品系 (NUCOTN33B、NUCOTN99B) 以及常规对照品系 (苏棉 12) 不同生育期主茎嫩叶、侧枝嫩叶、蕾及蕾的苞叶中杀虫蛋白Cry1Ac的含量。结果表明, 两种转Bt基因棉主茎嫩叶杀虫蛋白Cry1Ac的含量随生育期的推移呈明显下降趋势, 花铃期 (NUCOTN33B和NUCOTN99B分别为 4 43和 2 93μg·g-1 ) 和吐絮期 (3 87和 2 86μg·g-1 ) 的含量分别降至苗期第 6叶 (7 64和 8 38μg·g-1 )的 58%、35%和 51%、34%; 相同时期的主茎嫩叶和侧枝嫩叶中Cry1Ac的含量均显著高于蕾及蕾的苞叶, 前两者均为后两者的两倍以上。     

两种转Bt基因棉杀虫蛋白Cry1Ac表达量的检测

用Envirologix Cry1Ab/Cry1Ac平板试剂盒检测了两种转Cry1Ac基因的棉花品系(NUCOTN33B、NUCOTN99B)以及常规对照品系(苏棉12)不同生育期主茎嫩叶、侧枝嫩叶、蕾及蕾的苞叶中杀虫蛋白Cry1Ac的含量.结果表明,两种转Bt基因棉主茎嫩叶杀虫蛋白Cry1Ac的含量随生育期的推移呈明显下降趋势,花铃期(NUCOTN33B和NUCOTN99B分别为4.43和2.93 μg&#183;g-1)和吐絮期(3.87和2.86 μg&#183;g-1)的含量分别降至苗期第6叶(7.64和8.38 μg&#183;g-1)的58%、35%和51%、34%;相同时期的主茎嫩叶和侧枝嫩叶中Cry1Ac的含量均显著高于蕾及蕾的苞叶,前两者均为后两者的两倍以上.     

转Bt基因玉米残体Cry1Ab蛋白在土壤中的残留动态

采用ELISA定量法研究了(28±1)℃下转Bt基因玉米植株残体不同组织所含Cry1Ab蛋白在黄褐土和红壤中的残留动态,并对其进行方程拟合。结果表明,转Bt基因玉米植株残体不同组织释放的Cry1Ab蛋白在不同土壤中的残留动态基本一致,均呈前期快速降低和后期稳定下降2个阶段,但同一组织释放的Cry1Ab蛋白在不同土壤中的残留变化速率存在显著差异,黄褐土中下降明显快于红壤,1周内表现尤为显著;不同组织释放的Cry1Ab蛋白在同一土壤中其残留差异显著,且受培养时间等因素的影响,总体表现为根>叶>茎,与初始时Cry1Ab蛋白土壤可提取量表现基本一致;双指数模型比移动对数模型和指数模型更符合转Bt基因玉米残体中Cry1Ab蛋白在土壤中的残留动态。     

转Bt基因玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白田间降解动态

【目的】研究间苗后留在田间地表的转Bt基因玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白的降解规律,比较两种Bt玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度。【方法】以两种表达Cry1Ab杀虫蛋白的转Bt基因抗虫玉米MON810和Bt11为材料,采用ELISA方法测定各取样时期中幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白残留量。【结果】转Bt基因玉米幼苗残体中杀虫蛋白降解是逐渐的,且降解速度较快,到50 d时幼苗残体已经完全腐烂,Bt11幼苗残体中的杀虫蛋白已经完全降解,在MON810中还能检测到微量的杀虫蛋白。两种转基因玉米幼苗残体中的Bt杀虫蛋白的初始含量差异不显著,但在同一时间段的Bt杀虫蛋白降解速度存在差异均显著,在30 d前MON810幼苗残体中Bt杀虫蛋白降解速度比Bt11降解的快,30d后,则降解趋势相反,到50 d取样结束时MON810和Bt11分别降解了初始含量的99.81%和100%。【结论】两种转Bt基因玉米间苗后留在田间的幼苗残体中的Cry1Ab杀虫蛋白降解速度不同,在50 d完全腐烂时,其中的杀虫蛋白完全降解或仅有微量残留。     

