转基因大豆插入位点分析及特异性PCR检测方法的建立

采用TAIL-PCR方法研究转基因大豆外源基因LEC1插入位点序列特征,并根据此特征建立了LEC1转化事件特异性检测方法。依据正义表达载体上T-DNA区段侧翼序列设计特异性引物和简并引物,获得4个同源序列。对获得的序列进行Blastn分析发现,p69、p148、p225均为载体T-DNA区段一部分,未见大豆基因组序列;P217插入片段的序列分析表明,该序列长863 bp,其中T-DNA左边界序列长143 bp,720 bp为大豆基因组片段,与大豆光系统II类囊体膜蛋白(Thylakoid membrane proteins)的206-926区段同源性为99%,这表明,外源DNA插入了大豆基因组中类囊体膜蛋白编码区的206位。根据分离的序列建立事件特异性定性检测方法,扩增片段大小为277 bp。该事件特异性检测方法具有高度的特异性和良好的灵敏性,为转基因大豆品种LEC1的身份识别提供了有效的方法。     

臂形草内生菌特异DNA片段的克隆及其分子鉴定

进行了臂形草内生菌特异DNA片段的克隆及分子鉴定方法的研究。从5个臂形草品种分离的5个内生菌纯培养特中，提取基因组DNA，通过140条随机引物的RAPD分析，引物OPAK10扩增出1条约500bp的共有PCR谱带。此DNA片段命名为BE1。对BE1进行分离、纯化，经点杂交证实BE1为臂形草内生菌特异DNA片段。进一步将BE1片段进行回收、克隆和DNA序列分析。BE1在基因库中进行序列分析，未发现相关同源片段。臂形草内生菌特异DNA片段的获得，为建立一种准确、快速检测臂形草内生菌及特异内生菌方法奠定了分子生物学基础。     

青稞新光合作用相关基因的克隆和序列分析

根据鉴定得到的青稞4个光合作用相关基因的序列设计引物,从青稞叶片的c DNA中扩增得到目的片段,并对目的基因序列进行测序鉴定和序列分析。结果成功扩增出4个基因的序列,大小分别为513、822、1023和579 bp。生物信息学分析表明,02833基因可能编码一个核糖-5-磷酸异构酶3;03360基因可能编码一个273个氨基酸的核酮糖-磷酸-3-异构酶,该蛋白属于ICL_KPHMT superfamily之一,推测其CDS全长为822 bp;45441基因可能编码一个340个氨基酸的苹果酸脱氢酶,该蛋白属于Ldh_1_C superfamily之一,推测其CDS全长为1 023 bp;45453基因可能编码一个果糖-1,6-二磷酸激酶。这些基因的克隆为研究青稞的光合机制奠定了基础。     

栽培大豆端粒相关序列的克隆及定位

以拟南芥的端粒重复序列(TR)为引物(TTTAGGG)3,在栽培大豆中扩增并克隆了1个574 bp的DNA片段.序列分析表明:该片段与大豆端粒相关序列的相似度高达92%～99%,与白玉草TR-TAS的间隔区的相似度为79%,与大麦和玉米等其它植物的TAS的相似度在16%～35%之间;这一片段含有14个拷贝的拟南芥类型端粒重复单元,并且还有30个重复单元发生了碱基突变(缺失、替换与插入).该端粒相关序列具有1个25 bp的保守重复单元,串联重复13个拷贝,且该序列的A+T含量高于60%,体现了卫星DNA的特征.该序列被定位在大豆3号染色体的近末端.     

