鲟源海豚链球菌分离鉴定及药敏试验

【目的】探明甘肃刘家峡养殖杂交鲟暴发疑似海豚链球菌病的病原情况.【方法】利用BHI琼脂对自然发病死亡鱼和濒死鱼的肝、肾和心进行细菌的分离纯化,对疑似海豚链球菌进行生化特性、分子生物学分析、致病性及药物敏感性试验;运用随机扩增多态性DNA标记技术(RAPD)鉴定疑似海豚链球菌的血清型,对疑似海豚链球菌主要毒力基因特异性进行PCR检测.【结果】分离得到的5株革兰氏阳性链球菌,其生化特性均与标准海豚链球菌ATCC29178基本一致,5株分离菌株16S rRNA基因序列一致,16S rRNA基因序列以及基于海豚链球菌lctO基因的特异性扩增结果均与海豚链球菌同源性达99%,系统发育树显示与海豚链球菌聚为一支,随机扩增多态性DNA显示海豚链球菌为血清Ⅱ型;分离菌株均含有海豚链球菌scpI,pdi,cpsD,pgmA和cfi 5种毒力基因,人工感染试验显示分离株对鲟鱼的LD₅₀为3.15×10⁶CFU/mL.药敏试验结果显示,分离株对卡那霉素、强力霉素、依诺沙星、红霉素、四环素、阿奇霉素、环丙沙星、阿莫西林敏感;对链霉素、大观霉素、阿米卡星、庆大霉素、诺...     

银鼓鱼海豚链球菌的分离、鉴定及毒力基因检测

为探究2021年北部湾地区养殖银鼓鱼(Selenotoca multifasciata)疾病暴发的病原,从广东省湛江市南三镇、廉江市和广西北海市的3个养殖场患病银鼓鱼的脑、肝脏和脾脏中分离细菌,综合形态学观察、生理生化特征和16S rRNA序列分析结果,对分离菌株进行种属鉴定,通过人工感染试验确定分离菌株的致病性,并进行组织病理学观察、毒力基因检测及药物敏感性试验。结果表明：从3个养殖场的患病银鼓鱼中,各分离出1株优势菌,分别命名为BBW S1、BBW S2和BBW S3,均具有较强的致病性,是引起银鼓鱼链球菌病的病原菌;根据形态学观察、生化特征和分子鉴定结果,确定3株分离菌株均为海豚链球菌(Streptococcus iniae);病理学观察发现,银鼓鱼感染海豚链球菌后,可造成脑、肝和脾等多脏器不同程度损伤,表现为变性、坏死及炎性细胞浸润等;3株分离菌株均携带scpI、simA、pdi、sagA、cpsD、pgmA和cfi 7种毒力基因,均对阿莫西林、盐酸多西环素、恩诺沙星等8种抗菌药物敏感。研究表明,海豚链球菌是2021年北部湾地区银鼓鱼疾病暴发的病原,本研究结果可为银鼓鱼海豚链球...     

四川兔源金黄色葡萄球菌毒力检测及分子分型

【目的】研究四川部分区域兔源金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的基因型总体结构特征、遗传变异以及毒力因子的分布情况。【方法】从四川地区分离41株兔源金黄色葡萄球菌,鉴定fem B基因特异性,进行耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant S.aureus,MRSA)筛选,并通过PCR法检测13种常见的毒力基因,采用多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)和脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis,PFGE)确定基因型特征。【结果】41株金黄色葡萄球菌中共检测出MRSA 31株,检出率为75.61%;共检出9种毒力基因,其中nuc、hla、eta和clf A在所有菌株中均存在,而sea、sec、see、hlb和PVL的阳性检出率分别为9.7%、85.4%、80.5%、90.2%和7.3%。MLST分型结果显示,41株金黄色葡萄球菌只存在2种序列型(ST398、ST3320)和1个克隆群CC398,其中ST398为优势序列型,所占比例为97.6%。PFGE将41株金黄色葡萄球菌分为18个基因型,但不同区域间的基因型条带差异较小。【结论】四川调查区域兔源金黄色葡萄球菌毒力因子携带率较高,其对家兔的养殖业存在较大的安全威胁;分型分析说明四川部分区域金黄色葡萄球菌的主要流行菌株遗传变异程度小,菌株间亲缘关系较近。     

