基于纳米孔测序技术对兔腹泻病原的鉴定

为了探索纳米孔测序技术在动物传染病病原快速诊断中的应用价值，采集1只发生腹泻实验兔的肝脏和脾脏进行核酸提取、建库和纳米孔测序分析，同时对该腹泻的实验兔分别进行细菌分离鉴定和腹泻相关病毒的血清学检测。结果显示：纳米孔测序方法运行3 h后，获得1.9 GB的数据量，检出756 521条序列，平均序列长度为2 549.9个碱基。根据对测序数据的生物信息学分析表明，引起实验兔腹泻的病原可能为大肠杆菌。对同批送检的6只实验兔采用常规细菌分离鉴定方法在实验兔的心脏血样品、肝脏、肺脏和回盲部内容物中只分离到了大肠杆菌。对腹泻相关病毒的血清学检测结果显示6只送检的兔均为兔轮状病毒阴性。本研究采用纳米孔测序技术对发生腹泻的实验兔进行诊断，其结果与常规实验室检测方法获得的结果相符合，表明纳米孔技术在动物传染病病原快速检测中具有潜在的应用价值。     

基于表面增强红外光谱技术的大肠杆菌的快速检测方法研究

[目的]建立一种利用红外光谱快速检测大肠杆菌的方法。[方法]利用纳米粒子增强大肠杆菌特性从而通过红外光谱进行快速检测。[结果]利用纳米粒子作为表面增强剂增强大肠杆菌特性后,通过红外光谱技术,能够快速检测出大肠杆菌。[结论]建立了一种利用红外光谱技术快速检测大肠杆菌的方法。     

大肠杆菌O157∶H7实时定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的大肠杆菌O157∶H7的Flic(H7)基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列设计一对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立一个用于大肠杆菌O157∶H7快速定量检测的实时定量PCR方法。该方法的最低检测极限是103CFU/mL,敏感性比常规PCR提高10倍。方法重复性好、特异性强,重复性检测的变异系数均小于2%;只能检测大肠杆菌O157∶H7,对非大肠杆菌O157∶H7血清型细菌、猪链球菌2型、副猪嗜血杆菌无反应。利用此方法对模拟样本进行定量检测,其结果与平板细菌计数基本一致,表明此方法可作为大肠杆菌O157∶H7快速诊断和疫情监测的一种快速、准确、简便的检测工具。     

我国首例小反刍兽疫诊断报告

2007年7月我国西藏发生不明山羊疫情,国家外来动物病诊断中心对当地动物疫病控制中心送检的14只病死山羊病料和一批血清样品分别进行病原学和血清学检测。利用较敏感的小反刍兽疫病毒(PPRV)特异性荧光定量RT-PCR方法,在11只病羊组织中检测到小反刍兽疫病毒核酸。利用次敏感的PPRV普通RT-PCR方法,从8只病羊组织中检测到PPRV核酸。针对1号样本病原核酸N基因和F基因片段进行遗传发生分析,该病原属于4系。利用竞争ELISA试剂盒对送检的13份血清样本进行抗体检测,结果全部阳性。将1号组织样本接种Vero细胞分离病毒,透射电镜观察下,发现了500纳米左右的病毒粒子。对分离毒株进行PCR检测同样证实其为PPRV。     

从福建省部分猪场分离的常见细菌对消毒剂抗性情况调查

为了调查福建省猪场内常见细菌对消毒剂抗性情况,试验于2018年1—12月份采集福建省宁德市、南平市、莆田市、龙岩市、泉州市、厦门市和漳州市7个地区12家猪场水样本240份和粪便样本240份,分离样本中的大肠杆菌、肠球菌、沙门氏杆菌和葡萄球菌,检测所分离细菌对氢氧化钠和乙醇的MIC值,以及分离细菌对碘酸混合液、聚维酮碘和过氧乙酸溶液3种常用消毒剂成品的抗性情况。结果表明:从240份水样本中共分离出大肠杆菌136株,肠球菌105株,葡萄球菌42株,沙门氏杆菌55株;从240份粪便样本中分离出大肠杆菌177株,肠球菌141株,葡萄球菌64株,沙门氏杆菌92株。粪便样本中细菌的分离率高于水样本,且大肠杆菌的分离菌株数最高。猪场常见细菌对现配的氢氧化钠和乙醇溶液MIC值低于常用的浓度,2%～4%氢氧化钠和75%乙醇仍可达到良好的杀菌功效;但样本细菌对3种成品消毒剂都产生了一定的抗性,抗性率为9.5%～18.1%。说明细菌对消毒剂产生抗性情况与细菌的种类、细菌来源、消毒剂的种类、成品消毒剂品牌、使用方法及细菌对抗菌药物耐药性等因素都存在相关性。     

