小RNA病毒致病机理的研究

很多小RNA科病毒感染宿主细胞后可通过自身的核酸序列或病毒性蛋白产物控制靶细胞的生命活动,而被感染细胞也会通过自身的调控机制对侵染的病毒进行有限的反击,这种现象被认为是宿主细胞对抗小RNA科病毒侵染的防御机制.这种侵染与抵抗的互作机制可由某些病毒蛋白对细胞产生信号干扰或细胞自身翻译合成的细胞因子对病毒的复制路径进行封堵来实现.虽然这些信号通路的上游事件是不同的,但最后的效应却很统一,即使细胞崩解或者细胞将自身按照一定程序与所侵入的病毒同归于尽.此外,一些病毒蛋白具有抑制细胞程序性自杀的功能,它们能够令感染病毒后的细胞不死亡,形成病毒与宿主细胞共存的持续性感染状态.     

核糖体蛋白L12(RPL12)在猪繁殖与呼吸综合征病毒复制中的作用

为研究宿主细胞核糖体蛋白L12(RPL12)在猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respir-atory syndrome virus,PRRSV)复制中的作用,本研究通过荧光定量PCR和Western-blotting等方法,检测了PRRSV感染对Marc-145细胞中RPL1...     

猪细小病毒感染Marc-145细胞后对其分泌白细胞介素18转录时相的影响

为了解猪细小病毒(PPV)感染Marc-145细胞后引起细胞炎性反应特别是白细胞介素18(IL-18)的反应,探讨宿主-病毒之间的作用关系,运用荧光定量PCR技术,测定和分析了PPV感染Marc-145细胞后引起的病毒DNA含量的变化和IL-18的分泌水平.结果表明,IL-18的表达量在1h无明显变化、在3,24h增加...     

重组杆状病毒AcMNPV-PK2-RFP诱导Sf9细胞凋亡的机制分析

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒是一种模式杆状病毒,在农业虫害防治中广泛应用。其表达的PK2蛋白可以通过竞争性的与宿主细胞e IF2α激酶结合形成异源二聚体,抑制其磷酸化e IF2α,从而加速病毒增殖、诱导细胞凋亡。为了探讨PK2诱导宿主Sf9细胞凋亡的机制,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建了重组杆状病毒AcMNPV-PK2-RFP。Western blot分析结果表明,重组病毒AcMNPV-PK2-RFP处理组在病毒侵染后48,60,72 h,宿主细胞内凋亡因子SfP53蛋白的表达量显著高于AcMNPV处理组,分别是AcMNPV处理组的1.16倍、1.39倍和1.79倍;在病毒侵染后48,72 h,AcMNPV-PK2-RFP处理组反映线粒体膜电位的绿色荧光分别是野生处理组的1.54倍和1.89倍,表明AcMNPV-PK2-RFP处理组的线粒体膜电位显著低于野生病毒处理组;同时,观察到AcMNPV-PK2-RFP处理组线粒体中的细胞色素c从病毒侵染后12 h开始释放。结果说明,过表达PK2的重组病毒AcMNPV-PK2-RFP可在感染后期加速SfP53蛋白的表达,通过影响线粒体凋亡信号通路加速宿主Sf9细胞的凋亡,同时表明重组病毒AcMNPV-PK2-RFP是一种相比野生型病毒抗虫活性更高的杀虫剂。     

猪细小病毒感染Marc-145细胞后对其分泌白细胞介素6转录时相的影响

为了更好地了解猪细小病毒(PPV)感染Marc-145后引起的细胞炎性反应,特别是白细胞介素6(IL-6)的反应,以及探讨宿主与病毒之间的作用关系,运用荧光定量PCR技术,测定和分析PPV感染Marc-145细胞后病毒DNA含量的变化和IL-6的分泌水平。结果表明,病毒感染后1 h就可以检测到病毒DNA,但病毒量相对较低,在感染48 h达到最高峰,为感染时的170倍左右。IL-6的表达量在感染后1 h、3 h、24 h显著增加,48 h下降至低于对照水平,说明猪细小病毒感染后可引起Marc-145细胞分泌IL-6的增加。     

猪长链非编码RNA lnc-000649在PRRSV感染增殖中的作用

长链非编码RNA(lncRNA)在免疫及病毒与宿主互作中发挥重要作用.本研究在猪PAM细胞中发现一种新的猪长链非编码RNA tnc-000649,其全序列长1 483 bp.利用荧光定量PCR技术检测了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染前后PAM细胞中lnc-000649的表达水平,发现其在PRRSV感染后表达显...     

