尼罗罗非鱼无乳链球菌病的病理学研究

为了解尼罗罗非鱼感染无乳链球菌后各组织的病理变化,运用革兰氏染色和电镜负染技术对一株从自然发病的尼罗罗非鱼上分离的无乳链球菌进行形态观察,采用组织切片和超薄切片电镜技术对患病尼罗罗非鱼的肝脏、脾脏、肾脏、脑、心肌、骨骼肌、肠、鳃等8种组织进行病理学研究,探讨该病的致病机理。结果显示,革兰氏染色呈阳性,负染后透射电镜观察多数细菌呈链状排列;组织病理学变化主要是各内脏器官的广泛充血、水肿、变性和炎性细胞浸润,严重的细胞坏死;超微病理显示,大量球菌侵染脾脏等内脏组织,破坏细胞结构和各种细胞器;细胞界限模糊,细胞核畸形,线粒体肿大,嵴断裂,溶解;粗面内质网肿大、核糖体脱落;细胞质空泡化严重;心肌和骨骼肌纤维断裂、紊乱、肌节长短不一;肠微绒毛排列不整齐、长短不一;眼中有纤维性沉积。研究表明,无乳链球菌能造成尼罗罗非鱼全身性组织器官损害和炎症反应,尤其是肝脏、脾脏、肾脏和脑等重要器官功能障碍和衰竭,最后导致鱼体死亡。     

一株罗非鱼源无乳链球菌的分离鉴定及耐药性分析

从海南省三亚市崖州区养殖的罗非鱼中分离得到一株优势病原菌,命名为H H-0708.经由16S rD-N A序列测定、菌落形态观察、生理生化试验,H H-0708被鉴定为无乳链球菌.H H-0708体外药敏结果显示:其对青霉素、头孢呋辛、多西环素等11种抗生素高度敏感,而对四环素、庆大霉素等9种抗生素表现出较强的耐药性,...     

湖北吉富罗非鱼源Ⅰa无乳链球菌毒力分析及药敏特性

为探明湖北荆州某养殖场吉富罗非鱼(Genetic Improvement of Farmed Tilapia, GIFT)致病原因,对感染的罗非鱼精准施治,本研究从湖北荆州某养殖场患病吉富罗非鱼脑组织分离到一株优势菌。结果显示：该菌在BHI平板上生长出光滑、圆形、白色菌落,显微镜观察发现细菌呈单个、成对或球形短链状,长短不一,且革兰氏染色为阳性。经16S rRNA序列、PCR鉴定和生理生化特性鉴定,确定分离菌株为罗非鱼无乳链球菌,命名为JZ-202108。分离菌株JZ-202108血清型为Ⅰa型,携带gapC、sodA、bac、bca和hly等5种毒力基因。分离菌株JZ-202108人工感染吉富罗非鱼的症状与自然发病症状类似,出现神经症状和严重的内脏出血现象,并从脑组织中分离到强毒株,其LD₅₀为3.4×10⁵ CFU/尾,对吉富罗非鱼致病性较强。药物敏感性实验表明,分离菌株JZ-202108对β-内酰胺类、头孢类药物敏感,对氨基酸糖苷类药物耐药;乌梅、黄连、朱砂、野菊花等中药对JZ-202108菌株有明显抑制作用,乌梅和野菊花在菌株JZ-2...     

吉富罗非鱼感染无乳链球菌后肝脏组织在不同时期蛋白质组的表达差异

为研究罗非鱼感染无乳链球菌前后肝脏组织蛋白质的表达变化。本研究以吉富罗非鱼为材料,采用双向电泳技术分析其在无乳链球菌感染胁迫下24 h、48-144 h、12 d与对照组（未感染）肝脏组织蛋白质组的变化,对差异表达蛋白进行质谱分析鉴定。结果显示：吉富罗非鱼在无乳链球菌胁迫下,3个实验组的蛋白质图谱与对照组相比存在显著差异,共有30个蛋白点发生显著改变,其中13个表达上调,17个下调,2个下调蛋白点在感染12 d组消失。通过MALDI-TOF-MS MS/MS质谱分析和数据库检索对这些蛋白质进行了功能分类,发现它们涉及到能量代谢、细胞防御与应激、消化免疫、抗氧化与排毒等许多方面。推测这些蛋白可能在吉富罗非鱼对无乳链球菌胁迫的抗性反应中发挥了重要作用。研究结果为无乳链球菌疫苗的研制及吉富罗非鱼抗病品种选育奠定了基础。     