甜菜Actin基因片段的克隆及序列分析

根据其它植物Actin基因设计一对简并性引物,以甜菜根总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出Actin基因片段并克隆到pUCm-T载体上,阳性克隆经PCR鉴定测序。序列分析表明,克隆得到Actin基因家族的两个成员,其片段长度均为598 bp,编码198个氨基酸,它们间的同源性为87%。将其分别命名为BvACT1和BvACT2,已在GenBank中注册,登录号为KF214784和KF214785。多重序列比较表明,Bv A CT1氨基酸序列与其他植物Actin基因的同源性在92%以上,而Bv A CT2则在93%以上。     

大豆种子Em基因(LEA 1)启动子的克隆与序列分析

根据已公布的大豆种子Em基因(LEA1)的5'末端序列设计二个基因特异反向引物(EmS1,EmS2).以大豆基因组DNA为模版,利用染色体步行(Chromosome Walking)法,获得了Em基因起始密码子上游836bp的特异DNA片段.进行序列测定和生物信息学分析.结果表明,这段DNA序列为一尚未在基因数据库登录的DNA片段.该序列含有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box,因此可能具有启动子活性.含有1个DRE1和2个ABRE,该启动子可能受到ABA和干旱等条件的诱导.含有1个AG-motif和1个ELRE-motif,该启动子可能参与创伤和诱导子等胁迫因素的应答.含有2个RY-repeat和1个TGTCACA-Motif,该启动子片段可能具有种子特异性.结果表明,所克隆到的片段可能为基因Em的诱导型启动子,并且很可能是种子特异性启动子.     

应用PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌

根据马铃薯环腐病菌16SrDNA基因片段核苷酸序列设计引物(引物1∶5-′TGTACTCGGCCAT-GACGTTGG-3′和引物2∶5-′TACTGGGTCATGTTGGT-3)′,进行马铃薯环腐病菌PCR特异性扩增试验。合成的引物能从马铃薯环腐病菌总基因组DNA和细菌纯培养,以及人工接种和自然发病的马铃薯块茎中特异性扩增环腐病菌16SrDNA基因片段1046bp。该试验结果为马铃薯环腐病的鉴定、检测及病害流行学研究提供了新的技术和方法。     

茶毛虫NPV的P24、Rr1、Lef1基因及其分子进化分析

克隆和测定了茶毛虫核型多角体病毒(EupsNPV)全长5942bp的EcoRI-XhoI基因组DNA片段。序列分析表明该片段包含5个完整的开放阅读框(ORF),分别编码P24、Rr1、38.7K、Lef1和Ep-ld124。通过对上述5个基因与其它已知杆状病毒的同源基因的分析比较,以及对P24、Rr1和Lef1的分子进化树分析,表明EupsNPV是一种与已知杆状病毒都有较大差异的病毒种类,属于NPVII组病毒。结果还表明EupsNPV与茶尺蠖(Ectropisobliqua)核多角体病毒(EcobSNPV)的亲缘关系最为接近。本文报道的序列的EMBL登录号为AJ920288。     

光叶花生两个重要基因片段的克隆和序列测定

从不亲和野生花生Arachis glabrata Benth中提取DNA，在多重序列比对的基础上设计PCR引物，成功扩增出约350、750bp的两个片段，与DES和RS基因片段预期分子量相符。PCR产物与T栽体连接，转化受体菌XL1-Blue，获得了白色菌落，挑取白色菌落在液体培养基中过夜培养，经TTE溶液和热处理后进行PCR扩增，获得了载有目的基因片段的阳性重组子，测序和序列比对分子的结果说明，DES和RS基因片段克隆成功。这是首次从不亲和野生花生A.glabrata Benth中克隆出的基因片段，该片段可用作探针克隆相关基因全编码区。     

胶孢炭疽病菌环境pH应答转录调控因子基因的克隆与分析

参照油梨炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)的环境pH应答转录因子基因Pacl设计l对特异性引物,以芒果炭疽病菌(C.gloeosporioides)基因组DNA为模板,扩增获得大小为2 625 bp的目的基因片段.序列分析结果表明,目的片断包含完整的阅读框,与油梨炭疽病菌C.gloeosporioides pac1基因相应片段长度相同,二者碱基序列同源性达97%.用RT-PCR技术获得pacl基因cDNA片段,证实目的基因片段中存在3个大小分别为59,50,71 bp的内含子.拼接的全长cDNA长1 755 bp,推测编码的氨基酸序列长584个氨基酸残基,与推测的油梨炭疽病菌pacl基因所编码的蛋白质同样大小,二者氨基酸序列相似性达99%,只有1个氨基酸的差异,可以肯定克隆的目的片段为C.gloeosporioides pac1基因,为进一步研究C.gloeosporioides侵染芒果时的pH调控奠定了基础.     