环形泰勒虫感染细胞抑制性消减文库的构建及ESTs分析

【目的】环形泰勒虫（Theileria annulata）可以感染牛B淋巴细胞、树突状细胞和巨噬细胞,并可使被感染细胞发生转化,体外培养时可获得类似肿瘤样细胞的无限增殖能力。本研究通过构建环形泰勒虫转化和非转化宿主细胞抑制性消减文库,筛选环形泰勒虫裂殖体基因及转化细胞与宿主正常细胞之间的差异表达基因。【方法】以环形泰勒虫裂殖体转化细胞和非感染牛外周血单个核细胞（即非转化宿主细胞）为试验材料,提取总RNA和mRNA,反转录合成cDNA;然后分别作为tester和driver,进行抑制性消减杂交（SSH）,构建环形泰勒虫转化和非转化宿主细胞抑制性消减文库;对随机挑取的阳性克隆进行测序及生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR对文库部分差异基因进行验证。【结果】通过对文库454个阳性克隆进行测序,共获得了有效表达序列标签（ESTs）364条,大小主要分布在350-1 200 bp之间;将这些ESTs序列在GenBank中进行BLASTn网上序列比对,其匹配于192条基因序列;其中包括环形泰勒虫序列60条(11条为虫体蛋白酶基因序列、10条为膜蛋白基因序列、7条为假设蛋白基因序列、5条为凋亡相关虫体蛋白基因序列、5条为核糖体蛋白基因序列、4条为细胞周期蛋白基因序列、4条为虫体抗原基因序列和虫体其它基因序列14条)、牛基因序列131条（其中19条为肿瘤相关蛋白基因序列）和1条未知序列;其中已有功能注释的ESTs 285条,再将已知功能的ESTs通过WEGO软件从生物学过程（biological process）、细胞组成（cellular component）和分子功能（molecular function）3个部分进行GO聚类分析,结果表明,宿主细胞差异基因主要集中在细胞、细胞进程、结合、催化、代谢进程、生物调节等功能方面。另外,通过对部分环形泰勒虫裂殖体转化宿主细胞差异基因进行荧光定量PCR分析,结果表明,肿瘤相关基因HCLS1和SENP5在转化宿主细胞中转录水平分别是非感染牛PBMCs(非转化宿主细胞)的2.06和1.32倍。【结论】利用SSH技术,成功构建了环形泰勒虫感染宿主细胞的抑制性消减文库,筛选获得了转化宿主细胞和环形泰勒虫裂殖体的表达基因,并通过荧光定量PCR分析获得了2个可能参与宿主细胞转化的基因,为进步探索环形泰勒虫与宿主细胞相互作用的分子机制奠定了基础。     

HearNPV侵染对棉铃虫中肠碱性磷酸酶活性及表达水平的影响

【目的】通过研究棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)感染宿主昆虫后对宿主中肠碱性磷酸酶(ALP)活性与基因表达水平的影响,明确病毒在侵染宿主过程中对宿主昆虫中肠ALP的调控机理。【方法】采用不同剂量的HearNPV感染3龄棉铃虫,测定感染后不同时间昆虫中肠ALP酶活性及其编码基因表达水平,分析病毒感染试虫与未感染健康试虫的ALP活性和编码基因表达水平上的差异。【结果】HearNPV感染后,能够显著抑制ALP的活性,且抑制作用与感染病毒的剂量和感染后时间的增加呈正相关。ALP活性的下降与病毒下调其编码基因ALP的表达水平有关。【结论】HearNPV感染其宿主昆虫的过程中导致宿主ALP活性显著下降,该过程可能协助病毒粒子侵染宿主。病毒对ALP活性的抑制作用机理之一是下调了ALP编码基因的表达水平。     