海南无乳链球菌的毒力基因与耐药特性分析

无乳链球菌可感染人与其他动物,是一种重要的致病菌。为探明海南地区无乳链球菌的毒力基因携带率及耐药情况,以2017年间实验室所采集鉴定的18株无乳链球菌(人源4株,鱼源14株)为样本,利用PCR技术和抗菌药物药敏纸片进行毒力基因、耐药基因的扩增和药物敏感性的检测,结果发现,常见毒力基因阳性检出率较高,其中有11种毒力基因均100%携带,另外3种基因阳性率也超过66.7%;耐药基因扩增结果显示,除四环素类和氨基糖苷类耐药基因均呈阴性以外,其余耐药基因阳性检出率较高(44.4%～100%);而药敏检测显示,无乳链球菌对β-内酰胺类、大环内酯类、林可胺类抗生素耐药性高,而对于氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类抗生素敏感性高。总体上,药敏情况和耐药基因的检测结果一致。研究结果发现,分离得到的不同来源的无乳链球菌中毒力基因检出频率高,耐药性强,需要引起高度重视,试验结果将为无乳链球菌的防治提供重要的参考。     

无乳链球菌感染尼罗罗非鱼的脑膜炎模型

目的：脑膜炎是罗非鱼无乳链球菌病的特征性临床症状,建立罗非鱼无乳链球菌脑膜炎模型,并制定相应的临床症状及组织病理学评分系统,对研究罗非鱼无乳链球菌病的致病机制具有十分重要的意义。方法：将健康罗非鱼43尾,随机分为4组：对照组(n=10)和试验组(n=33)。3组试验组根据不同感染剂量分为：10₆cfu组(n=11)、10₇cfu组(n=11)、10₈cfu组(n=11)。试验组分别将10₆、10₇、10₈CFU的无乳链球菌菌液腹腔注射罗非鱼复制脑膜炎模型。对感染罗非鱼的临床症状、剖检病变、脑组织(端脑、中脑、小脑、延脑)病理学进行判定,并结合细菌学检测,按照拟定的评分系统评价各组脑膜炎的造模效果,确定最佳造模方案。结果：各试验攻毒组罗非鱼感染后2天均出现不同程度死亡,未见明显神经症状。感染3天后鱼体开始出现异常活动的神经症状及突眼、角膜混浊等病理变化。病理组织学观察可见：蛛网膜下腔和脑软膜上有大量炎性渗出和染成蓝紫色微细颗粒的细菌团块,脑膜充血、水肿、疏松、增厚,有大量的中性白细胞等炎性细胞浸润;脑实质基质疏松水肿,呈海绵状;脑组织炎性细胞浸润,胶质细胞增生等软脑膜炎、脑膜脑炎症状。比较各组得分发现,10₇CFU组的无乳链球菌攻毒罗非鱼造模效果最好：临床症状显著而组内罗非鱼差异性最小,组织病理学观察患病罗非鱼病情和缓适中、利于观察研究。结论：使用10₇CFU无乳链球菌腹腔攻毒罗非鱼可在第3天成功构建脑膜炎模型,造模率为100%。     