转基因甘蔗BtG-2的T-DNA侧翼序列分析及其转化事件特异性检测

转基因甘蔗BtG-2是利用农杆菌介导法把Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因导入‘新台糖22号’的转基因甘蔗株系,具有良好的抗虫特性和农艺性状。为了明确转基因甘蔗BtG-2的分子特征及其检测方法,推进其生物安全性评价工作,以BtG-2的T2代为研究材料,利用Southern杂交检测外源基因在转基因甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立了该转化体高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明：Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BtG-2株系;经过3次的热不对称巢式PCR扩增,获得外源基因T-DNA左边侧翼序列984 bp和右边侧翼序列705 bp;以这2个序列和相应的T-DNA的左右端序列分别设计3对检测引物对,建立了BtG-2株系的转化事件特异性PCR检测方法,扩增效率最高的引物对LS011/LA451和RS160/RA588分别扩增到440 bp和428 bp的特异片段。其中T-DNA左侧设计的LS011/LA451检测引物对扩增的灵敏度高、特异性强,能够在甘蔗BtG-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因目的成分,相当于9个单倍体基因组拷贝数。本研究完成了转基因株系BtG-2的分子特征及其转化事件特异性检测,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。     

甘蓝型油菜KCS13基因克隆与组织表达特异性分析

通过巢式PCR和基因组步移方法,从油菜的基因组中获得一段长度为3 356bp的序列。分析显示,该序列包含了KCS13基因的编码序列和启动子,命名为甘蓝型油菜KCS13基因,其转录区全长为1 587bp,编码区长1 389bp,无内含子,编码一条长462个氨基酸的多肽链。在甘蓝型油菜A、C基因组中都有KCS13基因存在。该基因主要在花蕾中表达,茎、叶和种子中表达稍弱,根中未检测到该基因表达。     

甘蓝型油菜BAN同源基因片段克隆与序列分析

参照拟南芥（Arabidopsis thaliana)BAN基因和cDNA的保守序列设计引物，对甘蓝型、白菜型、芥菜型油菜和拟南芥及其它十字花科栽培品种的基因组总DNA进行PCR扩增，均获得与拟南芥BAN基因扩增片段大小极其相似的PCR扩增产物，表明BAN基因可能广泛存在于十字花科植物中。甘蓝型油菜和拟南芥BAN扩增片段测序比较分析显示，拟南芥BAN片段（779bp)与已往的报道完全相同，甘蓝型油菜的BAN片段（780bp)与拟南芥BAN外显子的同源性为90％，但与内含子的同源性仅为74％。甘蓝型油菜BAN氨基酸序列与80多种植物的NADPH还原酶类有不同程度的同源性。     

马铃薯S病毒的RT-PCR检测

根据马铃薯S病毒(PVS)的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物。以感染PVS的马铃薯组织和健康的组织为材料,对提取植物总RNA的两种方法进行了比较,并对总RNA的提取方法进行改进,获得了纯度较高,完整性较好的总RNA。以此为模板,进行cDNA合成及PCR扩增,从感病组织扩增得到一段长度约642bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致,而健康组织无此扩增产物。从而建立了检测PVS快速灵敏简便的新方法,在基因水平上为PVS的检测提供了新手段。     

