桃ACC氧化酶基因的克隆和植物表达载体的构建

以‘玉露’桃叶片基因组ＤＮＡ为模板,用ＡＣＣ氧化酶基因特异寡聚核苷酸为引物进行ＰＣＲ扩增,得到１．３ｋｂ左右的扩增产物,将其克隆到ｐＵＣ１９加Ｔ载体上,组建亚克隆并进行序列测定,结果表明,该基因全长有１２８８个碱基,由４个外显子和３个内含子组成。外显子由９５７碱基组成,编码３１９个氨基酸。该基因与桃、番茄、矮牵牛、康乃馨、苹果ＡＣＣ氧化酶ｃＤＮＡ氨基酸序列同源性分别为９９．３％,８３．０％,７６．８％,７４．０％,７５．０％。ＲＮＡ点杂交表明,该基因在未成熟果实检测不到杂交信号,随着成熟度增加,硬度下降,基因表达增强。将ＡＣＣ氧化酶基因分别正向和反向克隆到植物表达载体ｐＢＩ１２１中,并通过酶切分析,ＰＣＲ和点杂交鉴定重组质粒正确。将重组表达质粒导入根癌农杆菌中,经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定证实质粒已被导入。     

猕猴桃ACC氧化酶cDNA克隆及全序列测定

从‘秦美’猕猴桃（ＡｃｔｉｎｉｄｉａｄｅｌｉｃｉｏｓａＣ．Ｆ．ＬｉａｎｇｅｔＡ．Ｒ．Ｆｅｒｇｕｓｏｎ．ｃｖ．Ｑｉｎｍｅｉ）呼吸高峰跃变初期的果实中提取总ＲＮＡ，然后纯化得ｍＲＮＡ，用Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）作为引物反转录合成ｃＤＮＡ第一链，以此为模板，用人工合成的寡聚核苷酸作为引物进行扩增，得到大小约０．９５Ｋｂ基因片段，并将其克隆到ｐＧＥＭ－５ｚｆ（＋）载体上。经限制性内切酶图谱分析，组建亚克隆并进行了全序列测定，在其开放读码框架内，由９５７个ｂｐ编码３１９个氨基酸组成，该ｃＤＮＡ与海沃德ＡＣＣ氧化酶ｃＤＮＡ的核苷酸和氨基酸残基同源率分别达９５．０１％和９５．６１％，证明己克隆到完整的秦美猕猴桃ＡＣＣ氧化酶基因编码区。     

哈密瓜ACC氧化酶cDNA克隆及其序列分析

以哈密瓜成熟果实为材料,用改进的异硫氰酸胍一步法提取总ＲＮＡ,通过ＲＴ－ＰＣＲ方法和ＤＮＡ序列测定证实获得了甜瓜ＡＣＣ氧化酶多基因家族中一个与果实后熟有关的基因ＣＭ－ＡＣＯ１的ｃＤＮＡ克隆ｐＣＭ－ＡＣ０１,序列分析结果表明该序列与国外以罗马甜瓜为材料获得的相同基因的ｃＤＮＡ序列完全相符。推断该基因在甜瓜种内可能是完全或高度保守的,不同类群之间无进化上的分歧。     

猕猴桃成熟果实中脂氧合酶基因的克隆

采用ＰＣＲ扩增方法,从成熟猕猴桃果实组织中克隆到一个８２４ｂｐ的脂氧合酶（ＬＯＸ）基因片段（ｐＫＬＣ１）,该片段含有２７５个氨基酸组成的开放阅读框架,它与拟南芥菜、黄瓜、豌豆、土豆、水稻、大豆、烟草和番茄的核苷酸同源性为５９．０％～７４．６％,氨基酸同源性为６３．１％～７６．３％。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交表明,ｐＫＬＣ１片段为一低拷贝数基因家族所编码。     

龙眼rbcL基因结构分析

通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交等分析,分离和克隆了龙眼叶绿体ＤＮＡ Ｌ１４５片段,其中含大部分ｒｂｃｌ基因。通过酶切分析制物理图谱,结合亚克隆和ＰＣＲ扩增,测序分析了龙眼ｒｂｃｌ基因全序列１８３６ｂｐ,其中基因编码为１４２８ｂｐ,编码４７５个氨基酸和一个终止密码子,ｒｂｃｌ基因的５’上游区长２８４ｂｐ,在基因上游区－１９１～－２２０ｂｐ范围内有推测的类似原核生物的启动子序列：－１０区的ＴＡＣＡＡＴ,－３     