几种水产常用抗生素对无乳链球菌的抑菌活性

为了筛选无乳链球菌敏感药物,对9种常用渔药抗生素进行了药物敏感试验,采用微量肉汤稀释法进行测定,通过加入阿尔玛蓝指示剂和革兰氏染色显微镜观察,得出各抗菌药物的最低抑菌浓度依次为:恩诺沙星0.3μg/mL,氟苯尼考0.3μg/mL,阿莫西林5.2μg/mL,诺氟沙星0.9μg/mL,强力霉素0.9μg/mL,庆大霉素13.0μg/mL,林可霉素17.6μg/mL,新霉素22.0μg/mL,磺胺嘧啶133.3μg/mL。结果表明,恩诺沙星和氟苯尼考对无乳链球菌最敏感,杀菌力最强;在试验过程中,阿尔玛蓝指示剂有助于抑菌结果的判断。     

鱼腥草对无乳链球菌引起吉富罗非鱼肝脏损伤的修复作用

为探讨池塘种植鱼腥草对无乳链球菌引起吉富罗非鱼肝脏损伤的修复作用,在养殖池塘中分别种植0%(对照组)、5%、10%和15%池塘面积的鱼腥草,养殖90 d后进行无乳链球菌人工感染,分别在感染后0、24、48和72 h采集吉富罗非鱼肝脏,进行肝脏生化、抗氧化性能、组织病理和热休克蛋白70基因(HSP 70)表达研究。结果显示,感染后48和72 h对照组肝脏谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性最高,种植鱼腥草各组吉富罗非鱼肝脏ALT活性在感染前后均无显著性变化,感染后72 h,10%组吉富罗非鱼肝脏AST活性已恢复到感染前水平。抗氧化指标显示,种植鱼腥草能减缓链球菌感染引起吉富罗非鱼肝脏总抗氧化能力(T-AOC)下降,显著提高肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)和一氧化氮合酶(NOS)等抗氧化酶的活性,增加自由基清除能力,减少脂质过氧化丙二醛(MDA)的产生。组织病理学观察显示,对照组吉富罗非鱼感染后48 h肝窦明显淤血,肝索排列紊乱,肝细胞脂肪变性,而各种植鱼腥草组吉富罗非鱼在感染后仅表现为肝细胞明显嗜酸,肝窦轻度扩张。定量PC...     

中国罗非鱼主养区无乳链球菌的分子流行特征及其传播方式

为分析2007—2015年中国罗非鱼主养区无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的分子特征和流行情况,分离并收集了248株罗非鱼源无乳链球菌。通过分子血清型、MLST、毒力基因和前噬菌体等分型方法对248株无乳链球菌进行了分子遗传特征分析。结果表明,229株无乳链球菌(92.3%)的分子血清型是Ⅰa型,其余19株均是Ⅰb型(7.7%)。MLST分析结果表明,所有Ⅰa型无乳链球菌都是ST7型,所有Ⅰb型无乳链球菌都是ST261型。毒力基因检测结果发现,229株Ⅰa-ST7型无乳链球菌的毒力基因型相同,即V1型;19株Ⅰb-ST261型无乳链球菌的毒力基因型相同,即V2型。前噬菌体检测结果表明,Ⅰa-ST7型无乳链球菌可分为两种前噬菌体基因型,分别是P1型(36株)和P2型(193株);Ⅰb-ST261型无乳链球菌的10个前噬菌体基因都是阴性,即P3型。根据以上4种分子分型方法可将248株无乳链球菌分为3种基因型,即Ⅰa-ST7-V1-P1型、Ⅰa-ST7-V1-P2型和Ⅰb-ST261-V2-P3型。2010—2011年主要流行菌株由Ⅰa-ST7-V1-P1型转变为Ⅰa-ST7-V1-P2型,其中Ⅰa-ST7-V1-P1型是2011年之前的主要流行菌株,Ⅰa-ST7-V1-P2型在2011年及之后成为主要流行菌株。研究表明,近年来我国罗非鱼源无乳链球菌发生了明显的遗传变异,同时,根据我国罗非鱼主养区无乳链球菌的流行特点,推测我国罗非鱼源无乳链球菌是通过苗种或水体等介质进行传播的,属于输入性传播方式。     