小麦和玉米籽粒赤霉菌产毒类型的PCR检测

为了建立一种准确、快速鉴定赤霉菌毒素的方法,根据赤霉菌毒素生物合成调控路径T ri5-T ri6基因保守序列,设计了一对通用引物,用于检测和鉴别产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和雪腐镰刀菌烯醇(N IV)毒素的赤霉菌特异DNA片断。结果表明,产生毒素DON的赤霉菌具有一个300 bp的特异DNA片断,而产生毒素N IV的则为360 bp。PCR检测与HPLC或GC/M S化学分析结果完全一致。利用这一方法分析检测了小麦、玉米籽粒中赤霉菌产毒类型,发现除健康籽粒外,在所有轻微、中度、严重感染赤霉病的小麦或玉米籽粒中,均同时检测到DON及N IV的两种DNA片断,表明这一对通用引物对两种毒素特异DNA片断的扩增效率相同。这些结果说明,该技术是一种经济、快速、可靠的PCR检测技术,可广泛用于赤霉菌及其毒素检测鉴定中。     

基于SSR标记的橡胶树无性系鉴定方法的建立

从88对橡胶树SSR引物中筛选出5对产物清晰、扩增稳定的引物.采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合快速银染检测的方法,构建了87份橡胶树的DNA指纹图谱.5对引物共扩增出16条带,平均每对引物可扩增出3.2条带,多态性条带为15条,扩增条带分布在148～342 bp,无性系之间只存在1～2个片段差异,说明遗传差异小;根据建立的无性系数字指纹图谱,能逐一区分65个无性系,表明应用SSR分子标记技术进行橡胶树无性系的鉴定是可行的.     

水稻精细胞优势表达基因RSG6启动子的克隆及表达

利用已知的[i]RSG6[/i]基因序列和GenBank中提供的[i]RSG6[/i]前导序列设计引物,通过基因组DNA的PCR扩增得到长度为1 408 bp和1 173 bp的两个[i]RSG6[/i]启动子片段PB、PS,测定序列分析发现,PB、PS分别位于水稻第10和第4染色体上,PB、PS序列之间具有较高的同源性,且都含有大量的启动子元件。通过设计带有酶切位点的引物扩增出PB和PS的各两条缺失片段PB1、PB2、PS1、PS2,与质粒pBI221连接后得到中间载体pBI221 PB1、pBI221 PB2、pBI221 PS1、pBI221 PS2,再与质粒pBIN19连接构建出双元表达载体pBIN GUSB1、pBIN GUSB2、pBIN GUSS1、pBIN GUSS2,转化农杆菌EHA105,感染烟草叶片和烟草花粉,瞬时表达显示缺失片段PB1、PB2、PS1、PS2均具有启动子功能,且PB1、PS1的启动效率较PB2、PS2高。     

重叠延伸PCR克隆拟南芥ACCase基因和植物表达载体构建

植物的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酸单酰辅酶A,是脂肪酸合成的第一步,该步骤是种子脂肪酸合成与含油量形成的关键调控步骤。拟南芥中的真核形式ACCase基因cDNA长约7,000bp,难以直接克隆。本研究先通过常规PCR将其cDNA分成八个重叠的片段分别扩增出来,再用重叠延伸PCR将得到的片段逐步拼接成长度为6890bp的完整的基因序列,测序证实克隆序列正确无误,最后将其克隆到农杆菌转化植物的载体上。序列分析发现ACCase基因的开放阅读框长度为6765bp,编码一个含2254个氨基酸残基的多肽链,推测其分子量约为250KDa。ACCase基因的成功克隆为利用该基因调控油料作物的含油量奠定了良好基础,同时为克隆长度较大的基因提供了一种经济可行的方法。     

一种新的水稻香味基因功能标记的开发与应用

香味是影响稻米品质的一个重要性状,Badh2基因突变是水稻产生香味的主要原因,水稻香味产生主要有Badh2基因第2、4、5、7、8外显子突变类型,其中研究最多的是第7外显子突变类型.为了提高水稻香味性状检测的准确性、安全性和效率,本研究根据水稻Badh2基因突变(第7外显子8 bp缺失、3 bp突变)的序列设计开发了3...