鲟海豚链球菌的分离鉴定及其感染后的病理损伤

2016年6月,四川彭州养殖鲟鱼流行一种以神经症状和出血为临床特征的传染病,组织病理学观察发现,发病鲟鱼全身多组织器官都有明显的病理损伤,尤其是在肝、肾、心和脑表现为明显的变性、坏死、出血以及炎症细胞浸润。为明确其病因,从自然发病鱼的内脏进行病原菌分离,根据分离菌的形态、理化特性,结合16S rRNA系统发育分析和特异性PCR检测,将其鉴定为海豚链球菌(Streptococcus iniae)。并在此基础上进行人工感染试验,证实其病原性。药敏结果显示,其对氟苯尼考、庆大霉素、强力霉素等抗菌药物高度敏感,但对四环素、新霉素不敏感。     

四川部分地区奶牛源无乳链球菌的分离鉴定、毒力基因检测及耐药性分析

为了解四川部分地区奶牛源无乳链球菌的毒力因子、感染及耐药情况,对2017-2019年采集的313份临床型奶牛乳房炎乳样进行病原菌分离培养,采用K-B纸片扩散法和PCR法对分离的无乳链球菌进行药敏试验、荚膜分型、毒力基因和耐药基因检测。结果表明,313份乳样共分离到105株无乳链球菌,分离率为33.55%,分离菌株的荚膜全部为Ia型。药敏结果显示,分离菌株对氨基糖苷类药物敏感,对β-内酰胺类药物耐药,耐药基因检测结果也与表型一致。毒力基因检测结果显示,除bac和lmb基因未检测到,cfb、cylE、fbsA、fbsB、hylB和α-enolase基因检出率为100%。结果表明,四川不同地区分离的无乳链球菌荚膜分型一致,并且具有相似的药物敏感性和毒力因子。     

双重PCR快速鉴别无乳链球菌和海豚链球菌

根据无乳链球菌的cfb基因和海豚链球菌16SrRNA基因序列,设计、合成2对引物,优化扩增条件,建立了快速鉴别无乳链球菌和海豚链球菌的双重PCR方法.用该方法扩增无乳链球菌和海豚链球菌,可分别获得474、296bp的特异性片段,扩增嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌等其他常见鱼病原菌无特异性片段.该方法可实现对无乳链球菌和海豚链球菌的快速鉴别,具较高的灵敏度,可检测到基因组含量分别为3.2×10-3ng/μL的无乳链球菌和3.0×10-2ng/μL的海豚链球菌.对采集自广东与海南两省养殖罗非鱼病鱼的11份病原样品进行检测,均可获得474bp片段,测序与BLAST分析结果表明,扩增到的序列均为无乳链球菌cfb基因序列,可从分子水平上确定这些样品为无乳链球菌,与生化鉴定结果一致.     

广西罗非鱼和卵形鲳鲹海豚链球菌的生化特性及基因多态性分析

对2006-2011年从广西养殖的罗非鱼Oreochromis niloticus和卵形鲳鲹Trachinotus ovatus中分离的链球菌菌株进行生理生化和二重PCR鉴定,并利用随机扩增多态性DNA标记( RAPD)对经鉴定为海豚链球菌Streptococcus iniae的临床菌株进行生化特性及基因多态性分析。结果表明：经鉴定共有22株临床分离菌株为海豚链球菌; RAPD分析发现,所有菌株的电泳结果均在750 bp处出现特异性条带,且带型相同;结合Bachrach的研究结果,推测本试验中所分离的22株海豚链球菌的血清型均为Ⅰ型。本研究结果可为防治鱼类海豚链球菌病提供科学依据。     

广西罗非鱼海豚链球菌的分离鉴定

从发病罗非鱼中分离获得2株呈B溶血的革兰氏阴性杆菌,经细菌形态、培养、生理生化特性初步鉴定为海豚链球菌,结合PCR检测、PCR产物核苷酸序列测序及Blast比对分析,进一步确定该分离菌株为海豚链球菌。致病性试验结果显示,该分离菌株为致病菌株,能引起罗非鱼发生海豚链球菌病;而药敏试验结果显示,该分离菌株对新霉素、氟苯尼考、菌必治、林可霉素、卡那霉素等药物高度敏感,但对氟哌酸、庆大霉素、痢特灵、链霉素、四环素等不敏感。     

大菱鲆源副乳房链球菌的分离鉴定及其毒力基因型

为研究2019年山东省烟台市某大菱鲆Scophthalmus maximus养殖场出现的以突眼、腹水、红肿为主要特征的疾病发病原因,用平板划线法从患病濒死大菱鲆(体质量为195～535 g)肝、肾、脾、心等组织中分离获得1株优势菌,采用形态学观察、16S rRNA序列分析、PCR特异性扩增和人工回归感染试验等方法对优势...     