球孢白僵菌对亚洲玉米螟血细胞毒力和形态的影响

【目的】测定球孢白僵菌Beauveria bassiana对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis血细胞系SYSU-Of He-C的影响,为促进球孢白僵菌在防治亚洲玉米螟中的应用提供理论依据。【方法】采用MTT和CCK-8法测定球孢白僵菌对亚洲玉米螟血细胞系SYSU-Of He-C的毒力,通过光学显微镜与扫描电镜观察球孢白僵菌生长及其对SYSU-Of He-C细胞的影响。【结果】球孢白僵菌分生孢子处理SYSU-Of He-C细胞24 h后,MTT法的IC_(50)值为2.8×10~5mL~(-1),CCK-8法的IC_(50)值为1.4×10~5mL~(-1)。光学显微镜实时监测发现,在SYSU-Of He-C细胞对数期接种球孢白僵菌浓度为3.5×10~4mL~(-1)时,球孢白僵菌具有明显竞争力,未发现囊胞化与吞噬等细胞免疫现象;处理10 h后,球孢白僵菌分生孢子开始萌发长出菌丝,而SYSU-Of He-C细胞减少且开始变形;处理24 h,球孢白僵菌几乎长满整个视野;SYSU-OfHe-C细胞从近似圆形变长或者变为不规则形状,出现聚集、破碎、胞内空泡、瘤状突起,以及被白僵菌菌丝穿透等现象。【结论】球孢白僵菌可改变亚洲玉米螟血细胞系SYSU-Of He-C的细胞形态,但不能使其发生细胞免疫现象。     

转cry1Ab13基因玉米新种质的创制

【目的】构建包含抗鳞翅目害虫基因cry1Ab13的重组植物表达载体,并利用其创制对玉米螟Ostrinia furnacalis具有优良抗性的转基因玉米Zea may L.新种质。【方法】利用同源重组法将cry1Ab13基因连接到表达载体pCAMBIA3300-Bar上,获得以抗除草剂Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3300-cry1Ab13-Bar。通过农杆菌介导法转化玉米自交系H99幼胚,对再生植株进行逐代除草剂筛选、PCR检测及T2代植株的Southern blotting检测、实时荧光定量PCR检测,并对转基因植株进行田间及室内抗虫性鉴定。【结果】构建了cry1Ab13基因的植物表达载体,转化玉米获得3株高抗玉米螟和1株抗玉米螟的T2代转基因植株。Southern blotting证明cry1Ab13基因已经整合到玉米基因组中,实时荧光定量PCR结果表明cry1Ab13基因已经在玉米植株内表达。抗虫性鉴定结果表明,与对照相比转基因植株对玉米螟的抗性显著提高。【结论】将cry1Ab13基因导入玉米并成功表达,显著提高了转基因玉米对玉米螟的抗性,为抗虫玉米新种质的创制奠定了基础。     

新疆亚洲玉米螟不同地理种群临界光周期的研究

研究了新疆亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)不同地理种群在(27±1)℃的恒温条件下,光照时数为4～20 h之间时的光周期反应.结果表明,光周期和不同地理区域对亚洲玉米螟幼虫发育历期有极显著性影响,两因素交互作用对亚洲玉米螟幼虫发育历期有极显著性影响.焉耆、塔城、昌吉种群的临界光周期为LD14:10 h,乌鲁木齐、哈密种群的临界光周期为LD15:9 h.新疆不同地理种群亚洲玉米螟在光照时间时数为8～12 h之间时幼虫的发育历期最长,滞育诱导率最高.并且光照时数长于14 h时,随着光照时数的增加,反而幼虫发育历期缩短,滞育率降低.光周期和亚洲玉米螟发育历期负相关,即光照延长,亚洲玉米螟幼虫发育历期缩短.不同地理区域和亚洲玉米螟发育历期正相关,即北纬度升高,亚洲玉米螟幼虫发育历期延长.     

miR-376b-5p调控绵羊产羔性状相关基因IGF1的表达

为探讨miR-376b-5p靶向调控IGF1影响绵羊多羔性状的分子机制,本研究根据产羔记录选取高、低产羔数小尾寒羊各5只,同期发情处理后,采集卵泡期卵巢及其他6个组织,通过RT-qPCR、Western blot和双荧光素酶报告基因检测系统分析miR-376b-5p与IGF1在高、低产羔数小尾寒羊各组织中的表达量;并确定二者之间的靶向关系;随后,将体外合成的miR-376b-5p模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor)转染至绵羊卵巢颗粒细胞中,检测miR-376b-5p对IGF1表达水平的调控情况,同时对多羔性状TGF-β信号通路中TGFβ1和PTGS2标志因子的表达进行分析。结果表明：1)组织表达谱显示,IGF1在绵羊卵巢组织中的表达量显著高于其他组织(P<0.05);RT-qPCR和Western blot显示,IGF1在高产羔数小尾寒羊卵巢组织中的表达量极显著高于低产羔数小尾寒羊(P<0.01);miR-376b-5p定量结果显示其表达趋势与IGF1相反(P<0.01);2)在线软件预测和双荧光素酶报告系统检测显示,miR-376b-5p可靶向结合IG...     

