利用降落PCR扩增KS基因

通过优化SDS法提取链霉菌(Streptomyces spiramyceticus)和2株由生物技术与资源利用国家民委——教育部重点实验室分离获得的放线菌D8和D18基因组DNA,同时应用降落PCR和普通PCR扩增酮基合酶基因(ketosynthase,KS)。结果表明,扩增出的特异性条带与目的基因片段长度一致,降落PCR法较普通PCR法扩增KS基因特异性更高。使用普通Taq酶,降落PCR程序能明显提高PCR的特异性,它可用于扩增普通PCR难以扩增的基因片段,或在假阳性难以去除的情况下提高PCR的特异性。     

PCR检测转基因大豆

［目的］定性检测转基因大豆。［方法］以非转基因大豆和CP4-EPSPS转基因大豆为材料,以大豆内源基因Lectin和外源基因5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因（CP4-EPSPS）为检测的目的片段,建立PCR反应体系。采用改进CTAB法提取大豆基因组DNA,并对所提DNA进行PCR扩增和电泳检测,确定转基因大豆的PCR检测限。［结果］改进CTAB法提取的大豆基因组DNA电泳条带清晰完整,转基因大豆和非转基因大豆基因组DNA均可扩增出约409 bp的条带即Lectin基因,而只在转基因大豆中检测出CP4-EPSPS特异性片段;当转基因大豆的含量为100%～0.2%时,均可扩增出特异性条带。［结论］该研究建立了转基因大豆的PCR检测方法。     

滩羊生长激素基因PCR—RFLPs反应体系的优化

以宁夏滩羊基因组DNA为模板，研究影响滩羊PCR—RFLPs扩增的因素，实验结果表明：特异性引物的浓度、Mg^ 浓度、模板DNA的完整性，浓度、纯度、TaqDNA聚合酶、变性温度、退火温度和循环次数等诸多因素对PCR—RFLPs扩增影响较大。为此我们对PCR—RFLPs的反应体系和反应程序进行了研究和浓度梯度对比试验，建立了滩羊GH基因PCR—RFLPs扩增的反应体系和操作技术。     

致病性副溶血性弧菌特异性三重PCR检测方法研究

[目的]建立同时检测致病性副溶血性弧菌gyrase、tdh、toxR基因的三重PCR快速检测方法。[方法]用3种基因的特异性引物分别对副溶血性弧菌ATCC33847的模板DNA进行单一扩增,找到各自引物最佳扩增条件;再用3种引物同步对模板DNA进行扩增,通过优化引物浓度、引物间比例以及退火温度,建立最佳扩增体系。[结果]在最佳三重PCR反应条件下,gyrase、tdh和toxR能同时扩增出清晰条带,大小分别为91、269和368 bp。[结论]该研究为致病性副溶血性弧菌的快速检测提供了一种新的技术方法。     

鸭疫里默氏杆菌PCR快速检测方法的建立

鸭疫里默氏杆菌病对养鸭业危害严重,传统及常规检测方法均有不足,因此有必要建立起一种更加快速简捷、敏感实用的菌落PCR法。根据GenBank公布的鸭疫里默氏杆菌ATCC株OMPA基因序列,在基因保守区设计特异性引物,直接挑取单菌落作为模板,从分离鉴定的1,2,10,11型15株菌及1,2,10,11型4株参考菌株中均能扩增出大小为670 bp的特异性核酸片段,而对照的大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性;将培养菌用TE作10倍梯度稀释,最低检出限量为80个鸭疫里默氏杆菌;建立的菌落PCR与常规PCR法比较,两种方法均能扩增出相同的特异性条带。结果表明,菌落PCR法具有较好的特异性和敏感性,与常规PCR法结果完全一致,且更加快速简捷,在临床应用上具有更好的实用价值。     