桑叶水提物及异槲皮苷成分抗石斑鱼虹彩病毒作用机制研究

【目的】探究桑叶提取物成分对石斑鱼虹彩病毒（SGIV）的抑制作用,并对其抗病毒机制进行研究,为利用桑叶提取物成分研发抗SGIV药物提供理论依据,也为开发高效安全的新型抗病毒渔用药物提供新思路。【方法】利用石斑鱼脾脏组织细胞系（GS）,通过光学显微镜观察及CCK-8检测分析桑叶水提物（Morus alba L.water extracts,MAE）及其活性成分异槲皮苷（Isoquercetin,IQ）的安全工作浓度,然后使用实时荧光定量PCR及核酸适配体荧光分子探针技术（Q2-AFMP）分析MAE和IQ对SGIV的抗病毒效果;通过分析SGIV感染GS细胞中MCP基因和VP19基因的表达水平,分析IQ对SGIV的粒子结构及其与宿主细胞表面结合、侵入宿主细胞和在宿主细胞中复制的影响,探究IQ体外抗SGIV的作用机制。【结果】桑叶源化合物成分（MAE和IQ）对GS细胞的最高安全工作浓度为:MAE≤10.0 mg/mL,IQ≤1000.0μg/mL。与接入SGIV的GS细胞相比,在以安全工作浓度的MAE （10.0 mg/mL）和IQ （1000.0μg/mL）分别接入SGIV孵育感染的GS细胞后细胞病变（CPEs）明显减少,MCP基因和VP19基因的相对表达量均呈极显著下降趋势（P<0.01,下同）,GS细胞荧光值也极显著降低,表明桑叶源化合物成分能有效抑制SGIV感染。以IQ处理SGIV孵育感染的GS细胞,其细胞内MCP基因和VP19基因的相对表达量均呈极显著下降趋势,提示IQ能破坏SGIV的粒子结构,并干扰SGIV对宿主细胞的吸附、侵入和复制。【结论】MAE和IQ对SGIV具有良好的抗病毒效果,其中IQ能在病毒吸附、侵入和复制阶段发挥抗病毒作用,即桑叶源化合物成分在防治SGIV感染方面具有潜在的应用价值,可作为研发抗SGIV感染的有效药用成分。     

绿色荧光蛋白在秋黏虫细胞中的表达

将绿色荧光蛋白基因编码区克隆到转移载体pBacPAK8,与杆状病毒BacPAK6共转染昆虫细胞,通过同源重组和筛选,构建了整合有绿色荧光蛋白基因的重组病毒。在昆虫细胞中表达的绿色荧光蛋白,在荧光显微镜下呈现绿光。这样,就可在细胞内通过监测其表达情况,以了解病毒在不同细胞中的感染情况。     

2,4-二氯苯酚对鳞翅目昆虫细胞增殖的影响

研究了2,4-DCP对家蚕卵巢细胞(BmN)和苜蓿丫纹夜蛾卵巢细胞(Sf9)的影响.结果表明,2,4-DCP对BmN和Sf9细胞生长发育有很大影响,都表现为低浓度的2,4-DCP促进细胞增殖,超过一定浓度时表现出细胞毒性,导致培养细胞不贴壁生长和分裂,甚至死亡并收缩或破裂,有明显的浓度效应和时间效应.2,4-DCP对BmN和Sf9细胞的LC50分别为0.135和0.141 mmol/L.     

玉米矮花叶病毒源鉴定和受侵叶片的超微结构

利用生物接种、血清学反应和电子显微镜观察等方法,对大田发生的玉米矮花叶病毒源进行了鉴定。利用超薄切片系统研究了玉米受MDMV侵染后超微结构的变化。在细胞质中观察到风轮状、卷叶状、束状、圆柱状内含体和简单的囊泡到高度卷曲的膜系统。受侵细胞产生两种不同类型的胞间连丝,a型为正常胞间连丝,b型的胞间连丝伸出指状突起,这可能是细胞限制病毒在寄主体内运转的一种结构。壁旁体的出现与寄主细胞壁加厚及封闭胞间连丝有关。     

Virus-directed protein synthesis in different animal and human cells

The relative proportions of viral gene products (viral proteins) that are synthesized in different types of animal cells infected with the same RNA virus inoculum were compared. The relative rates of synthesis of the various virus proteins late in infection were remarkably constant regardless of cell type infected. This was true in cell lines that produced only small amounts of virus and virus proteins, as well as in those that gave large yields of viruses and virus proteins.     