大肠杆菌O157:H7实时定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的大肠杆菌O157:H7的Flic(H7)基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列设计一对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立一个用于大肠杆菌O157:H7快速定量检测的实时定量PCR方法.该方法的最低检测极限是103CFU/mL,敏感性比常规PCR提高10倍.方法重复性好、特异性强,重复性检测的变异系数均小于2%;只能检测大肠杆菌O157:H7,对非大肠杆菌O157:H7血清型细菌、猪链球菌2型、副猪嗜血杆菌无反应.利用此方法对模拟样本进行定量检测,其结果与平板细菌计数基本一致,表明此方法可作为大肠杆菌O157:H7快速诊断和疫情监测的一种快速、准确、简便的检测工具.     

规模化猪场环境中病原菌的调查

为了解规模化猪场环境中的细菌数量与主要病原菌的分布情况。本试验在荣昌地区2个具有代表性的规模化养猪场中采集空气、排污水、粪便和土壤进行细菌总数检测,并对细菌(葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌)进行分离鉴定。结果显示,2个猪场空气、排污水、粪便和土壤样本细菌总数分别为(7.95~50.7)×103 cfu/m3、(0.98~22.10)×105 cfu/mL、(989~12 600)×104 cfu/g、(6.30~37.2)×104 cfu/g;细菌经分离鉴定有79株,其中葡萄球菌30株、链球菌15株、大肠杆菌29株、沙门氏菌5株。结果表明该地区规模化猪场的土壤样本有轻、中度污染,其余样本的细菌总数都符合国家规定;分离的主要病原菌中葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌较多,沙门氏菌较少,其致病性还有待进一步检测。这为当地猪场的卫生消毒和疾病防控提供了重要的参考数据。     

鹅大肠杆菌病的实验室诊断

为确诊某养鹅场雏鹅发病死亡的病因,采集4日龄发病雏鹅的肝脏组织,采用细菌分离鉴定和相关病毒核酸PCR检测方法进行病原学诊断。结果:(1)在肝脏样本中分离出细菌,经染色镜检、生化鉴定、动物感染试验,鉴定为致病性大肠杆菌;(2)鹅细小病毒PCR检测试剂盒检测未发现鹅细小病毒特异性DNA片段。综合诊断为鹅大肠杆菌病。     

贵阳市散养奶牛牛奶中大肠杆菌的分离鉴定与耐药性分析

为了解贵阳市散养奶牛牛奶中大肠杆菌的污染及耐药情况,采集牛奶样本26份,运用细菌分离培养技术对样本进行细菌分离培养;PCR鉴定后测序;细菌药敏实验。结果:共分离鉴定大肠杆菌6株,分离率为23%(6/26);对喹诺酮类、磺胺类表现出较强的耐药性,对氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类喹诺酮类和β-内酰胺类也存在一定的耐药性。     

甘肃省定西市羔羊腹泻病流行病学调查

为了解甘肃省定西市羔羊腹泻疾病发生和流行情况,科学规范指导腹泻病防治工作,2017-2018年对定西市7个县(区)采用基本情况调查、实验室抽样检测等方法进行了羔羊腹泻病流行病学调查,共填写调查问卷3 640份,采集腹泻羊肛门棉拭子样本1 500份、粪便样本700份、血清700份,运用血清学和病原学方法分别对霉菌、大肠杆菌、沙门氏菌、魏氏梭菌、链球菌、轮状病毒、蠕虫、梨形虫和隐孢子虫进行了检测。结果显示：腹泻羔羊样本中致病性大肠杆菌检出率最高,其次是隐孢子虫和轮状病毒。结果表明,羔羊腹泻不是单纯的细菌性疾病,而是病毒、寄生虫、细菌混合感染引起的疾病,并提出了综合防控措施。     