黑麦特异性PCR反应体系的建立

[目的]建立黑麦特异性PCR反应优化体系。[方法]以普通小麦＂中国春＂、S165、黑麦、八倍体小黑麦、六倍体小黑麦为试验材料,研究了模板DNA、引物、dNTPs、Mg2＋浓度、TaqDNA聚合酶用量及退火温度对黑麦特异性PCR反应体系的影响。[结果]采用改良的CTAB DNA微量提取法可以得到高质量的基因组DNA,满足PCR反应模板的要求,黑麦特异PCR扩增反应体系为：在25μl反应体系中,10×缓冲液,1.5 mmol/LMgCl2,200μmol/LdNTP,40 ng引物,40~60 ng模板DNA,1 UTaq酶。[结论]建立了适宜的黑麦特异PCR扩增反应体系,为小麦背景下黑麦外源种质的检测奠定了基础。     

高简并引物小温度范围不规则降落PCR在庞大基因家族扩增中的应用（摘要）

[目的]探讨了高简并性引物扩增庞大基因家族基因的特殊方法。[方法]采用常规高简并引物对鲤鱼基因组DNA分析进行了常规PCR扩增、常规降落PCR扩增以及优化后的小温度范围不规则跳跃降落PCR扩增。[结果]采用PCR仅得1条明显条带,得到的基因较少;采用常规降落PCR法仅得到弥散性扩增,无明显条带出现;而采用小温度范围的不规则跳跃降落PCR则得到了得到了3条明显条带和多个基因,扩增结果理想。[结论]为庞大基因家族扩增条件中的优化与选择提供了理论依据。     

浓缩苹果汁中3种污染菌多重PCR检测方法的建立

根据大肠杆菌的β葡糖醛酸酶基因(uid)、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因(invA)和金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc),分别设计3对特异性引物,通过对单管多重PCR扩增的特异性、敏感性以及扩增条件进行优化.结果表明:3对引物分别能扩增出147bp、570bp和280bp的特异性条带,反应条件优化后,3种目的菌在104 CFU/mL时均可同时扩增出较清晰条带(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在103 CFU/ml浓度下仍然可见到条带),仅沙门氏菌的检测比单基因PCR低一个稀释度,人工模拟果汁污染试验结果稳定.该方法操作简单、快速、特异性强,灵敏度高,能够实现对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌3种菌的快速诊断检测和生产过程监控.     

黑麦特异性PCR反应体系的建立（摘要）

[目的]建立黑麦特异性PCR反应优化体系。[方法]以普通小麦＂中国春＂、S165、黑麦、八倍体小黑麦、六倍体小黑麦为试验材料,研究了模板DNA、引物、dNTPs、Mg2＋浓度、TaqDNA聚合酶用量及退火温度对黑麦特异性PCR反应体系的影响。[结果]采用改良的CTABDNA微量提取法可以得到高质量的基因组DNA,满足PCR反应模板的要求,黑麦特异PCR扩增反应体系为：在25μl反应体系中,10×缓冲液,1.5mmol/LMgCl2,200μmol/LdNTP,40ng引物,40～60ng模板DNA,1UTaq酶。[结论]建立了适宜的黑麦特异PCR扩增反应体系,可为小麦背景下黑麦外源种质的检测奠定基础。     

高简并引物小温度范围不规则降落PCR在庞大基因家族扩增中的应用

[目的]探讨高简并性引物扩增庞大基因家族基因的特殊方法。[方法]采用高简并引物对鲤鱼基因组DNA分别进行了常规PCR扩增、常规降落PCR扩增以及优化后的小温度范围不规则跳跃降落PCR扩增。[结果]采用常规PCR仅得1条明显条带,得到的基因较少;采用常规降落PCR仅得到弥散性扩增,无明显条带出现;而采用小温度范围不规则跳跃降落PCR则得到了3条明显条带和多个基因,扩增结果理想。[结论]为庞大基因家族扩增条件的优化与选择提供了理论依据。     

普通PCR与TD-PCR扩增叶尔羌高原鳅抗菌肽Hepcidin基因的比较

为了比较普通PCR和降落PCR( TD - PCR)扩增Hepcidin基因的效果,通过Trizol法提取叶尔羌高原鳅肝胰脏总RNA并合成cDNA,分别利用普通PCR和降落PCR扩增Hepcidin基因片段.结果显示,降落PCR能有效扩增叶尔羌高原鳅Hepcidin.测序结果显示:叶尔羌高原鳅抗菌肽Hepcidin基因...     

