禽流感分子生物学诊断技术研究进展

禽流感不但造成养禽业的巨大经济损失,而且也严重威胁着人类公共卫生安全。检测禽流感病毒是诊断的关键。分子生物学检测技术较常规检测方法快速、准确、灵敏。通过对核酸杂交技术、常规RT-PCR技术、实时RT-PCR技术、PCR-ELISA技术、核酸依赖的扩增技术(NASBA)、环介导的等温扩增技术(LAMP)以及基因芯片等诊断技术的基本原理、检测优点以及应用现状进行综述,为禽流感的诊断提供参考。     

H5、H9亚型禽流感分子鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断禽流感,根据H5、H9亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计出并合成2对特异性引物,利用这2对引物对H5、H9亚型禽流感病毒的HA基因片段进行二联RT-PCR扩增,并对二联RT-PCR检测方法进行敏感性及特异性试验。结果表明:这2对引物能特异性地扩增出H5、H9亚型禽流感病毒HA基因片段,大小分别为490bp和686bp;该检测方法敏感性高,特异性强;初步建立了快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H9亚型禽流感病毒的分子诊断方法。     

禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为满足禽流感病毒高通量快速检测的需要,建立了一种能够检测各亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性和灵敏度进行评估,使用该方法与农业行业标准NY/T772—2013中的禽流感病毒RT-PCR方法同时进行临床样品检测。结果显示,该方法检测耗时短、特异性好,检测下限达10-4 ng/μL,与传统的RT-PCR方法阳性符合率为100%。结果表明,本方法能实现对禽流感病毒的安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量检测,从而弥补了现有传统检测技术的不足。     

禽流感病毒分子生物学检测方法

禽流感是由流感病毒引起的一种人和动物的高度传染性疾病。由于其危害严重，快速、准确的诊断技术对于禽流感的防控显得非常重要。除常规的临床诊断、病毒分离鉴定、血清学检测外，分子生物学检测方法由于具有更加快速、准确的特点愈来愈受到重视，文章就禽流感病毒分子生物学检测方法研究进展做一综述，以期为有效地控制禽流感的流行和暴发提供有力技术支撑。     

华中农业大学研制成功禽流感快速诊断盒

华中农业大学已推出一次性诊断仪器一禽流感快速诊断试剂盒。常规的禽流感检测方法一般需要21d,而快速诊断盒仅在1～3个小时就能检测出病禽体内的禽流感病毒,是目前国内禽流感诊断较快捷的方法。     

禽流感病毒H5亚型RT-exoRPA检测方法的建立

为建立一种特异、灵敏、简便、快速的禽流感病毒H5亚型的检测方法,根据近几年流行的禽流感病毒H5亚型毒株HA基因序列,采用DNAStar生物分析软件进行基因序列比对后,选择相对保守区域,设计多对引物及探针,建立了禽流感病毒H5亚型RT-exoRPA检测方法,对该方法的反应条件进行优化并检测特异性和灵敏性。结果显示,建立的检测禽流感病毒H5亚型RT-exoRPA方法特异性强,只有禽流感病毒H5亚型呈阳性,其他均为阴性;灵敏性较高,最低可检测到质量浓度为0.89×10-3 mg/L的禽流感病毒H5亚型核酸,比实时荧光RT-PCR方法灵敏性低10倍;检测快速,检测反应所需时间仅20min,比实时荧光RT-PCR方法缩短近1h。结果表明,所建立的禽流感病毒H5亚型RT-exoRPA检测方法适应于禽流感病毒H5亚型的现场检测,以及基层实验室的推广应用。     

禽流感病毒通用型及H5亚型套式荧光RT-PCR 检测方法研究

将套式PCR与荧光RT-PCR技术相结合,叠加这两种技术在敏感性和特异性方面的优势,建立敏感性高于常规荧光RT-PCR的套式荧光RT-PCR检测方法。从GenBank下载禽流感病毒NP基因和HA基因序列,通过比对选取较为保守的片段,设计AIV通用型及H5亚型套式荧光RT-PCR引物和TaqMan探针;利用体外转录技术制备阳性对照,构建目的片段重组质粒;经反应体系和反应条件的优化,建立套式荧光RT-PCR检测方法。试验结果表明,该方法可特异性地检测禽流感病毒及H5亚型AIV,在30份鱼类养殖水样中检测到19份阳性样品,具有较高的敏感性和良好的特异性;具有高通量、快速的特点,可对大批量样品同时进行检测,试验耗时仅需5 h,是自然环境样品中极微量禽流感病毒检测的好方法。     

