一株类禽H1N1亚型猪流感病毒的进化研究

为了解猪流感病毒(SIV)的变异情况,2013年1月份从山西某养殖场采集呈流感症状的猪鼻拭子10份,采用常规方法接种10日龄SPF鸡胚,进行RT-PCR鉴定及全基因序列分析。结果表明:分离到1株类禽H1N1亚型猪流感病毒,命名为A/swine/Shanxi/02/2013(H1N1);全基因序列测定及同源性分析发现,8个基因片段均与2011年江苏地区流行的类禽型H1N1亚型猪流感病毒有较高的同源性;系统遗传演化发现,该病毒株是由2011年类禽型H1N1流感病毒A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)进化而来的;HA1氨基酸位点差异分析发现,该病毒株与2009年人群中流行的甲型H1N1流感和经典H1N1毒株抗原性差异较大,其HA裂解位点基序为PSIQSRGLF,呈低致病性特征。     

1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

【目的】了解广东地区猪流感病毒(Swine influenza virus, SIV)的流行情况并探究其分子生物学特征。【方法】采集广东某猪场疑似猪流感病毒感染猪的鼻拭子和肺脏组织样品进行病毒分离鉴定、遗传进化和关键氨基酸位点分析。【结果】样品经实时荧光定量RT-PCR检测为猪流感病毒核酸阳性;在红细胞凝集试验中,该病毒对鸡红细胞有凝集作用,血凝效价为1∶128;8个基因片段序列结果经BLAST比对和进化树分析显示,HA、NA基因属于欧亚类禽猪流感病毒(H1N1)分支,PA、PB1、PB2、NP和M基因属pdm/09分支,NS基因属于北美三源重组分支,因此,本试验分离株属于G4基因型欧亚类禽猪流感病毒,将其命名为A/swine/Guangdong/CJM2/2022(H1N1)。关键氨基酸位点分析显示,分离株HA蛋白裂解位点序列为PSIQSR/GL,具有典型低致病性流感病毒的分子特征。HA基因在受体结合位点处的190、225、226位氨基酸分别为D、E、Q,表明其既具有结合人型唾液酸受体的潜能又具有结合禽型唾液酸受体的潜能。NA基因关键氨基酸残基均未发生突变,提示分离株对奥司他韦和扎那...     

一株类禽型H1N1猪流感病毒的进化分析与分子特征

2017年12月,上海市一养殖场饲养的猪出现咳嗽、呼吸困难、发热及迅速转归等病症。将猪鼻拭子接种鸡胚进行病毒分离,对血凝试验阳性样品在SPF鸡胚上进一步纯化、增殖,分离到1株猪流感病毒(A/swine/Shanghai/1205/2017)。采用RT-PCR对分离毒株进行全基因组扩增测序,利用DNAstar软件,对测序基因片段进行整个阅读框的核苷酸序列同源性比对分析,并用MEGA6绘制遗传进化树并分析氨基酸位点。结果显示:分离毒株为H1N1亚型,其8个基因片段均属于类禽型H1N1进化分支,没有出现不同基因型流感病毒片段之间的重组;分离株HA蛋白的裂解位点序列为PSIQSR↓G,具有典型低致病性流感病毒的分子特征。本毒株的分离鉴定为分析我国大陆地区的猪流感流行状况和分子特征提供了参考。     

广东省猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

为了解广东地区猪流感病毒(SIV)的流行和变异情况,本研究于2013年10月至2014年1月从广东省4个不同地区采集猪鼻拭子和肺脏病料共203份,对样品处理之后进行鸡胚分离和RT-PCR检测,从中分离得到5株SIV,对其进行病毒纯化、全基因组测序和遗传进化分析。结果表明,5株SIV分离毒株其中3株为H1N1亚型,2株为H1N2。分离毒株HA裂解位点位于PSIQSR↓GL,具有典型的低致病性流感病毒特征。HA基因序列比对结果显示,5株SIV分离毒株与A/Jiangsu/ALS1/2011(H1N1)株同源性最高,核苷酸相似性为97%~99%。遗传进化分析结果显示,5株分离毒株的PB2、PB1、PA和NP基因片段属于PDM/09分支,M基因片段以及外部基因片段HA属于欧亚类禽分支,NS基因片段属于北美三元重组分支,3株H1N1亚型的NA基因属于欧亚类禽分支,2株H1N2亚型的NA基因属于人季节性流感分支。抗原位点分析结果表明,分离毒株的抗原位点基本保守,但YJ28分离株HA1蛋白上发现3个氨基酸突变,分别是L69S、S137P、E222G。本研究通过对广东省不同地区分离到的SIV进行鉴定分析,掌握SIV的变异趋势,为猪流感的防控提供切实有效的理论依据。     