罗非鱼海豚链球菌的分离鉴定及药敏试验

为明确广东佛山某罗非鱼鱼场暴发疑似链球菌病的病原情况,应用脑心浸液培养基、胰蛋白大豆琼脂 培养基对患病罗非鱼的肝、胆组织进行细菌分离,对获得的革兰氏阳性链球菌应用16S rDNA 引物进行基因序列鉴 定,并对被确定的链球菌进行基因进化分析,同时进行阿奇霉素、链霉素、阿米卡星等10 种抗生素的药敏试验。结果 表明,分离获得革兰氏阳性链球菌1 株,经16S rDNA 基因扩增鉴定为海豚链球菌;基因进化分析显示,该菌与海豚 链球菌和禽的副乳链球菌亲缘关系最近;药敏试验结果显示,该菌对阿奇霉素和头孢噻肟中度敏感,对其他抗生素 不敏感。     

基于cpsA基因的海豚链球菌LAMP检测方法的建立

基于荚膜多糖cpsA基因设计引物,建立海豚链球菌可视化环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以快速检测鱼类养殖中的海豚链球菌。结果表明,LAMP最佳反应条件为65 ℃反应20 min,镁离子浓度为1.2 mmol/L、dNTPs浓度为0.64 mmol/L、内外引物比例为 16∶1。特异性检测结果表明:该方法能特异性检出海豚链球菌,对无乳链球菌和其他14种菌检测结果均呈阴性;灵敏度检测结果表明,该LAMP方法灵敏度为2.12×10^-5 ng/μL,比PCR检测方法灵敏度高100倍;适用性分析结果表明,该LAMP方法在模板中存在鱼类基因组干扰下也能正确完成检测。研究中建立的LAMP检测方法为海豚链球菌的检测提供一种可视化、灵敏、成本低的快速检测技术。     

中国鲟鱼产业发展现状、机遇与对策建议

目的确定导致云南省景东县鲟鱼养殖场杂交鲟[西伯利亚鲟(Acipenser baerii)(♀)×施氏鲟(Acipenser schrenckii)(♂)]大量发病死亡的病原。方法从病鱼的内脏中分离获得病原菌,通过细菌的分离纯化、形态及分子生物学鉴定分离菌;以人工感染试验及药物敏感性测试验证分离菌株的感染性并筛选出敏感药物。结果分离菌为革兰氏阳性菌,16S rRNA系统发育分析将该菌株鉴定为海豚链球菌(Streptococcus iniae)。人工感染杂交鲟能复制出类似症状,并能从感染鱼体内再次分离到该菌株,证实其病原性,且杂交鲟2周的半数致死剂量(LD₅₀)为4.11×10² CFU/g。药敏结果显示：其对抗菌药物氟苯尼考和多西环素敏感,但对磺胺间甲氧嘧啶和磺胺甲噁唑/甲氧苄啶等多种药物耐药。结论海豚链球菌为引起景东县鲟鱼养殖场杂交鲟大量死亡的致病菌,为杂交鲟海豚链球菌病的控制和预防提供了理论依据,并揭示其在杂交鲟养殖过程中的潜在危险。     