H5N8亚型禽流感病毒HA和NA基因双重荧光RT-PCR检测方法的建立

H5N8亚型禽流感是传播性极强的人兽共患病,为了简便快速的检测H5N8亚型禽流感病毒,针对H5N8亚型禽流感病毒HA基因和NA基因序列分别设计合成特异性引物和探针,通过优化反应条件,建立了同一反应程序下同时扩增HA基因和NA基因的双重荧光RT-PCR检测方法。结果显示,该检测方法特异性强,不与其他亚型禽流感病毒和禽常见病原发生交叉反应,敏感性可达10copies/μL;组内组间重复性好,平均变异系数均小于0.4%;用该方法对108份临床样品检测,结果与病毒分离鉴定方法检出率一致。综上所述,建立的H5N8亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法具有快速、特异、敏感、重复性好等优点,为H5N8亚型禽流感的快速诊断和疫情防控提供了一定的技术支持。     

禽流感检测方法研究进展

禽流感不仅对世界养禽业带来巨大的经济损失，而且可以感染人，公共卫生意义重大。由于其病毒亚型众多，抗原性变异极快，毒株的致病性也相差很大，早期快速诊断和血清学检测就成为预防和控制禽流感的前提条件。禽流感病毒的传统诊断方法是分离病毒和检测抗体。近年来，又相继建立了血凝抑制试验、神经氨酸酶抑制试验、酶联免疫吸附试验等血清学诊断技术及分子诊断技术。文章对禽流感检测方法快速诊断进行了概述。     

深圳出入境检验检疫局动检实验室禽流感检测情况与分析

通过深入分析深圳出入境检验检疫局动检实验宣对禽流感开展的病原学检测方法和血清学检测方法,系统总结了目前动物检疫实验室禽流感检测与监测过程中常用的方法。在病原学检测方面,比较了鸡胚病毒分离鉴定方法、实时荧光PCR检测方法和乳胶凝集试验检测方法的优劣,提出了适合本实验室的病毒快速鉴定方法。鉴于生物安全的要求,对禽流感病毒检测采用施实时荧光RT-PCR,同时不断开展新的检测方法。在血清学检测方面,全面总结了在常规的HA和HI检测中的注意事项,并对近年来深圳出入境检验检疫局的血清学检测数据进行了分析。     

禽黄病毒套式RT-PCR检测方法的建立及应用

禽黄病毒病是新发的一种疫病,可引起鸭、鹅和鸡等家禽产蛋和采食量下降及死亡。本研究旨在建立一种快速诊断方法用于临床诊断及流行病学调查。根据GenBank发表的鹅黄病毒JS804株全基因序列,应用Primer Premier 5.0软件设计了2对特异性引物,建立了禽黄病毒套式RT-PCR检测方法。结果:该套式RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高的特点,最低病毒检测量为101.89TCID50/0.1 mL,比普通RT-PCR方法敏感性高1 000倍。应用该方法对江苏地区疑似禽黄病毒病的70份鹅病料、4份鸭病料、12份鸡病料进行检测,总阳性率为58.14%,而用普通RT-PCR方法检测的阳性率仅为17.44%。结果表明,禽黄病毒套式RT-PCR检测方法具有快速、特异、敏感的特点,可用于禽黄病毒感染的临床诊断和流行病学调查。     

猪流感RT-PCR诊断方法的建立

根据GenBank上发表的多株猪流感病毒（SIV）序列,在保守区域设计1对引物,并对RT-PCR反应条件进行优化,建立了可检测出多种亚型猪源流感病毒的RT-PCR方法。通过对反应产物测序分析,与预期结果相符,证明该方法具有很强的特异性;该方法可以检测出约1个TCID50的猪流感病毒,显示较高的敏感性。通过对12份临床样品进行检测,结果发现：该方法和其他两种方法分离病毒符合率相当。本研究建立的猪流感RT-PCR诊断方法具有高特异性和敏感性,适用于SIV的诊断应用和推广。     

禽流感基因诊断技术研究进展

禽流感是由流感病毒引起的一种人和动物的高度传染性疾病,不但造成养禽业的巨大经济损失,还对人类公共卫生安全存在威胁。因此,快速、准确的基因诊断技术对于禽流感的防控显得非常重要。近年来,主要有RT—PCR技术、荧光定量RT—PCR技术、核酸依赖扩增技术（NASBA）以及基因芯片等基因诊断技术。文章就这些方法的基本原理、检测优点以及应用现状进行综述,以期为有效控制禽流感的发生与流行提供有力技术支撑。     