宁夏地区H1N1亚型猪流感病毒基因组遗传进化分析

对宁夏地区2011年分离到的5株H1N1亚型猪流感病毒进行了基因组测定和遗传进化分析。结果显示:宁夏地区H1N1亚型猪流感病毒具有多样性,5株分离株可分为3类,其中1株为类人H1N1猪流感病毒,2株为经典猪流感病毒,另外2株为重组猪流感病毒,其PB2、PB1、PA、NP、NS基因来源于北美三元重组猪流感病毒,HA、NA、M基因来源于经典猪流感病毒;HA蛋白裂解位点附近氨基酸分析显示5株H1N1亚型猪流感分离株均为低致病性毒株;序列分析结果显示5株病毒在HA蛋白受体结合位点、抗原位点,以及NA蛋白潜在糖基化位点处氨基酸存在差异,这些差异具有分支特异性。5株病毒在NA和M2蛋白上均未出现与神经氨酸酶抑制剂和金刚烷胺耐药性相关的氨基酸变异,但其中3株病毒的PB2蛋白基因具有哺乳动物适应性变异E627K。     

14株H3亚型禽流感病毒全基因组序列分析

为了解2016年至2017年在我国部分省市活禽市场的家禽体内分离得到的14株H3亚型禽流感病毒的流行情况和遗传特点。采用RT-PCR技术对这14株H3亚型禽流感毒株的全基因进行扩增,并对所得序列进行遗传演化分析。14株分离株中有5株H3N8,7株H3N2,2株H3N3。结果表明,14株毒株中AIV的HA蛋白的裂解位点氨基酸序列均为PE-KQTR↓GLF,只有1个碱性氨基酸,符合低致病性禽流感的分子特征。HA基因的受体结合位点为226(Q)、228(G)具有典型的禽源特征。遗传进化分析表明,除了毒株A/Duck/Fujian/F1142/2016(H3N8)的NS基因属于北美分支外,其余毒株全部基因均属于欧亚分支。通过对H3亚型AIV的遗传进化关系和流行情况进行分析,以期对H3亚型AIV的进化研究提供一些参考依据。     

猪流感病毒H1N1广东分离株HA基因的克隆与进化分析

采用常规的血清学试验和特异性RT-PCR,从广东不同地区猪场分离鉴定出8株H1N1亚型猪流感病毒(SIV)。用流感病毒血凝素(HA)基因通用引物扩增了8株病毒的血凝素(HA)基因,经克隆测序,HA基因全长1 757 bp,编码566个氨基酸。8个毒株的HA基因推导氨基酸序列分析表明,均含有8个潜在的N糖基化位点,且糖基化位点相同,其HA1、HA2之间切割位点序列为IPSIQSR↓G,从分子水平推论,此8株H1N1 SIV均属于非高致病性毒株。同源性分析表明,此8株病毒的氨基酸序列与经典SIV之间的同源性在92.3%~94.7%之间;与2009年甲型H1N1流感病毒同源性在80.4%~92.4%之间;与欧洲类禽SIV分离株同源性在80.4%~84.1%之间。进化关系表明,该8株SIV与A-swine-Shanghai-3-2005-H1N1同处一分支,与2009年甲型H1N1流感病毒和经典SIV分离株亲缘关系较近,与欧洲类禽SIV分离株亲缘关系较远。     

一株H1N1亚型猪流感病毒的遗传演化分析及在雪貂体内复制和飞沫传播能力评估

本实验室于2016年在天津分离到一株猪流感病毒(SIV),命名为A/swine/Tianjin/312/2016(H1N1)(简称为TJ312株)。为了解该株病毒的生物学特性及遗传演化特征,本研究对经PCR分段扩增该病毒全基因组并测序,采用SeqMan软件拼接成全基因组序列经BLAST比对,得到与该SIV各基因节段序列同源性最高的病毒株,采用mafft分析其各基因节段编码氨基酸序列的分子特征,利用MEGA5.1软件分别构建该病毒8个基因节段的进化树。结果显示,SIV TJ312株各基因节段与2016年分离自天津的H1N1 SIV相应各基因节段的同源性在99%～100%。进化树结果显示该病毒株HA、NA和M基因均来自欧亚类禽H1N1 (EA H1N1) SIV谱系;PB2、PB1、PA和NP基因来自2009/H1N1流感病毒谱系;NS基因来自北美三重配H1N2 SIV谱系。蛋白分子特征分析结果显示,HA蛋白碱性氨基酸裂解位点序列为PSIQSR↓G,符合低致病性流感病毒分子特征;受体结合位点符合人源唾液酸受体(α-2,6唾液酸受体)的分子特性;NA蛋白aa275为H、aa295为N,且该蛋...     