西瓜花叶病毒2号外壳蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

以郑州地区西瓜花叶病病叶分离物──西瓜花叶病毒２号（２－ＷＭＶ－）为毒源，从繁殖寄主西葫芦病叶中分离、鉴定了病毒。以病毒基因组ＲＮＡ为模板，逆转录合成ｃＤＮＡ，通过多聚酶链式反应（ＰＣＲ），从ｃＤＮＡ中扩增和克隆了病毒外壳蛋白（ＣＰ）基因，其中包括３’端非编码区，完成了全部核苷酸序列分析。ＣＰ基因全长１０９９个苷耷酸，其中编码区长９０３个核苷酸，编码３０１个氨基酸，３’端非编码区长１９６个核苷酸。Ｚ－ＷＭＶ－２ＣＰ基因的编码区比Ａ－ＷＭＶ－２，Ｕ－ＷＭＶ－２两株系的ＣＰ基因编码区分别长出６０个核耷酸，多编码２０个氨基酸。与两个株系相比，编码区的核昔酸序列同源性分别为８８．５％和８７．０％，氨基酸序列同源性分别为９０．０％和８８．７％，３，端非编码区的同源性分别为６８．３％和７１．８％。若不考虑Ｚ－ＷＭＶ－２多出的６０个核苷酸及２０个氨基酸，则上述同源性依次为９５．４％、９３．７％、９６．４％、９５．０％、８８．８％和９３．４％。构建了含ＷＭＶ－２ＣＰ基因的大肠杆菌表达载体，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，表达出了与天然病毒外壳蛋白分子量相同的蛋白。     

桃早熟芽变品种‘大观一号’的RAPD分析及其特异片段的克隆

利用４０个单个和混合随机引物对桃布目 早生及其早熟芽变品种‘大观一号’基因组ＤＮＡ的多态性进行ＲＡＰＤ分析,其中有一个引物能检测出两者之间ＤＮＡ的多态性,在１．１ｋｂ处‘大观一号’多了一条特异性条带,将该片段克隆到ｐＵＣ１９载体,并作了酶谱分析。     

杨梅酸性转化酶基因cDNA分离及表达分析

杨梅果实富含蔗糖,酸性转化酶是蔗糖代谢关键酶,根据植物酸性转化酶基因保守区序列设计引物,提取杨梅叶片RNA,逆转录获得cDNA,以此为模板通过PCR技术扩增到长度为516bp的基因片段,克隆入pMD18-T载体中,命名为MrIVR1(GenBank:DQ339699)。测序及同源性检索表明,该基因推导氨基酸序列与君子兰、葡萄、草莓、胡萝卜等酸性转化酶基因氨基酸序列同源性为60%～69%。运用ClustalX软件对植物转化酶基因进行了系统树分析,结果显示,MrIVR1编码的蛋白质属于细胞壁酸性转化酶。半定量RT-PCR表达分析显示,MrIVR1基因在杨梅果实发育早期表达量最高,随着果实的发育表达量下降,在成熟果实中表达水平较低。     

香蕉泛素结合酶基因与果实成熟关系的研究

根据香蕉果实采后早期成熟的抑制缩减杂交文库获得的香蕉泛素结合酶基因片段,从香蕉（Musa acuminate L. AAA group‘Brazilian’）果实中克隆了泛素结合酶基因的cDNA全长,命名为MaUCE1。该cDNA全长890 bp,编码152个氨基酸。BlastX分析表明,该基因所推导的氨基酸序列与烟草（BAB40310）、小麦（AAA34310）、拟南芥（L19351）和马铃薯（ABA46759）有较高的一致性（95.39%、95.39%、92.11%和90.79%）,并且结构域分析发现该序列具有泛素结合酶E2的酶活性中心部位和一个与其他真核生物泛素E2酶相同,在泛素E2硫酯键形成中具有催化活性,并在进化上高度保守的半胱氨酸残基。该基因在香蕉根、茎、叶、花、果实中均有表达,但在花和果实中的表达量较高,并且在果实成熟后期表达量升高,与淀粉磷酸化酶活性变化一致,与淀粉含量的变化呈负相关,暗示该基因可能参与香蕉果实成熟过程中的分解代谢,而与果实成熟启动无关。     

