鸡Ii基因的克隆、鉴定及其原核表达

从ConA诱导的5周龄SPF鸡脾细胞中提取总RNA,用自行设计的一对引物通过RT—PCR方法扩增出鸡恒定链(invariant chain,Ii)基因片段。经酶切鉴定后,再将该片段克隆到pcDNA3载体中,测定其DNA序列,结果表明该片段长度为669bp,其DNA序列与GenBank登录的基本一致。再将该片段插入原核表达载体PGEX-4T-1,并导入菌株BL21,经诱导培养、蛋白提取和SDS—PAGE,获得分子量约为50kD的特定蛋白条带,表明所克隆的鸡Ii基因在原核细胞中得到表达。     

小鼠CD19基因部分片段的克隆及其鉴定

[目的]为了研究小鼠CD19胞膜外区的结构与功能。[方法]应用反转录—聚合酶链式反应技术(RT-PCR),通过一对自行设计的引物,从小鼠脾脏RNA中扩增出一条特异性基因片段,大小约为910 bp,对该片段进行酶切和测序鉴定。[结果]所获得的DNA片段的酶切位点与所报道的小鼠CD19基因一致,从而确定其为小鼠CD19胞膜外区基因。[结论]该研究为小鼠CD19胞膜外区的结构与功能的进一步研究提供了试验基础。     

小鼠IL-10基因的克隆及其原核表达

从ConA活化的昆明小鼠脾细胞中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增得到小鼠的IL-10基因.编码序列经测序验证后,将其克隆入表达载体pET-28a,构建IL-10基因的重组原核表达载体,在大肠杆菌(DE3)中诱导表达目的蛋白.SDS-PAGE结果表明,该表达产物的分子量与预期值相符,Western blot结果说明小鼠IL-10基因得到了表达.     

稳定表达鸡恒定链基因的P815细胞株的建立与鉴定

[目的]获得稳定表达鸡恒定链基因（Ii）的P815细胞株。[方法]利用PCR方法获取鸡Ii链基因,利用脂质体转染P815细胞,加入G418筛选阳性细胞克隆,最后利用RT-PCR进行鉴定。[结果]通过PCR获得鸡Ii基因,大小为672 bp,进一步定向插入真核表达载体,构建重组质粒pEGFP-C1-Ii,经双酶切鉴定后转染P815细胞,通过多次克隆获得含鸡Ii链基因并能稳定表达的阳性细胞株,经RT-PCR再次鉴定,并命名为P815-Ii。[结论]获得了稳定表达鸡Ii的P815细胞株,为进一步研究Ii的结构与功能奠定了基础。     

小鼠TRIM59蛋白多克隆抗体的制备、鉴定与初步应用

【目的】制备兔抗鼠三结构域蛋白59(Tripartite motif-containing 59,TRIM59)多克隆抗体。【方法】利用PCR方法得到小鼠TRIM59基因片段,将其克隆至pGEX-2T原核表达载体中,转入大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达GST-TRIM59融合蛋白。GST-TRIM59融合蛋白经亲和层析纯化浓缩后免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,通过ELISA测定兔抗鼠TRIM59多克隆抗体效价,用Western blot测定其特异性。用免疫组织化学方法检测TRIM59在小鼠前列腺癌组织中的表达。【结果】成功构建了pGEX-2T-TRIM59原核表达重组质粒,并诱导表达出GST-TRIM59融合蛋白,免疫新西兰大耳白兔5周后获得多克隆抗体。ELISA测定结果表明,TRIM59多克隆抗体效价为1∶106以上;Western blot分析表明,TRIM59多克隆抗体具有良好的特异性。免疫组织化学检测发现,TRIM59在小鼠前列腺癌组织细胞中高表达。【结论】成功地制备了特异性良好的兔抗鼠TRIM59多克隆抗体,其具有良好的免疫学活性,能够用于相关研究。     

肠炎沙门氏菌鞭毛蛋白基因快速克隆和鉴定

以提纯的肠炎沙门氏菌染色体ＤＮＡ为材料,在一对含有ＣＵＡＣＵＡＣＵＡＣＵＡ的特殊引物引导下,应用ＰＣＲ扩增出鞭毛蛋白基因ｆｌｉＣｇ．ｍ,允１．８ｋｂ左右大小,然后以ＵＤＧ法快速克隆到质粒,ｐＡＭＰ１０中,转化第１宿主大肠杆菌ＴＧ１或大肠杆菌ＤＨ５ａ,在氨苄青霉素平板上筛选转化子,小量制备重组质粒ＤＮＡ,再转入第２宿主大肠杆菌ＬＣ－２ａ（ｈａｇ－,ｒｅｃＡ－）,所有转化子均出现动力。其中的一个克隆ｐ     