牛病毒性腹泻病毒一步法RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测牛病毒性腹泻病毒病原的方法,本研究根据GenBank上登录的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)基因组序列,设计1对引物,建立了检测BVDV的一步法RT-PCR方法。该方法对牛传染性鼻气管炎病毒、猪瘟病毒、牛副流感病毒3型的扩增结果均为阴性,检测的敏感性达1 ng RNA。该一步法RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可以准确快速检测出极低含量的BVDV,将为BVDV的病原检测及分子流行病学调查等提供一种快速、灵敏、特异、准确的分子生物学检测方法。     

新疆艾比湖野鸟H1N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

旨在调查野鸟中存在的禽流感病毒,并为禽流感的防制提供依据。采集新疆艾比湖自然保护区野鸟的粪便棉拭子进行禽流感病毒的分离与鉴定,将PCR产物进行纯化后用T载体连接并转化到DH5α细胞中;菌液PCR鉴定后将目的菌液送至上海生工测序并比对测序结果,在NCBI上进行基因序列分析。结果显示,从新疆艾比湖自然保护区野鸟的粪便棉拭子分离得到1株H1N2亚型禽流感病毒;经序列分析得知,该毒株为1株低致病性禽流感病毒,且存在与多种亚型病毒的重配现象。     

H5、H7和H9亚型禽流感病毒四重荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

旨在提高对禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）检测效率，及时发现疫病。本研究通过分析M基因以及H5、H7和H9亚型的HA基因序列保守区域，设计并合成了相关探针和引物，建立了禽流感病毒（AIV）四重荧光RT-PCR检测方法，该方法可在检测禽流感病毒（AIV）的同时，确定病原是否为H5、H7和H9亚型。结果显示，该检测方法耗时短、特异性好、检测下限达到10^-5 ng·μL^-1。采用该方法检测临床采集的13个活禽交易市场的384份禽咽喉和泄殖腔双拭子样品，经检测，其中有60份样品为流感病毒阳性，且全部是H9亚型，该结果与行业标准方法（NY/T 772—2013）检测结果一致，κ值为1（P<0.001）。本方法能实现对禽流感病毒及H5、H7和H9亚型的高通量快速检测，将在AIV快速检测中发挥重要作用。     

H5、H9亚型禽流感分子鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断禽流感,根据H5、H9亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计出并合成两对特异性引物,扩增出H5、H9亚型禽流感病毒HA基因片段、大小分别为490 bp和686 bp;该检测方法敏感性高,特异性强,初步建立起快速,敏感特异地鉴别检测H5、H9亚型禽流感病毒的分子诊断方法。     

H3亚型禽流感病毒巢式PCR检测方法的建立

为建立一种H3亚型禽流感病毒(AIV)的检测方法,本研究针对H3亚型AIV HA基因保守序列,设计并筛选出2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了H3亚型AIV巢式PCR检测方法。对该法进行特异性和敏感性检验,并用该法对96份临床样品进行检测。特异性试验结果表明该法只能检测到H3亚型AIV,对其他常见禽病病原体不扩增;敏感性试验结果表明该巢式PCR对H3亚型AIV检测下限为1×10³拷贝/μL,灵敏度比常规PCR高100倍;96份临床样品检测结果与病毒分离结果一致。本研究所建立的巢式PCR为H3亚型AIV的诊断提供了一种准确、有效的检测方法。     

Conventional and future diagnostics for avian influenza

The significant and continued transboundary spread of Asian avian influenza H5N1 since 2003, paired with documented transmission from avian species to humans and other mammals, has focused global attention on avian influenza virus detection and diagnostic strategies. While the historic and conventional laboratory methods used for isolation and identification of the virus and for detection of specific antibodies continued to be widely applied, new and emerging technologies are rapidly being adapted to support avian influenza virus surveillance and diagnosis worldwide. Molecular tools in particular are advancing toward lab-on-chip and fully integrated technologies that are capable of same day detection, pathotyping, and phylogenetic characterization of influenza A viruses obtained from clinical specimens. The future of avian influenza diagnostics, rather than moving toward a single approach, is wisely adopting a strategy that takes advantage of the range of conventional and advancing technologies to be used in "fit-for-purpose" testing.