南京市首例甲型H1N1(2009)流感病毒分离及其血凝素基因遗传变异分析

对南京市首例甲型H1N1(2009)病毒进行细胞分离,获得一株具有较高血凝活性的病毒,命名为A/Nanjing/1/2009。在全基因组测序的基础上,对分离株的血凝素基因(haemagglutinin,HA)的遗传特征进行了详细研究。分离株HA蛋白不具有多碱基HA裂解位点,具有低致病性流感病毒特点。与参考株A/California/04/2009相比,分离株A/Nanjing/1/2009HA蛋白的有5个氨基酸发生了突变,其中一个位于Ca抗原位点208位氨基酸(R→K),这一突变虽然还不会影响抗原性的改变,但预示了新甲型H1N1(2009)抗原漂移的启动。分离株有5个潜在糖基化位点,这与近年来古典猪H1N1和北美三源重配猪H1病毒完全一致,保留了古典猪H1病毒的特点。与禽H1病毒相比,分离株HA蛋白受体结合位点上的190(E→D)和225(G→D)位点发生突变,这可能成为新甲型H1N1(2009)在人际间传播的一个重要分子基础。此外,其它受体结合位点上相关氨基酸同时具有人和猪流感病毒的特点。本研究对南京市早期流行的甲型H1N1(2009)流感病毒的HA蛋白的分子遗传特征进行了详细研究,对进一步监测病原变异具有重要指导意义。     

辽宁省H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定与遗传演化分析

本研究2012年底从辽宁省某屠宰场猪鼻咽拭子样品中分离到1株流感病毒,经HA—HI试验和RT—PCR鉴定为H1N1亚型猪流感病毒株,命名为A／swine/Liaoning／01／2012（H1N1）,通过对病毒的8个基因片段克隆并测序,并利用分子生物学软件进行遗传演化分析。结果表明,分离株HA基因裂解位点附近的氨基酸序列为IPSIQSRjG,符合低致病力流感病毒的分子特征。全基因组进化树结果表明,分离株的8个基因片段与A／swine／Jiangsu／40／2011（H1N1）株核苷酸同源性最高,分离株处在类禽型H1N1亚型遗传进化分支上;由于类禽型H1N1猪流感病毒具有潜在感染人的潜力,在国外和国内均有感染人的报道,因此,辽宁省首次分离到该型猪流感病毒对全省养猪业和公共卫生安全具有重要意义,值得深入研究。     

披碱草与野大麦及其杂种F1、BC1F1同工酶分析

采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳方法,对加拿大披碱草、野大麦及其杂种F1、BC1F1幼苗的过氧化物酶（POD）和酯酶（EST）同工酶进行了分析。结果表明,杂种F1代POD同工酶谱表现为双亲的互补类型,正、反交F1的酶谱基本相同,杂种F1的EST同工酶谱亦主要表现为双亲的互补类型。杂种F1代POD和EST同工酶谱中亲本的个别酶带有丢失现象,又各产生了2条杂种带。BC1F1代POD同工酶谱的酶谱基本相同,EST酶带特征差异较大,出现双亲互补带和杂种带,并且有酶带的丢失现象。BC1代的POD和EST同工酶谱明显地受轮回亲本野大麦的影响,说明回交使野大麦的某些性状在BC1代进一步加强。聚类分析结果表明,株系P1F1-2与Y1F1-2及P1F1-6与P1F1-7有极其近的遗传关系,野大麦与BC1F1代各株系较披碱草有较近的遗传关系。POD与EST同工酶具多态性,可作为遗传标记用于杂种鉴定和目标性状植株的检测。     

酪氨酸磷酸酶基因ptpn11对乳腺肿瘤生长的影响

乳腺癌是威胁妇女健康和生命的头号恶性肿瘤,但其发生发展的机制及诊疗仍然没有长足的进展。蛋白酪氨酸磷酸酶11(PTPN11)是一个易于突变的基因,参与乳腺肿瘤的发生,但目前关于PTPN11调控乳腺癌的体内证据仍然缺乏。为了明确PTPN11在体内对乳腺癌发生发展的调控作用,利用大鼠乳腺肿瘤的动物模型,用PTPN11蛋白酶活性抑制剂Phps1处理,然后观察乳腺肿瘤发生的情况。结果发现Phps1处理后可延长DMBA诱导的大鼠乳腺肿瘤的潜伏期,延迟肿瘤的发生,并显著降低了DMBA诱发肿瘤的比率(P0.05),但对肿瘤生长的抑制作用不显著。证明了PTPN11参与调控体内乳腺肿瘤的发生,为理解和诊治乳腺癌提供了一个可能新的靶点。     