麦洼牦牛血红蛋白α链基因的克隆测序

从麦洼牦牛脊髓中提取总RNA，利用RT-PCR扩增血红蛋白α链基因，获得了532bp的cDNA，连接到PMD-l8载体上，然后转化TOP-10感受态细胞进行克隆测序。结果显示，牦牛血红蛋白α链基因与普通牛相比存在2个碱基差异，并导致血红蛋白α链71位的1个氨基酸改变。此外，还用电泳方法研究了血红蛋白在新生犊牦牛中的表达。     

鹅副粘病毒HZ株HN蛋白基因的克隆及鉴定

以鹅副粘病毒HZ株的基因组RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增出HN基因片段,然后将其克隆到pUCm-T载体中.经转化、筛选、酶切和PCR鉴定后,初步获得含鹅副粘病毒HN基因的阳性克隆,并进行序列测定验证.结果表明,该基因由1 716个核苷酸组成,共编码571个氨基酸.与GenBank下载的11株参考毒株的HN基因作同源性比较,发现HZ株与ZJ1、GY97等毒株的核苷酸同源性高达97%以上,而与Lasota、F48E9等经典NDV株的同源性在80%～83%之间.说明HZ株与经典NDV株的亲缘关系较远,而与江苏近年来分离的鹅源副粘病毒株的亲缘关系非常近;本试验克隆到的是完整的鹅副粘病毒HN基因.     

肠炎沙门氏菌鞭毛蛋白基因快速克隆和鉴定

以提纯的肠炎沙门氏菌染色体ＤＮＡ为材料,在一对含有ＣＵＡＣＵＡＣＵＡＣＵＡ的特殊引物引导下,应用ＰＣＲ扩增出鞭毛蛋白基因ｆｌｉＣｇ,ｍ,约１．８ｋｂ左右大小,然后以ＵＤＧ法快速克隆到质粒ｐＡＭＰ１０中,转化第１宿主大肠杆菌ＴＧ１或大肠杆菌ＤＨ５α,在氨苄青霉素平板上筛选转化子,小量制备重组质粒ＤＮＡ,再转入第２宿主大肠杆菌ＬＣ－２ａ（ｈａｇ－,ｒｅｃＡ－）,所有转化子均出现动力。其中的一个克隆ｐＡＭＰ·ＧＭ经动力和动力抑制试验、血清学试验、鞭毛电镜观察及部分序列测定,均证实ｐＡＭＰ·ＧＭ中载有肠炎沙门氏菌鞭毛蛋白基因ｆｌｉＣｇ,ｍ。ｆｉｌＣｇ,ｍ克隆成功为寻求肠炎沙门氏菌防制新方法奠定了基础,研究中建立的快速克隆策略为广泛、深入地开展ｆｌｉＣ研究提供了便捷的新途径。     

犬冠状病毒的分离鉴定及其S基因的克隆

从疑似犬冠状病毒(CCV)症状病犬粪便中分离出一株病毒,合成通用引物(2Bp,4Bm)和CCV特异性引物(CCVF2,CCVR2)进行RT-PCR反应及限制性内切酶BstXⅠ酶切鉴定,并将纯化的PCR产物成功地克隆到pGEM-T-easy载体中。RT-PCR反应结果,BstXⅠ酶切鉴定结果以及重组质粒PCR鉴定结果均得到预计扩增片段。重组质粒测序结果与GenBank的CCV序列进行比对,与之相符,表明本次实验分离到的病毒为CCV。     

小鼠Nanog基因原核表达载体的构建及表达

【目的】构建小鼠Nanog基因原核表达载体并进行表达，以期得到大量GST融合蛋白。【方法】根据GeneBank中的Nanog序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物，以含有Nanog基因片段的pNA992重组质粒为模板，经PCR扩增出918 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接，转化TGⅠ大肠杆菌，筛选阳性克隆，其扩增片段测序结果与原序列一致，表明原核表达载体pGEX-KG-Nanog已构建成功。提取pGEX-KG-Nanog质粒转化到BL21（DE3）表达菌株中，经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定，并优化其表达条件。【结果】在大肠杆菌中获得Nanog基因融合表达，主要以包涵体形式存在；融合蛋白的分子量为63 kD；以IPTG终浓度为0.8 mmol•L-1，诱导5 h后融合蛋白产量最高。【结论】小鼠Nanog基因在大肠杆菌中获得了高效表达，为今后Nanog蛋白的多克隆抗体制备奠定基础。     

油菜COR基因的克隆及原核表达

以冬油菜陇油6号叶片为材料,利用RT-PCR法克隆到油菜COR基因编码区序列,全长390 bp。将其与大肠杆菌表达载体p ET-30a连接,构建原核表达载体p ET-30a-COR,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE检测结果表明该基因表达了1个约14.3 k D的蛋白,为进一步研究目的蛋白的结构和功能提供了实验基础。     