复合侵染的马铃薯花叶病病原诊断

2015年在浙江宁波发现感病马铃薯植株具有马铃薯花叶病的典型症状,即植株矮化,叶片花叶、皱缩。透射电镜负染色发现,其叶片中含有长度约600~900和400 nm的线状病毒粒子。超薄切片发现,病毒主要集中在叶肉细胞,产生的内含体包括病毒样粒子聚集体、串珠-片层内含体和柱状内含体。串珠-片层内含体代表马铃薯X属特征,柱状内含体代表马铃薯Y属特征,表明可能存在复合侵染,并且2种不同病毒引起的内含体被发现于同一细胞。使用马铃薯Y属病毒通用引物以及针对马铃薯X病毒设计的特异性引物进行RT-PCR扩增及测序,明确其为马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)和马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)复合侵染。     

Dot-Blot Hybridization for Detection of Five Cucurbit Viruses by Digoxigenin-Labelled cDNA Probes

Dot-blot hybridization was applied in this paper to detect five viruses infecting cucurbitaceous crops,Zuccini yellow mosaic virus(ZYMV),Watermelon mosaic virus(WMV),Cucumber mosaic virus(CMV),Papaya ringspot virus watermelon strain(PRSV-W)and Squash mosaic virus(SqMV),as a good alternative assay in seed health test and epidemiological and transgenic research.Digoxigenin-labelled cDNA probes of the five viruses were synthesized by PCR with the specific primers and applied in dot-blot hybridization to detect five viruses in crude extraction of the infected leaves.And three SqMV probes of different lengths(0.55,1.6,and 2.7 kb,respectively)were designed to investigate the effect of hybridization.The results showed that the sensitivity for detecting the crude extraction of infected leaves by ZYMV,WMV,CMV,PRSV-W,and SqMV was down to 1160,1160,1320,1160,and 1320,respectively.Three SqMV probes of different length showed no differences on the sensitivity and specificity.The digoxigenin-labelled probes prepared by PCR could be used for accurate and rapid identification of 5 viruses infecting cucurbitaceous crops with good stabilities,sensitivities,specificity,and reproducibilities.     

家蚕miR-14的上调表达与靶基因的预测分析

【目的】了解家蚕细胞中上调miRNA的方法及靶基因预测,为家蚕miRNA的功能研究提供方法参考。【方法】构建家蚕miR-14的真核表达载体pSK-hr3-ie1-EGFP-pri-mir-14并在家蚕BmN细胞中表达,同时通过转染化学合成的miRNA mimics上调BmN细胞中miR-14的水平。首先通过PCR扩增miR-14的前体及其侧翼序列（pri-mir-14）并克隆至真核表达载体pSK-hr3-ie1-EGFP的EGFP基因下游。分别将重组质粒pSK-hr3-ie1-EGFP-pri-mir-14、对照质粒pSK-hr3-ie1-EGFP、bmo-miR-14 mimics和negative control mimcs转染至家蚕BmN细胞,观察EGFP及FAM在细胞中的荧光情况,以检测其转染效率,qRT-PCR方法检测bmo-miR-14在细胞中的水平。分别采用RNAhybrid和miRanda预测bmo-miR-14的靶基因。【结果】重组表达载体pSK-hr3-ie1-EGFP-pri-mir-14与miRNA模拟物bmo-miR-14 mimics都能上调BmN细胞中的miR-14水平,与对照相比分别提高了2.1、984倍。利用生物信息学方法预测bmo-miR-14靶基因,RNAhybrid和miRanda分别预测得到153和171个潜在bmo-miR-14靶基因,其中两者共同预测的靶基因有49个。GO分析结果显示,预测的49个靶基因的分子功能集中于结合和催化;而生物学过程集中于细胞过程和代谢过程。【结论】通过转染重组质粒及化学合成miRNA mimics,使细胞中相应的miRNA上调,可用于bmo-miR-14后续的功能研究。     