Bt毒蛋白Cry1Ab受体基因Bt-r3在大肠杆菌中的克隆和表达及特性分析

根据二化螟中肠Bt毒蛋白Cry1Ab的受体基因Bt-r3的cDNA序列设计特异引物,扩增得到编码Bt-R3蛋白胞外部分的目的片段(约4500bp).将目的基因酶切克隆到质粒载体prcHis-TOPO上,再将该质粒导入到感受态细胞TOP 10,经IPTG诱导、得到约为160 kD的表达蛋白.经Western印迹鉴定,结果表明表达产物能有效地结合Bt毒蛋白Cry1Ab,从而确认Bt-r3是Cry1Ab的受体基因.它们的结合部位位于Bt-R3蛋白的胞外结构域中.     

抑制miR-29a-3p表达对小鼠巨噬细胞凋亡的影响及机制

【目的】研究miR-29a-3p下调表达对小鼠巨噬细胞凋亡及相关基因表达的影响,为探讨结核病发病机制、研发新的诊断与治疗方法提供依据。【方法】将重组抑制载体p EZX-AM02-miR-29a-3p转染RAW264.7细胞,24、36和48 h荧光显微镜观察转染效率,Real time-PCR法检测miR-29a-3p及凋亡相关基因caspase3、caspase7、caspase8、Bcl-2、Mcl-1和Bax的表达水平,流式细胞术检测RAW264.7细胞的凋亡率。【结果】重组抑制载体转染后,细胞内miR-29a-3p表达水平明显下降;而caspase7、caspase8、Bcl-2、Mcl-1和Bax等基因的表达出现不同程度的上调;流式细胞术分析发现随着转染时间延长,细胞凋亡率增加,且36 h凋亡率最高。【结论】p EZX-AM02-miR-29a-3p重组载体可抑制小鼠巨噬细胞中miR-29a-3p的表达,通过靶向上调caspase7、caspase8、Bcl-2和Mcl-1等基因的表达促进巨噬细胞的凋亡。     

百合水通道蛋白LotNIP5-1基因的克隆及表达分析

为研究NIP5-1基因(Nodulin26-like intrinsic protein)在百合生长发育方面的作用机理,利用RACE技术克隆得到百合NIP5-1基因的全长cDNA序列。运用多个软件进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及RT-PCR技术检测其表达特性。结果表明:1)百合NIP5-1基因全长为1 492bp,包含1个900bp的完整开放阅读框(Open reading frame,ORF),共编码299个氨基酸;2)百合NIP5-1蛋白属于跨膜通道蛋白MIP超家族。具有6个跨膜区;在B、E环分别具有NIP5-1蛋白特有的NPS、NPV模体,具有该蛋白Ar/R filter分子筛特有的AIGR模体;与小果野芭蕉、香瓜、葡萄、黄瓜、番茄的相似性分别为86%、83%、84%、83%和82%;3)荧光定量结果显示,百合NIP5-1基因在茎中表达量最高,在花瓣中表达量较低,在叶、鳞茎、根中表达量均极低。RTPCR半定量检测显示,其在"湿"柱头上表达量显著高于"干"柱头,这与转录组测序结果相符合。上述研究暗示,百合NIP5-1可能是硼酸通道蛋白,在促进茎生长及生殖活动中发挥作用。     

牦牛bta-miR-1434-5p和Smad1基因组织表达谱及荧光素酶报告载体构建

为探索牦牛Smad1基因与bta-miR-1434-5p是否存在靶向关系,探究bta-miR-1434-5p分子调控可能机制,利用RT-PCR技术对bta-miR-1434-5p和Smad1 mRNA在牦牛组织中的表达谱进行检测,并构建pmiR-RBREPORTTM双荧光素酶报告载体对牦牛Smad1基因3′端非翻译区(3′UTR)与bta-miR-1434-5p的靶向关系进行研究。结果表明:Smad1基因mRNA在牦牛下丘脑、垂体、心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌、淋巴结、卵巢、输卵管、子宫组织中均有广泛表达;bta-miR-1434-5p除在牦牛输卵管中没有表达外,在其他组织均与Smad1基因mRNA共表达;获得牦牛Smad1基因3′UTR序列并成功构建野生型及突变型pmiR-RB-REPORTTM双荧光素酶报告质粒;荧光素酶活性检测发现bta-miR-1434-5p mimics对Smad1野生型质粒报告荧光没有明显的下调作用,由此推测btamiR-1434-5p与牦牛Smad1基因的该段3′UTR之间未发现明显互作。