猪瘟病毒E2基因的克隆及其初步鉴定

[目的]为了研究猪瘟病毒E2蛋白的抗原性质和进一步筛选保护性抗原表位。[方法]克隆猪瘟病毒E2蛋白的部分基因片段,通过自行设计的一对引物,应用RT-PCR从猪瘟兔化弱毒株细胞培养物,扩增出一DNA片段,并对其进行鉴定。[结果]经初步鉴定,该片段大小约703 bp,核苷酸序列测定结果表明该片段为E2蛋白基因。[结论]该研究为筛选CSFV抗原奠定了基础。     

犬新孢子虫NcSRS2基因片段的克隆及原核表达

以含有犬新孢子虫NcSRS2基因的质粒pMD18-NcSRS2为模板,应用PCR方法扩增Nc-SRS2基因,将该基因片段克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,构建了重组表达质粒pGEX-Nc-SRS2,转化大肠杆菌BL21中并诱导表达。结果显示,克隆的基因片段长1100bp,SDS-PAGE、Western blotting分析显示,重组质粒pGEX-NcSRS2在大肠杆菌中得到了高效表达。     

金黄色葡萄球菌FnBP配体结合区基因的克隆及其原核表达(英文)

[Objective] The study aimed to clone the FnBP ligand binding gene of Staphylococcus aureus and run prokaryotic expression by constructing a prokaryotic expression vector. [Method] The gene encoding FnBP ligand binding gene was amplified from S.aureus chromosomal DNA by PCR technique. After T-A cloning, plasmid pMD18- FnBP was constructed. pMD18- FnBP and pET28a(+)were digested by BamH Ⅰ and EcoR Ⅰ double enzymes, then the purified FnBP ligand binding gene was subcloned into the expression vector pET28a(+), and the prokaryotic expression vector pET28a-FnBP was thus constructed. The constructed plasmid pET28a-FnBP was transformed into Escherichia coli BL21(DE3) competent cells. The bacterium was induced by IPTG and the expressed products were analyzed by SDS-PAGE and Western blot. [Result] The gene fragment with the length of 370 bp was amplified by PCR approach. One approximately 30 kD exogenous protein was observed in SDS-PAGE analysis. Western blot analysis indicates the protein has antigenicity of S.aureus. [Conclusion] The FnBP ligand binding gene of S.aureus was successfully cloned and expressed in prokaryotic cells.     

金黄色葡萄球菌FnBP配体结合区基因的克隆及其原核表达

[目的]克隆金黄色葡萄球菌FnBP配体结合区基因,并构建原核表达载体,进行原核表达：方法]设计引物,采用PCR方法扩增FnBP配体结合区基因,BA克隆后,构建了克隆质粒pMD18-FnBP。用BarnHI和EcoRI双酶切pMD18-FnBP和pET28a（＋）,将纯化的基因FnBP亚克隆至pET28a（＋）,构建重组表达质粒pET28a-FnBP,并将其转化至大肠杆茼感受态B121（DF3）中,IPTG诱导表达,并对表达产物进行分析。[结果]PCR扩增出1条约370hp的目的片段,表达产物经SDS-PAGE分析,在30kDa处出现了与目的蛋白一致的外源蛋白带．Westem blot分析表明该蛋白具有金黄色葡萄球菌的抗原性。[结论]已成功构建了FnBP配体结合区基因,并在原核细胞中表达。     

猪Ob-Rb基因的克隆与分析

[目的]采用RT-PCR法克隆与分析瘦素受体06-Rb cDNA序列。[方法]从160日龄初情期的苏姜猪的下丘脑中提取组织总RNA．根据GenBank中猪06．RbmRNA全序列设计引物,用反转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）进行cDNA扩增,获得1条343bp的片段,将PCR产物克隆于pGEM—Teasy载体后进行测序分析。[结果]用紫外分光光度计检测所提取的RNA质量,0D260／OD280=1.9,证明所提RNA的质量较好,无降解和蛋白质污染;用1％的琼脂糖检测所提RNA,有3条清晰的条带,分别是28S、18S、5S,28S与18S浓度比约为2：1．说明所提的RNA的完整性较好。所获D6-RbcDNA序列用Blast程序与在GenBank中发表的猪06-Rb cDNA序列（AF092422）比较表明,其同源性为100％,说明所扩增的序列是正确的。[结论]该研究为进一步探索Ob-Rb基因组织表达和作用机理奠定了理论基础。     

猪圆环病毒2型ORF2基因片段的克隆与原核表达

为在原核表达系统中表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,提取感染PCV2的细胞基因组DNA,PCR扩增ORF2基因片段并克隆至pMD-18T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定后,将该基因重组至pET-28a原核表达载体,构建了表达载体pET-28a-ORF2。该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1mmol/LIPTG于37℃诱导5h得到最佳表达。表达重组蛋白的分子量为26.0kD,以包涵体形式存在。Western-Blot分析表明,该重组蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。