High rate of HTLV-II infection in seropositive i.v. drug abusers in New Orleans

Confirmed infection with HTLV-II (human T cell leukemia virus type II) has been described only in rare cases. The major limitation to serological diagnosis of HTLV-II has been the difficulty of distinguishing HTLV-II from HTLV-I (human T cell leukemia virus type I) infection, because of substantial cross-reactivity between the viruses. A sensitive modification of the polymerase chain reaction method was used to provide unambiguous molecular evidence that a significant proportion of intravenous drug abusers are infected with HTLV, and the majority of these individuals are infected with HTLV-II rather than HTLV-I. Of 23 individuals confirmed by polymerase chain reaction analysis to be infected with HTLV, 21 were identified to be infected with HTLV-II, and 2 were infected with HTLV-I. Molecular identification of an HTLV-II--infected population provides an opportunity to investigate the pathogenicity of HTLV-II in humans.     

甘肃河西地区番茄病毒病病原种类鉴定

2006-2008年对甘肃河西地区番茄病毒病的种类进行了调查和鉴定.河西地区番茄病毒病田间表现为花叶和条斑等症状,种子可带毒.采用DAS-ELISA方法,从田间样本及该地区出入境番茄种子上检测到烟草花叶病毒(TMV)、番茄花叶病毒(ToMV)和黄瓜花叶病毒(CMV),并对TMV 和ToMV阳性样品进行了 IC-RT-PCR鉴定.该地区番茄病毒病优势病毒为烟草花叶病毒;13%的样本中检测出2种病毒的复合侵染.     

羊口疮的研究

本文报道了对羊口疮的病原学、流行病学、实验病理学、血清学诊断以及免疫预防等问题所进行的系列研究结果。应用电镜技术,首次在国内观察到了羊口疮的病原——羊口疮病毒。对该病毒的某些生物学特性和理化学特性进行研究的结果表明,该病毒的感染范围比较广泛,对干燥耐受性强,对热、紫外光和福马林敏感;在奶山羊睾丸细胞上生长良好,CPE变化显著,并有多倍性现象;通过系统取样和超薄切片,在电镜下观察到了病毒在培养细胞中的主要复制过程,以及培养细胞本身的亚微结构变化。试用差速离心联用30—45％蔗精密度梯度超速离心,能有效地提纯病毒,为纯化痘类病毒提供了一种较为理想的方法。中性无离子去污剂TritonX—100与2—巯基乙醇联合,可使病毒裂解,便于分离囊膜蛋白亚单位;用SDS—PAGE分析法,发现病毒最少可泳动出28条多肽区带,而病毒的囊膜亚单位则由18条多肽区带组成。将病毒亚单位作为抗原免疫羔羊,可激发羊只产生抗全病毒抗体和迟发性变态反应,这在国内属首次报道。流行病学的调查表明,羊口疮在甘肃省存在历史已久,分布广泛,对养羊业危害严重;病的自然感染主要见于绵羊和山羊,以羔羊最为易感,除口唇感染外,未见其他临诊病型;采取不同地区的病羊痂皮在羊体作交叉免疫试验,未发现病毒有型别差异。人工感染病羊的血常规检查和血清蛋白的电泳分析未见异常;病理组织学变化以表皮的网状变性、真皮的炎性浸润和结缔组织增生为最特征。首次在国内将反向间接血凝、对流免疫电泳、酶联免疫吸附,琼脂凝胶扩散以及血清中和等五种血清学方法用于羊口疮的诊断,填补了国内在这方面的空白,其中前三种方法在当时的国外文献中也未见有报道。以改良、完善现行方法为目的,对活毒苗免疫接种法作了系统的研究,证明是一种行之有效的应急性免疫措施,有在疫区推广应用的价值;对灭活苗所进行的探索性试验表明,灭活的病毒似能激发羊体产生一定程度的免疫,为今后进一步提高灭活苗的免疫效果以及研究其在实践中应用的可能性打下了有益的基础。