西藏牦牛源肠出血性大肠杆菌毒力基因检测与进化分析

为调查西藏地区牦牛源肠出血性大肠杆菌的流行情况,利用PCR检测和生物进化分析方法,对西藏林芝、拉萨不同地、市149株牦牛源大肠杆菌的肠出血性大肠杆菌相关毒力基因进行了研究。结果表明:牦牛源肠出血性大肠杆菌6对毒力基因中,只检出ehxA基因,检出率为9.40%;对检测到的14株牦牛源肠出血性大肠杆菌进行克隆测序,经系统发育分析发现牦牛源肠出血性大肠杆菌菌株内同源性达到99.9%左右,与GenBank中所录其他菌株的同源性达到99%。因此,西藏牦牛源肠出血性大肠杆菌基因确实存在,其毒力基因主要为ehxA基因;西藏林芝、阿里、日喀则、昌都均有分布,拉萨、山南和那曲地区未检出,应引起重视。西藏地区要根据各地实际情况需要加强监测肠出血性大肠杆菌引起的腹泻,建立流行毒株预警机制并合理用药。     

153种中草药对罗非鱼无乳链球菌和海豚链球菌的抑制活性研究

【目的】研究中草药对罗非鱼无乳链球菌和海豚链球菌的抑菌活性,为生产中罗非鱼链球菌病害的防治提供参考。【方法】采用琼脂扩散法,测定153种中草药乙醇提取物对罗非鱼(Tilapiasp.)无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和海豚链球菌(S.iniae)的体外抑菌作用,并采用二倍稀释法测定中草药乙醇提取物的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。【结果】153种中草药中,博落回(Macleaya cordata)、十大功劳(Mahonia fortunei)、三颗针(Berberis spp.)、紫草(Lithospermum erythrorhizon)、田七须(Panax notoginseng)、补骨脂(Psoralea corylifolia)、田基黄(Hypericum japonicum)和五倍子(Galla chinensis)提取物对无乳链球菌表现出了明显的抑制活性,其中博落回的抑菌效果最显著,抑菌圈直径为(25.1±0.6)mm;博落回、千斤拨(Flemingia philippinensis)、田七须、甘草(Bidens bipinnata)、田基黄、败酱草(Patrinina villosa)、紫草、苦参(Sophora flavescens.)、补骨脂、北五味子(Schisandra chinensis)、五倍子、鬼针草(Bidens bipinnata)、虎刺(Damnacanthus indicus)、三颗针、翠云草(B.bipinnata)、羌活(Notopterygium incisum Ting ex)、香薷(Elsholtzia patrini Garcke)对海豚链球菌具有明显的抑菌活性,其中博落回的抑菌作用最强,抑菌圈直径为(24.3±1.1)mm。对抑菌活性较强的中草药的MIC和MBC进行了测定,结果表明,三颗针和博落回提取物的抑菌和杀菌效果均较好。三颗针、博落回对无乳链球菌和海豚链球菌的MIC和MBC分别为0.31,0.63;0.63,1.25和1.25,2.50;0.94,1.88mg/mL。【结论】博落回、紫草、田基黄、补骨脂、三颗针、田七须和五倍子对无乳链球菌和海豚链球菌均具有较好的抑菌效果。     

猪源Bb SC-SN株的分离鉴定及其皮肤坏死毒素（DNT）全基因序列分析

【目的】了解当前支气管败血波氏杆菌(Bb)地方菌株皮肤坏死毒素(DNT)基因的变异特点。【方法】利用分离培养、PCR及16SrRNA扩增片段同源性分析,对采自四川遂宁某规模化猪场有明显萎缩性鼻炎症状的鼻拭子进行病原分离鉴定,并对分离株的DNT基因进行克隆和序列分析,对其抗原域、氨基酸二级结构、特定区域位于蛋白质表面可能性等参数进行预测,分析其B细胞抗原表位。【结果】成功分离得到一株支气管败血波氏杆菌,命名为支气管败血波氏杆菌SC-SN株。分离株DNT基因序列全长4 357bp,与其他11株菌DNT基因的核苷酸序列同源性为93.1%~100.0%,但由于其356位插入碱基A,使得该序列仅编码1 426个氨基酸,与上述11株DNT基因编码的氨基酸序列同源性仅为12.8%~47.0%。遗传进化树显示,SC-SN分离株与S798日本株和未知1株的亲缘关系最近。软件预测结果显示,Bb SC-SN株DNT基因编码氨基酸B细胞抗原表位发生较大变化。【结论】经鉴定,分离株确为支气管败血波氏杆菌,且SC-SN株的DNT基因序列变异较大,第356位插入的碱基A,对其氨基酸序列、ORF及B细胞抗原表位分布产生了较大的影响。     