甜樱桃果实NCED基因的克隆及其表达

为了进一步研究ABA在甜樱桃果实成熟过程中的作用,通过RT-PCR以及RACE-PCR方法从甜樱桃果实克隆得到了ABA合成关键酶NCED基因片段PacNCED1及其3′ 末端序列,从乙烯利处理果实中克隆得到了乙烯合成关键酶ACO基因片段PacACO1。推测的PacNCED1和PacACO1氨基酸序列与其它物种的NCEDs和ACOs氨基酸序列具有很高的同源性。通过半定量RT-PCR及定量RT-PCR方法分析了PacNCED1和PacACO1的表达模式,发现PacNCED1在甜樱桃果实发育的整个过程以及不同部位都有表达,在果肉和种子中的表达不断增加,在果实成熟之前达到最高峰,而在果柄中的表达则在果实完熟时达到最大。PacNCED1在未失水的叶片和根中有微弱表达,但在失水叶片中的表达急剧上升,表现出与失水的相关性。外源ABA和乙烯利能促进PacNCED1在果实中的表达,而NDGA和IAA对PacNCED1在果实中的表达没有显著影响。在甜樱桃果实发育过程中并没有检测到PacACO1的表达信号,但是外源乙烯利和ABA处理能诱导其在果实中的表达。     

乙酰水杨酸对采后玉露桃果实成熟衰老进程和乙烯生物合成的影响

20℃下用1.0mmol/L(pH3.5)的乙酰水杨酸(ASA)处理玉露桃Prunuspersica(L.)Batsch果实,分析其对果实成熟衰老相关因子的影响。结果表明,随着果实成熟衰老,LOX活性、超氧自由基()生成速率、ACC合成酶、ACC氧化酶活性和乙烯释放均呈峰形变化,果实硬度迅速下降,组织电导率持续上升;ASA处理显著抑制了峰前相应的LOX、ACC合成酶和ACC氧化酶活性变化以及乙烯释放,维持了较高的果实硬度和细胞膜的完整性,延缓了果实的成熟衰老。     

Methyl jasmonate plays a role in fruit ripening of ‘Pajaro’ strawberry through stimulation of ethylene biosynthesis

The role of methyl jasmonate (MJ) in strawberry (Fragaria × ananassa Duch. cv Pajaro) fruit ripening was investigated by monitoring its endogenous concentrations in fruit at various stages of development and the effects of exogenously applied MJ at these stages on ethylene biosynthesis. The concentration of endogenous trans-MJ was significantly higher in the white fruit (31.7–162.2 ng g⁻¹) and decreased sharply in half and fully ripe fruit. Higher concentrations of endogenous trans-MJ at the white stage of strawberry fruit development followed by a decline during fruit ripening indicate that MJ may play an important role in modulating fruit ripening. Significantly increased ethylene production was measured in the fruit when MJ was applied at white, half ripe and at fully ripe stage. The application of MJ (50 μM) resulted in significantly highest ethylene production and increased activities of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) synthase and ACC oxidase as compared to all other treatments. The effect of exogenously applied MJ on ethylene production, ACC synthase and ACC oxidase activities was dependent on concentration of MJ applied and on fruit developmental stage. In conclusion, MJ in strawberry modulates fruit ripening, as its concentration is higher in white fruit and is declined with the progression of ripening and exogenous application of MJ increases ethylene production, activities of ACC oxidase and ACC synthase depending upon the concentration of MJ applied and fruit developmental stage.     

1-MCP对不同成熟度白凤桃冷害发生的影响

以白凤桃果实为材料,研究了1-甲基环丙烯(1-MCP)对低温冷藏条件下果实成熟生理和冷害发生的影响。实验采用25μL/L1-MCP分别对底色转白期(MG)和成熟期(RR)桃果实进行处理,然后置于(0±1)℃冷库中贮藏24d。结果表明,1-MCP处理都能够延缓MG和RR果实的后熟软化进程,降低乙烯释放量,并抑制了果实快速软化阶段的PG酶活性;1-MCP处理提高了贮藏后期MG果实的硬度,降低了出汁率,加剧了冷害的发生程度,1-MCP处理对RR果实的冷害发生率没有显著影响,表明1-MCP对桃冷害的发生程度与果实成熟度有关。     

脱落酸在桃果实成熟过程中的作用

 以白凤桃为试材,分析研究了桃果实生长发育过程中脱落酸（ABA）的变化以及外源ABA和氟啶酮（Fluridone）处理对果实发育后期离体果实后熟衰老进程的影响,探讨了ABA与桃果实成熟的关系。结果表明：桃果实生长发育后期果实内源ABA的积累构成了果实成熟的启动信号,而ABA高峰的出现启动了果实的后熟衰老进程;外源ABA处理促进了采后果实的后熟衰老进程,而Fluridone处理抑制了果实内源ABA的生物合成和乙烯产生,延缓了桃果实的后熟软化;乙烯则可能作为ABA的一种辅助因子影响果实的后熟衰老进程。     