两株H1N1亚型猪流感病毒NS1蛋白抑制Ⅰ型IFN功能比较

本研究分离得到两株猪源H1N1流感病毒,通过进化树分析发现分别是欧亚类禽H1N1猪流感病毒和类鸭源H1N1猪流感病毒,为了研究两株毒株的NS1蛋白对Ⅰ型IFN产生的抑制能力,分别构建了2个毒株的NS1基因的真核表达载体,将NS1真核表达质粒、Ⅰ型IFN报告质粒与干扰素刺激质粒RIG-I共转染293T细胞,利用双荧光素酶...     

猪垂体特异性转录因子1基因cDNA的克隆及序列分析

本试验根据公开发表的猪POU1F1基因序列设计1对引物,提取猪垂体总RNA,通过RT-PCR方法扩增出POU1F1基因cDNA全序列,扩增产物用琼脂糖凝胶检测为预期的876 bp特异性条带。将扩增产物克隆入PTZ57R/T载体进行序列测定。经DNAStar软件分析序列与已发表序列同源性为99.7%,克隆获得的序列为进一步对猪POU1F1基因不同拼接形式功能性研究奠定了基础。     

猪流感病毒H1N1分离株HA基因的克隆与序列分析

无锡某猪场发生不同程度的猪呼吸系统疾病.对发病猪采集鼻拭子,经双抗处理后,接种鸡胚,收集24 h后死亡的鸡胚尿囊液.对一株具有血凝性的病毒分离株进行RT-PCR鉴别,结果为H1亚型流感病毒.利用RT-PCR扩增尿囊液中的流感病毒HA基因.经pGEM-T easy载体克隆、序列测定和进化树分析,结果表明,在该猪群中分离获得的该株SIV为古典型H1N1.     

乌珠穆沁羊DGAT1、NR6A1、MAN1A1基因多态性与其生长性状的关联分析

试验旨在探究甘油二酯酰基转移酶（diacylglycerol acyltransferase 1,DGAT1）基因g.13504098 C>T位点、核受体辅抑制子1（nuclear receptor subfamily 6 group A member 1,NR6A1）基因g.11204707 A>C位点和α-甘露糖苷酶（alpha-mannosidase,MAN1A1）基因g.18795097 C>T位点的多态性与乌珠穆沁羊生长性状之间的关系,为高产乌珠穆沁羊分子选育提供新的遗传标记。运用Sequenom MassARRAY^®SNP技术对乌珠穆沁羊DGAT1、NR6A1和MAN1A1基因的3个多态位点g.13504098 C>T、g.11204707 A>C和g.18795097 C>T进行检测,同时利用线性混合模型分析基因型与其4、6月龄生长性状的关联性。结果显示,在这3个位点中均检测到3种基因型,具体为：g.13504098 C>T位点的基因型为：CC、CT和TT,优势基因型为CC （0.49）,优势等位基因为C （0.70）;g.11204707 A>C位点的基因型为：AA、CA和CC,优势基因型为AA （0.54）,优势等位基因为A （0.73）;g.18795097 C>T位点的基因型为：CC、TC和TT,优势基因型为TC （0.51）,优势等位基因为C （0.55）。卡方检验显示,g.13504098 C>T、g.11204707 A>C和g.18795097 C>T位点在乌珠穆沁羊群体中均处于哈代-温伯格（Hardy-Weinberg）平衡状态（P>0.05）。群体遗传学分析表明,这3个位点在乌珠穆沁羊种群中属于中度多态性（0.25<PIC<0.50）。关联分析结果显示,g.13504098 C>T位点与乌珠穆沁羊4、6月龄的体重、体高、胸围、管围及6月龄的胸宽均呈极显著相关（P<0.01）;g.11204707 A>C位点与乌珠穆沁羊4、6月龄的体高、体斜长及4月龄的体重、6月龄的胸围均呈极显著相关（P<0.01）,与6月龄的体重、管围均呈显著相关（P<0.05）;g.18795097 C>T位点与乌珠穆沁羊4月龄的体高、6月龄的胸围均呈极显著相关（P<0.01）,与4月龄的体重、胸围以及6月龄的胸宽均呈显著相关（P<0.05）。综上所述,DGAT1基因g.13504098 C>T、NR6A1基因g.11204707 A>C和MAN1A1基因g.18795097 C>T位点多态性与乌珠穆沁羊群体部分生长性状具有显著的关联性,可以作为乌珠穆沁羊遗传选育的候选分子标记。     