广西罗非鱼链球菌病流行菌株PCR鉴定和PFGE基因型分析

为获知近年广西罗非鱼链球菌病流行菌种及其基因型变化信息,采用特异PCR方法对2006-2012年从广西发病罗非鱼分离获得的77株临床菌株进行鉴定,并通过脉冲电场凝胶电泳(PFGE)对2006-2011年分离获得的37株流行菌株进行基因型分析.结果显示,其中20株鉴定为海豚链球菌其余57株鉴定为无乳链球菌.2006-2007年获得的19株流行菌株中有18株为海豚链球菌(94.7％),仅1株无乳链球菌;2009-2012年分离的58株流行菌株中56株为无乳链球菌(96.6％),仅2株海豚链球菌.PFGE图谱聚类显示,海豚和无乳链球菌分别聚类为两个大分支,20株海豚链球菌共产生4种PFGE带型,带型相似度为83.9％～100％;17株无乳链球菌共产生5种PFGE带型,带型相似度为47.4％～100％.研究表明,广西罗非鱼链球菌病流行菌种已从过去(2008年前)以海豚链球菌为主转变为现在(2009-2012年)以无乳链球菌为主;流行菌株PFGE基因型存在多样性.     

尼罗罗非鱼无乳链球菌荚膜多糖合成基因的表达及其与荚膜唾液酸含量、菌株致病性的关系

为了解尼罗罗非鱼无乳链球菌(GBS)荚膜多糖合成基因的表达及其与荚膜唾液酸含量、菌株致病性的关系,本实验克隆了尼罗罗非鱼荚膜多糖合成基因cps E、cps K和neu A,通过q RT-PCR方法分析了这3个基因在不同培养温度下表达水平的变化,同时通过比色法测定了不同培养温度下GBS荚膜唾液酸含量的变化,通过人工感染实验分析了不同水温条件下GBS对罗非鱼的致病性。结果显示,cps E、cps K和neu A编码的氨基酸序列均具有保守的与荚膜多糖合成相关的酶活性位点,Cps E、Neu A与已知鱼源GBS(Ia和Ib型)和人源GBS(Ia、Ib和II~IX型)相应序列的同源性均达到97%以上,而Cps K与鱼源、人源的序列同源性则分别为56%~100%和27%~100%。在不同培养温度下GBS cps K和neu A基因表达水平的变化与荚膜唾液酸含量的变化一致;在较高温度(28和34°C)下培养的GBS荚膜唾液酸含量及菌株攻毒后罗非鱼的死亡率均随温度的升高而递增,而在22°C下培养的GBS唾液酸含量最高,攻毒后罗非鱼的死亡率却最低。本研究结果表明,GBS Cps K和Neu A在GBS荚膜多糖的唾液酸化中起重要作用,较低温度下GBS荚膜唾液酸的高含量有助于其在宿主体内的潜伏,而较高水温条件下细菌的强致病性可能还与除荚膜唾液酸外的某些重要的毒力因子的表达有关。     

罗非鱼源无乳链球菌的间接ELISA快速检测方法

以罗非鱼源无乳链球菌为抗原,免疫新西兰兔获得高效价的多克隆抗体;以此多克隆抗体作为一抗,羊抗兔Ig G-HRP作为酶标二抗,建立无乳链球菌的间接ELISA快速检测法。采用棋盘滴定法确定抗原与一抗的最佳工作浓度分别为106 CFU/m L和1∶10 000;酶标二抗的最适工作浓度为1∶1000。病原菌检测灵敏度为每孔103 CFU。该方法标准化后具有快速、灵敏等特性,与海豚链球菌等其他常见水产病原菌无交叉反应;阻断实验中的阻断率达72.02%;交叉反应和阻断实验的结果显示该方法具有较高的特异性。将该方法标准化后检测了44株2007—2013年分离的罗非鱼无乳链球菌,阳性检测率为100%;对人工感染后死亡的30尾罗非鱼的脑组织进行检测,阳性检测率为100%;对人工感染后未死亡的20尾罗非鱼的脑,肝和脾组织进行检测,脑的阳性检测率为0%,肝的阳性检测率为25%,脾的阳性检测率为50%;表明该技术不仅能够检测已发病的罗非鱼,而且能够检测无症状的带菌罗非鱼,该方法的建立有助于快速准确地诊断由无乳链球菌引起的罗非鱼链球菌病。     