柿果ACC合成酶基因的克隆与植物表达载体的构建

以柿果组织中分离的总RNA为模板,经RT-PCR扩增到约1.1 kb的富有柿果ACC合成酶(Fuyu-ACS)的 基因片段,将此片段克隆到pGEMR-T easy vector上,经测序分析与Genbank中平核无柿果的DK-ACS1基因核苷酸 序列的同源性为99％。设计了2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个ACS- Fuyu片段。2个片段经双酶切消化后,分别以正反2个方向插入到植物表达载体pBI121的35 S启动子和NOS终止 子之间,构建成Fuyu-ACS基因的植物表达载体。     

乙酰水杨酸调控猕猴桃果实后熟软化进程中的Ad-EXP1基因表达

以布鲁诺猕猴桃(Actinidia deliciosa cv.Bruno)成熟果实为材料,根据植物α-expansin(EXP)基因的氨基酸保守序列设计简并引物,利用RT-PCR方法结合3’RACE扩增得到1个长为957bp的cDNA片段(Ad-EXP1)。该基因片段编码211个氨基酸,与其它植物该基因核苷酸同源性为59%～85%,氨基酸同源性为73%～91%。Northern杂交结果表明,Ad-EXP1基因在采收当天的果实中表达很弱,随着果实成熟衰老进程加快趋于增强;乙酰水杨酸(ASA)处理延缓果实后熟软化和乙烯生成,也显著抑制Ad-EXP1基因表达。鉴于Ad-EXP1表达丰度与乙烯生成、果实软化程度的一致性,推测该基因在猕猴桃果实后熟软化进程中起着重要作用。     

果实特异启动子调控薄皮甜瓜ACC合成酶cDNA反义表达载体的构建

应用反义RNA技术抑制甜瓜成熟过程中内源乙烯的合成,从而培育耐贮运品种是解决甜瓜延熟保鲜难题的可行新方法。根据GenBank中甜瓜、黄瓜ACC合成酶基因氨基酸保守序列设计引物,从成熟的薄皮甜瓜(齐甜1号)果肉组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到约0.7kb的ACC合成酶cDNA片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为777bp,编码258个氨基酸;从番茄(东农706)叶片组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约2.2kb的E8基因片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为2192bp;以pCAM2301为起始植物表达载体,pCAM-GT为中间载体,成功构建了果实特异启动子(E8)调控薄皮甜瓜ACC合成酶cDNA反义表达载体,采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。     

桃果实离核性状的RAPD分子标记及克隆

为获得桃果实离核性状基因的分子标记,以桃(Prunus persica L.)品种京玉和美味的69株正反交F1代为试材,采用RAPD分析技术和BSA法,获得了控制桃果实离核性状基因的RAPD分子连锁标记OPI07-1000,该标记与目的基因的连锁遗传距离为2.5cM。对该片段回收、克隆后进行测序,得到全序列,长度为1054bp,该序列可作为进一步合成检测桃果实离核性状探针的基础,用于早期检测果实性状和分子标记辅助育种。     

肥城桃两品系果实细胞壁成分和水解酶活性的比较

 随着果实发育成熟，肥城桃两品系果实中细胞壁含量不断下降。可溶性果胶从8月1～16日明显增加，这时果肉硬度下降最快。两品系果实的细胞壁中离子结合果胶和纤维素含量下降比例不同，这可能是造成两品系成熟软化特性不同的主要因素之一。果实发育后期‘白里肥城桃’和‘红里肥城桃’纤维素酶活性变化的不同，意味着纤维素酶在肥城桃果实软化中起重要作用。肥城桃果实中没有检测到内切PG活性，成熟后期外切PG活性上升较快。     

6个甜樱桃品种ACO基因多态性的检测

乙烯在植物果实成熟过程中起着重要的作用,ACC合酶(1-aminocyclop ropane-1-carboxylic acid synthase,ACS)和ACC氧化酶(1-aminocyclop ropane-1-carboxylic acid oxidase,ACO)是植物乙烯生物合成途径的限速酶。通过DNA序列分析,以不同果实成熟期的6个甜樱桃品种(Prunus avium L.)为材料,检测ACO基因的多态性。获得甜樱桃ACO基因约1 kb,与桃(P.persica)ACO基因(GenBank登录号:AF532976)序列的同源性达96%,其预测的氨基酸序列与桃、梅(P.mume)、美洲李(P.armeniaca)和欧洲李(P.domestica)等ACO的氨基酸序列同源性超过95%。该片段包括4个外显子和4个内含子,内含子符合GT-AT规律。用DNAMAN进行多序列比对分别在内含子2和内含子4内发现2个多态性简单重复序列(AT)n。内含子2有3种片段:即(AT)6、(AT)7和(AT)8;内含子4有2种片段,即(AT)5和(AT)6,组合后共得到4种ACO单倍型。研究在甜樱桃ACO基因座上发现2个SSR标记,为进一步研究ACO基因多态性与果实成熟期相关性奠定基础。