甲型H1N1流感病毒实验室生物风险评估

根据目前掌握的资料,从生物学特性、流行特点、临床表现以及实验室活动等方面对甲型H1N1流感病毒做了初步的风险评估,以期为从事甲型H1N1病毒有关操作的实验室做好相关的风险评估及生物安全防护工作提供依据。     

黄曲霉毒素B_1与M_1对小鼠肠道细菌多样性的影响

试验旨在研究黄曲霉毒素B_1与M_1(AFB_1与AFM_1)对小鼠肠道细菌多样性的影响。选取体况良好的4周龄ICR(CD-1)雄性小鼠40只,随机分成4组,每组10个重复,每个重复1只小鼠,其中AFB_1组小鼠每只每天灌胃0.3mg/kg体重AFB_1,AFM_1组小鼠每只每天灌胃3.0mg/kg体重AFM_1,AFB_1+AFM_1组每只每天灌胃AFB_1与AFM_1的混合溶液,其中AFB_1终浓度0.3mg/kg体重,AFM_1终浓度3.0mg/kg体重,以上3组毒素溶剂均为1.0%二甲基亚砜水溶液。对照组小鼠每只每天灌胃1.0%二甲基亚砜水溶液。每只灌胃剂量均为200μL,每天09∶00灌胃一次,连续灌胃28d。灌胃结束后,处死并解剖小鼠,收集结肠内容物,采用16SrRNA测序的方法对肠内容物细菌多样性进行测序分析。结果显示:在细菌群落的门水平、科水平及属水平,与对照组相比,3个毒素处理组小鼠肠道内容物细菌优势菌群均未发生明显排序变化(P>0.05),但不同的毒素处理仍造成了不同分类水平下细菌菌群丰度的显著变化:与对照组相比,AFB_1组及联合灌胃组小鼠肠内致病菌或条件致病菌,如Facklamia、Staphylococcus、Corynebacterium属细菌丰度显著升高(P<0.05);而AFM_1组与对照组相比未见显著差异(P>0.05)。综合试验结果,AFB_1单独作用或与AFM_1联合作用可诱导小鼠肠道内致病菌或条件致病菌细菌增殖,改变肠道健康微生物区系,损伤肠道微生物屏障功能。     

5个黄牛群体垂体转录因子基因变异研究

 为了阐明云南黄牛垂体转录因子(POU1F1)基因的群体变异特征,采用DNA序列分析和PCR-RFLP技术对云南地区5个黄牛群体（3个本地群体和2个引进品种）的垂体转录因子(POU1F1)基因的第5内含子和第6外显子进行了基因克隆测序和群体变异检测分析。在5个群体中均发现存在A和B两个等位基因,在国外引进的短角牛和安格斯牛中,A等位基因为优势等位基因,其基因频率分别为0.944和0.700;而在云南的昭通黄牛、迪庆黄牛和荷斯坦奶牛中B等位基因占优势,其基因频率分别为0.645,0.727和0.917;在短角牛和安格斯牛中,BB基因型频率为0;而在云南荷斯坦奶牛中,AA基因型频率为0。在所检测的座位中,昭通黄牛、迪庆黄牛和安格斯牛具有较高的杂合度,而其他群体该座位杂合度较低。     

中国类禽型H1N1亚型猪流感病毒的发现和遗传分析

采用禽流感病毒通用引物,对2006年发现的1株H1N1亚型的类禽型猪流感病毒的全基因组进行了测序,并进行了遗传学分析。序列分析表明它的8个片段与欧洲的类禽型猪流感病毒A/swine/Ile et Vilaine/1455/99(H1N1)病毒和A/swine/Cotes d'Armor/1488/99(H1N1)病毒的相应基因具有高度的同源性,同源性可达97%~99%,表明类禽型猪流感病毒已在中国出现。其血凝素基因的190E→D和225G→E的突变使得其结合NeuAc-a2,6Gal受体的能力高于NeuAca2,3Gal受体。欧洲的类禽型猪流感病毒可以直接感染人,并且可导致人的肺炎和死亡。中国类禽型猪流感病毒的发现及其的NeuAca2,6Gal受体结合特性使其成为一个潜在可感染人的病毒。