高温应激下无乳链球菌感染对尼罗罗非鱼血清生化指标和组织病理的影响

为探究高水温对尼罗罗非鱼无乳链球菌病暴发的影响,以体质量为(62.0±3.33)g的尼罗罗非鱼为研究对象,设置生长最适宜组(29°C)和高温应激组(33°C)2个处理水平,暂养7 d后分别进行人工感染实验统计累计死亡率,并于攻毒后0、12、24、48、96和120 h采集血液和组织样本,开展高温应激下无乳链球菌感染对尼罗罗非鱼血清生化指标和组织病理影响的研究。结果显示,水温33°C高温应激组尼罗罗非鱼累计死亡率显著高于29°C组;谷丙转氨酶(ALT)活性在感染96 h之后33°C组的值显著高于29°C组;谷草转氨酶(AST)活性在感染48 h之后33°C组的值显著高于29°C组;钾(K+)和钠(Na+)含量感染120 h时29°C组的值和攻毒前都没有显著性差异,而33°C组分别显著高于和低于攻毒前;肌酐(CREA)含量在感染12 h以后33°C组的值都显著高于29°C组;白蛋白/球蛋白(A/G)的值在120 h时33°C组的值显著低于29°C组;血清碱性磷酸酶(AKP)活性29°C组随时间延长而升高,33°C组则先升高后降低,但33°C组的达峰时间更短;超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化趋势都是先升高后降低再升高;组织病理学观察显示高温应激使肝细胞排列紊乱,索状结构不清,脾脏和肾脏轻微充血;感染12 h后脾脏均严重充血,感染24 h后脾脏结构均被破坏,呈淀粉样变性,坏死;感染48 h后肾小球均发生萎缩,肾小管上皮细胞变性、坏死;33°C组鱼的肝脏感染96 h后严重脂肪变性和细胞内玻璃样变性,而29°C组鱼的肝脏在感染120 h后才发生相似的病理变化。研究表明高温应激抑制了鱼体免疫系统,降低了尼罗罗非鱼对无乳链球菌的抵抗力,脾脏对无乳链球菌感染响应最快,高温应激使病原菌感染对肝脏损伤更为迅速,感染后期受损更严重。     

BALB/c小鼠用于评价尼罗罗非鱼无乳链球菌毒力的研究

实验采用BALB/c小鼠作为实验动物,旨在建立尼罗罗非鱼无乳链球菌毒力测定的BALB/c小鼠模型。BALB/c小鼠经腹腔注射尼罗罗非鱼源无乳链球菌建立感染模型,比较了尼罗罗非鱼源无乳链球菌分别感染尼罗罗非鱼和小鼠的LD_(50)差异,分别测定了不同毒力尼罗罗非鱼无乳链球菌对尼罗罗非鱼和小鼠的毒力。结果显示,小鼠经腹腔注射无乳链球菌,在24 h内出现死亡现象,且对小鼠脑、肝脏、脾脏、肾脏等组织造成损伤。3次测定尼罗罗非鱼无乳链球菌TFJ0901对尼罗罗非鱼和小鼠LD_(50)分别为7.7×10~7、2.2×10~8、3.5×10~9 CFU/mL和405、361、419 CFU/只。将无乳链球菌TFJ0901和THN0901感染尼罗罗非鱼(1.0×10~7 CFU/mL)和小鼠(100 CFU/只),尼罗罗非鱼和小鼠存活率分别为100%、6.7%±5.8%和100%、0,其存活率都具有显著性差异。将无乳链球菌TFJ0901和TFJ-F感染尼罗罗非鱼(3.0×10~8 CFU/mL)和小鼠(2 500 CFU/只),尼罗罗非鱼的存活率分别为73.3%±11.5%和80.0%±10.0%,存活率差异不显著,小鼠存活率分别为13.3%±11.5%和100.0%,存活率具有显著性差异。研究表明,本实验成功建立了BALB/c小鼠作为尼罗罗非鱼源无乳链球菌毒力测定的稳定模型,测定不同毒力的尼罗罗非鱼源无乳链球菌对小鼠毒力与对尼罗罗非鱼毒力一致,且该模型能够区分尼罗罗非鱼模型难以区分的毒力相近的无乳链球菌。     