马链球菌马亚种新疆株SeM基因的克隆及序列差异分析

为研究马链球菌马亚种新疆株SeM基因的分子特征,分析新疆地区马链球菌马亚种的分子流行特征以及为马腺疫的防治提供依据,对分离并鉴定的5株马链球菌马亚种提取基因组、扩增并克隆其SeM基因(GenBank登录号分别为:KJ486792、KJ486793、KJ486794、KJ486795、KJ486796),采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行疏水性、抗原性及三级结构分析,并与Genbank登录菌株的SeM基因序列进行系统进化分析和比较。克隆获得的SeM基因长度为1 530bp,包含1个1 527bp的完整开放阅读框,编码509个氨基酸;新疆分离株SeM基因与Genbank登录分离株SeM基因同源性为98.0%~99.4%。结果表明,新疆分离株KJ486793、KJ486796与美国分离株亲缘关系较近,属同一个进化分支,另外3株新疆分离株KJ486792、KJ486795、KJ486794构成一个独立分支。     

陕西扶风某生猪养殖场肠球菌分型与毒力基因检测

【目的】分析分离自陕西扶风某生猪养殖场的肠球菌的亚型及毒力基因携带情况,为保障猪肉食品安全和临床感染治疗提供依据。【方法】采用PCR方法,对从陕西省扶风县某养殖场生猪鼻腔、粪便及其养殖场环境样品中分离到的87株肠球菌进行粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、鸡肠球菌（Enterococcus gallinarum）特异性基因的扩增,根据凝胶成像中条带位置对其进行分型,检测其ace、cylA、cylB、cylM、cylL1、efaA、esp、gelE、AS、asal和hyl等11种毒力基因的携带情况。【结果】87株肠球菌中,粪肠球菌、屎肠球菌、鸡肠球菌和其他类型肠球菌（Other Enterococcus）的检出率分别为57.5%,10.3%,4.6%和27.6%;5种毒力基因asal、gelE、cylL1、ace和esp的平均检出率分别为50.6%,27.6%,19.5%,18.4%和1.2%,在猪舍地面菌株中均有检出。粪肠球菌中的asal检出率显著高于其他4种毒力基因（P<0.05）,各毒力基因在未定型的其他亚型肠球菌中的检出率无显著差异（P>0.05）。在生猪育肥前期和后期,所有源菌株中毒力基因ace、cylL1、esp、gelE和asal的总检出率分别为93.7%和6.3%,82.3%和17.7%,100.0%和0%,75.0%和25.0%及84.1%和15.9%。【结论】扶风县某生猪养殖场中流行的肠球菌主要为粪肠球菌,其次为屎肠球菌和鸡肠球菌。不同来源菌株中毒力基因检出率不同,生猪育肥后期菌株中各毒力基因的检出率均有所降低。     

海豚链球菌重组C5a肽酶对斑点叉尾鮰的免疫保护性研究

采用饱和硫酸铵法对斑点叉尾鮰IgM进行粗提,用亲硫树脂对IgM进行纯化,将纯化的IgM免疫家兔,并用ELISA检测兔抗斑点叉尾鮰IgM抗体效价;制备重组C5a肽酶(pSCPI),分别用1、2和3 μg/g的抗原免疫斑点叉尾鮰,以PBS作为对照;测定了第21、28、35、42和49天斑点叉尾鮰产生的特异性抗体的水平,并于免疫后第4周用海豚链球菌DGX07株进行攻毒。结果显示:通过亲硫树脂亲和层析后得到了较纯的IgM重链和轻链,分别约70 ku和27 ku,浓度达到6.4 mg/mL,免疫家兔后的兔抗斑点叉尾鮰IgM抗体效价达1∶51200;重组蛋白pSCPI免疫斑点叉尾鮰后第3周抗体水平开始增加,第4周达到峰值,第5周后开始下降,且3 μg/g浓度组第4周抗体水平最高,但与2 μg/g浓度组第4周抗体水平差异不显著;攻毒实验显示,3个组14 d平均累计死亡率分别为 47.5%、45%和47.5%,平均相对保护率分别为40.63%、43.75%和40.63%,且死亡鱼体内分离到唯一海豚链球菌。以上结果表明重组pSCPI蛋白具有较好的免疫保护作用,能够作为海豚链球菌亚单位疫苗的候选之一。