沈阳地区蛋鸡大肠杆菌病流行病学调查及药敏试验

本试验调查沈阳地区28家蛋鸡养殖户及鸡场,样本数量达到15万只蛋鸡,日龄范围从30至500日龄不等,采集了其中50只病鸡的排泄物和内脏样品用于检测和分析。采用鉴别培养基和生化试验对样品进行细菌分离鉴定,再对检出的大肠杆菌进行Ο抗原鉴定。结果表明,在所采集的样品中大肠杆菌检出49例样品为阳性,检出率为98%;鉴定出大肠杆菌36株,定型30株,定型率为83.33%。药敏结果表明,仅恩诺沙星和氟苯尼考对全部采集到的大肠杆菌菌株高敏,其余药物多中敏或轻敏;而传统的青霉素、链霉素多表现为耐药。     

鱼类神经坏死病毒纳米探针的制备与特征分析

为了快速检测鱼类神经坏死病毒,本研究设计了病毒特异性的发夹型探针,经硫醇修饰后与纳米银溶胶结合,制备了鱼类神经坏死病毒纳米探针（Ag-NNV）,并使用透射电镜、多功能酶标仪、表面增强拉曼光谱仪等对纳米探针Ag-NNV的表征及发夹型探针在纳米银粒子表面的覆盖率进行了测定和分析。结果表明,裸露的纳米银粒子为球形,平均直径50 nm;制备的纳米探针颗粒为球形,平均直径90 nm。纳米银粒子和纳米探针在溶液中均具有良好的分散性。平均每个纳米银粒子表面结合发夹型探针约100条,单位表面积的探针覆盖量为0.56 pmol/cm2。该纳米探针制备简便,适合用于表面增强拉曼散射法对鱼类神经坏死病毒进行快速检测。     

不同碳源条件下遗传重组大肠杆菌的生长表型研究

为了研究各碳源条件下yfcC基因重组大肠杆菌的生长表型,了解其生长过程,试验分别以LB、M9-葡萄糖、M9-乙酸为培养基对各重组大肠杆菌进行培养,利用紫外-可见分光光度计测定其OD600值,并绘制各细菌的生长曲线。结果表明:在LB和M9-葡萄糖培养条件下,yfcC基因重组大肠杆菌的生长均没有明显差异;在M9-乙酸培养条件下,yfcC基因过表达菌株的生长速度明显快于其他菌株。说明即使在相同的碳源条件下培养,各细菌也可能具有不同的生长表型,而yfcC基因过表达菌株生长较快可能是由于yfcC基因促进乙醛酸代谢导致的。     

犬源大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

为了研究临床犬致病性大肠杆菌的耐药性,为临床用药提供参考,笔者从本地动物医院就诊的5只腹泻病犬采集5份排泄物样本,进行细菌的分离、培养和生化鉴定,并对分离的菌株进行药物敏感性试验。试验共分离到5株大肠杆菌;分离株对临床上应用较早的药物,如氨苄西林、阿莫西林、复方新诺明等具有较强的耐药性;对阿米卡星、氯霉素、磷霉素比较敏感。笔者建议临床选用这3种药物对患有大肠杆菌病的腹泻犬进行治疗。     

上海地区发病猪群猪圆环病毒2型阳性样本中其他病原混合感染状况调查

本研究对2009年至2011年上海地区发病猪群内脏样本进行猪圆环病毒2型(Porcine circovirus,PCV2)检测,对PCV2阳性样本进行2a/2b分型检测,并对PCV2阳性样本进行其他病原混合感染状况调查。上海地区发病猪群PCV2阳性率平均为54.34%,以PCV2b单纯感染为主。在PCV2阳性样品中,其他病毒混合感染率平均达到60.2%,细菌混合感染率达到61.22%,病毒与细菌同时混合感染率为41.84%,平均混合感染率达到53.06%。研究表明,上海地区发病猪群PCV2阳性样本与其他病原混合感染比例较高,病毒主要以PRRSV为主,细菌主要以大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌及副猪嗜血杆菌为主;混合感染是导致猪群死亡的重要因素,也是当今上海地区猪群疫病的感染现状及发病模式。     