利用CODEHOP设计简并引物克隆镰刀菌果胶酶基因片段

利用CODEHOP(Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers)设计真菌果胶酶基因片段的简并引物,并对设计的多对引物进行筛选,比较了普通PCR和Touchdown-PCR(TD-PCR)程序的扩增效果,并对产物进行了测序、比对和分析。结果表明:利用CODEHOP设计简并引物可信性强,阳性率高,能够从供试菌株中获得与目的片段大小相近的产物。利用TD-PCR程序扩增比普通PCR扩增效果好。扩增产物序列BLASTX比对和分析结果表明,产物片段编码的氨基酸序列与镰刀菌属来源的果胶酶氨基酸片段相似性均超过90%,说明所扩增的序列即为镰刀菌果胶酶基因片段。     

牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速诊断牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)病的方法,根据GenBank中登录的IBRV保守基因gB序列,利用分子生物学软件Primer5.0设计1对特异引物,优化反应体系后,建立了IBRV PCR检测方法。特异性试验结果显示该方法可从IBRV DQ株中扩增出398 bp的特异性片段,而对牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒、MDBK细胞的扩增结果均为阴性。该方法检测IBRV的敏感性可达10-3 TCID50·mL-1。应用建立的PCR方法能够从发病的临床样品中检测出IBRV且比病毒分离方法更为敏感,操作简便。结果表明建立的PCR方法具有特异、敏感、快速的特点,可用于IBRV的临床检测。     

抗虫转CpTI基因植物定性PCR检测技术的建立

为建立CpTI基因定性PCR检测方法,通过数据库查询和测序获得CpTI基因序列,设计特异性定性PCR引物,对引物、PCR反应条件和反应体系进行优化,并对检测方法的特异性、灵敏度等进行分析试验。结果表明,CpTI基因特异性定性PCR检测方法选择退火温度为58℃,引物浓度为0.4μmol/L较好,该方法能够特异性检测样品中CpTI基因,检测灵敏度达0.05%(质量比)。该方法符合农业转基因生物产品成分检测标准对特异性、灵敏度、重复性的要求,可为抗虫转CpTI基因植物生物安全管理提供技术支撑。     

鲢鱼嗜水气单胞菌PCR检测方法的建立

根据基因库中嗜水气单胞菌16SrRNA基因序列,设计并合成一对特异性引物,用PCR方法对从病死鲢鱼体内分离到的1株嗜水气单胞菌进行扩增,并对PCR反应条件进行优化,同时测试了该方法的特异性和敏感性.特异性试验结果显示,该引物能扩增出680bp的嗜水气单胞菌特异基因片段,与鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、温和气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、[HT5",7"]鱼[KG-*3]回[HT5"]爱德华氏菌及海豚链球菌无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法最低检测量为10pg嗜水气单胞菌基因总DNA.表明该实验所建立的PCR检测方法可用于鲢鱼嗜水气单胞菌的快速诊断,对有效治疗和控制鱼类嗜水气单胞菌病的流行具有重要意义.     

鸭瘟病毒PCR检测方法的建立

根据GenBank 发表的鸭瘟病毒(DPV)的基因序列,设计了针对DPV UL6 UL7保守区1对特异性引物。通过对反应条件的优化,建立了鸭瘟病毒快速鉴别诊断的PCR方法,扩增片段大小为1 293 bp。试验结果表明PCR法具有很强的特异性,且敏感性较高,最低DNA模板检出量为15 pg/mL。对鸭瘟的临床病料检测证明,该方法具有特异、快速和敏感的特点,可有效鉴别DPV。     

用竞争PCR方法定量检测猪MHC-DM mRNA

根据GenBank中猪MHC-DM基因序列,用RT-PCR技术从猪肺泡巨噬细胞中扩增和克隆了猪DM基因部分片段,经测序鉴定后,用反向PCR技术构建了其缺失竞争cDNA分子。通过竞争PCR方法,建立了猪DM标准竞争曲线,并得到其直线回归方程。本方法操作简便,特异性和敏感性高,可用于猪DM mRNA水平的定量检测。