温度对尼罗罗非鱼无乳链球菌毒力的影响

为了解温度对鱼源无乳链球菌毒力的影响机制,本实验研究了温度对无乳链球菌毒力相关参数(生长、粘附、入侵、毒力基因表达以及对罗非鱼致死率)的影响。结果发现,不同培养温度下(25~40 ℃)无乳链球菌的生长速度不同,37 ℃为其最适生长温度,25 ℃时生长速度最慢;25~34 ℃内无乳链球菌粘附在惰性基质上的菌体对应的吸光值(OD_590nm)之间无显著差异(P>0.05),37 ℃时显著增加,40 ℃时又急剧下降;罗非鱼在人工感染无乳链球菌后各时间点(6、12、24和48 h),鱼体脑组织中菌量随注射菌体培养温度的增加呈先上升后下降的趋势,且与不同培养温度下的无乳链球菌对罗非鱼的致死率呈正相关;无乳链球菌毒力基因的表达也与培养温度相关,hly和cfb基因的表达量随菌体培养温度的升高先增加后降低,分别在34和37 ℃处达到峰值,不同培养温度下无乳链球菌sip基因表达的变化幅度较小,而scpB基因的表达则随培养温度增加而下降;无乳链球菌对罗非鱼的致死率随其培养温度的升高呈先升高后降低趋势,低温(25和28 ℃)培养条件下的菌体对罗非鱼致死率较低(<20%),37 ℃时致死率最高66.67%±6.67%。以上结果表明温度参与无乳链球菌生长、粘附、转移、入侵和部分毒力基因表达的调控,它们共同影响无乳链球菌对罗非鱼的毒力。     

尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体口服疫苗的研制及其免疫效果

链球菌病是威胁我国罗非鱼养殖产业健康发展的重要病害之一。为研制出免疫效果好、操作简便的罗非鱼链球菌病疫苗,本研究构建重组表达无乳链球菌Sip蛋白的穿梭质粒pNZ8124-Sip,通过酶切和测序验证后电转化乳酸乳球菌NZ9000,获得能够诱导重组表达无乳链球菌Sip蛋白的乳酸菌活菌载体疫苗。采用SPS-PAGE电泳摸索最佳诱导浓度和诱导时间以获得最大表达量,通过镍柱纯化目的蛋白并进行Western blot检测;利用不同浓度的重组乳酸菌活载体疫苗灌胃口服免疫尼罗罗非鱼,采用间接ELISA法测定免疫后血清抗体水平变化,通过人工腹腔注射感染无乳链球菌获得相对免疫保护率。研究结果显示,构建的重组乳酸乳球菌可通过nisin诱导表达大小为48 ku特异性蛋白,与目的蛋白大小一致;PAGE电泳显示,重组蛋白主要以可溶蛋白和包涵体2种形式存在,其中胞内可溶性蛋白浓度达7.65 mg/mL;诱导表达的最佳条件为100 ng/mL nisin诱导6 h;Western blot检测结果显示,诱导蛋白可与鼠抗His标签抗体特异性结合。口服免疫结果显示,中浓度组(2.24×10~(10) CFU/mL)和低浓度组(2.24×10~9 CFU/mL)免疫2次能够显著提高尼罗罗非鱼的血清抗体水平和抗无乳链球菌感染能力,中浓度免疫组的相对免疫保护率最高为41.0%。本研究可为罗非鱼链球菌病口服疫苗的研究奠定基础,具有广阔的应用前景。