氟甲砜霉素对鸡大肠杆菌的疗效研究

鸡大肠杆菌病逐年来受到兽医工作者和养殖户的高度关注,被认为是近年来危害集约化养鸡场的重要鸡病.全国每年因大肠杆菌病造成的鸡只死亡高达40％以上.据研究表明大多数抗菌药物对大肠杆菌病都有效,但容易产生耐药性,即使相同成分的药物,因用量不同,效果也各不相同.为此,评价氟甲砜霉素[1]对大肠杆菌病的疗效,采用饮水给药方式进行防治.     

市售鲜猪肉葡萄球菌和大肠杆菌污染及其PCR快速检测

为了解市售鲜猪肉葡萄球菌和大肠杆菌污染情况,本试验从贵州省9个地区农贸市场采集鲜猪肉样本106份,3个地区屠宰场运输车辆采集棉拭子样本36份,采用传统生化法鉴定2种优势菌落;PCR法快速检测葡萄球菌和大肠杆菌。结果显示,鲜猪肉和棉拭子样本葡萄球菌的分离率为23．5％（38／162）和31．9％（23／72）,大肠杆菌的分离率为15．4％（25／162）和13．9％（10／72）;2种细菌可扩增出目的条带。结果表明,市售鲜猪肉及运输车辆葡萄球菌和大肠杆菌污染严重,本试验成功运用PCR法对这2种病原菌进行快速检测。     

链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

根据NCBI上已收录的链球菌ef-tu基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门菌hut基因和大肠杆菌23SrRNA基因的序列,设计并合成4对特异性引物,通过优化多重PCR的反应条件,建立了能够同时检测4种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析结果表明,应用该方法可以从链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌以及4种细菌的混合物中扩增出4条大小分别为197、278、495和652bp的特异性条带,其他对照组的检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对4种病原菌基因组DNA的检出量分别为链球菌25.6pg、金黄色葡萄球菌33.2pg、沙门菌35.7pg、大肠杆菌52.1pg;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中特异地检测出4种病原菌。本试验建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效的检测链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌的混合感染。     

大肠杆菌O157显色培养基在饲料检测中的应用研究

为探讨大肠杆菌O157显色培养基在饲料微生物检测中的应用价值,试验利用免疫磁珠法和大肠杆菌O157显色培养基对60份饲料样品进行大肠杆菌O157分离鉴定,对疑似阳性的菌落提取基因组DNA,利用PCR扩增蜡样芽胞杆菌ofb基因进行测序验证。结果表明,饲料样本经过免疫磁珠法筛选后,亚碲酸钾山梨醇麦康凯(CT-SMAC)琼脂检出阳性的样本数为13例(21.67%);大肠杆菌O157显色培养基阳性样本为8例(13.33%);通过ofb基因测序验证CT-SMAC琼脂和显色培养基方法检测假阳性率分别为84.60%和75.00%。大肠杆菌O157显色培养基用于饲料中大肠杆菌O157的检测,能够有效抑制其他杂菌的生长,降低普通培养基检测的假阳性率,适合于饲料中大肠杆菌O157的检测。     

奶牛乳房炎中大肠杆菌PCR检测方法的初步建立

大肠杆菌是引起奶牛乳房炎的一种主要细菌.为了建立PCR直接检测奶牛乳房炎致病菌的方法,本试验以大肠杆菌为主要研究对象,根据已发表的致病性大肠杆菌16-23S rRNA特异性序列设计并合成一对引物,对昆明市的某发生奶牛乳房炎的病牛的牛奶进行大肠杆菌PCR检测,并对扩增片段进行序列分析,建立一种直接从牛奶中检测大肠杆菌的PCR快速诊断方法.结果表明,该方法能够检测到乳样中的大肠杆菌,而且具有快速、准确和特异的优点.