集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803 slr1501的克隆及原核表达分析

组蛋白乙酰基转移酶上调表达与抗逆性有一定相关性。集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803 Slr1501是一个未知蛋白,预测其属于组蛋白乙酰基转移酶GNAT家族N-乙酰基转移酶。为了进一步明确slr1501基因功能,本研究从集胞藻6803中克隆slr1501基因,成功构建了pET-28a(+)-slr1501原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行分析。经1 mmol/L IPTG诱导2 h后Slr1501蛋白成功表达,表达量随诱导时间的延长而增加,且主要以包涵体形式表达。Western blot检测结果显示Slr1501重组蛋白特异性表达。本试验结果为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

培养基中几种重要营养元素对Anabaena sp. strain PCC 7120及Synechocystis sp. strain PCC 6803生长的影响

配制KNO3、KHCO3、NaHCO3、FeNa2-EDTA及Na2s2 O3营养盐培养液,并按一定浓度添加至液体或固体培养基中,获得含有不同营养素、不同浓度的液体及固体培养基,检测无机氮(NO3-)、无机碳(HCO3-)、Fe及Na2S2O3对集胞蓝细菌Synechocystis sp.strain PCC 6803和鱼腥蓝细菌Anabaena sp.strain PCC 7120细胞生长的影响.结果显示,集胞蓝细菌Synechocystis sp.strain PCC 6803在10 mmol/L硝酸盐生长较好,鱼腥蓝细菌Anabaena sp.strain PCC 7120在2 mmol/L硝酸盐生长较好.不同浓度KHCO3及NaHCO3都会对蓝细菌的生长产生影响,可能是因为盐离子发挥了主要作用.此外,2种蓝细菌在10 mmol/L Na2S2O3中生长较好,不同浓度的铁盐对蓝细菌的生长产生较大影响,在10μmol/L铁盐中生长最佳.     

一种快速稳定制备水稻PCR模板的方法

研究建立了一种用碱处理磨碎水稻叶片快速制备PCR模板的方法，该方法简单快速、稳定可靠、扩增效果好，对待测植株的损伤小；而且用于制备模板的样品不受叶龄的限制，低温保存后的样品和制备好的DNA模板也不影响其扩增效果。因此，该方法在转基因水稻的大规模筛选与鉴定方面更经济有效。     

35S启动子定量PCR非同源竞争模板的构建

利用35S启动子特异引物,以大肠杆菌基因组DNA为异源模板,经低严谨度PCR扩增并回收克隆适宜DNA片段,构建了35S启动子的非同源竞争对照。测序结果表明,该片段与35S启动子相应序列即靶序列除两端引物序列完全相同外,其他部分没有同源性。利用该非同源竞争对照,建立了转基因玉米35S启动子的QC-PCR技术体系,并进行了校正。     

酶液处理法制备转基因植株PCR DNA模板的研究

采用脂肪酶、蛋白酶K和复合酶处理叶片,建立了酶液处理法制备转基因植株PCR DNA模板的新技术并在转基因油菜和水稻上进行了验证.酶液浓度为0.1 mg/ml脂肪酶、0.1 mg/ml蛋白酶K和0.1 mg/ml复合酶,叶片量为1～2 cm2时,所获得的模板质量最高,PCR扩增效果最佳.该方法操作简便、稳定性较高、结果准确可靠,适用于大批量转化植株和转基因后代植株的PCR DNA模板制备.     

两种放线菌基因组DNA PCR模板制备方法的比较

[目的]比较制备放线菌基因组DNA PCR模板的两种方法液氮研磨法及TE煮沸法.[方法]以从河西走廊盐碱土壤中分离鉴定的8属16株菌为材料,包括糖丝菌属（Saccharothrix）Ⅳ23-3-4、类诺卡氏菌属（Nocardioides）Ⅴ22-5-1、原小单孢菌属（Promicromonospora）ⅨX5-4-3、小单孢菌属（Micromonospora）Ⅱ23-4-1、放线多孢菌属（Actinopolyspora）Ⅳ8-2-5、拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）Ⅱ8-4-3、链单孢菌属（Streptomonospora）DA01305、链霉菌属金色类群DA03401、链霉菌属金色类群DA01408、链霉菌属蓝色类群DA09140、链霉菌属金色类群DA01308、链霉菌属灰红紫类群DA05213、链霉菌属蓝色类群DA11417、链霉菌属粉红孢类群DA04401、链霉菌属灰红紫类群DA04402、链霉菌属球孢类群DA04307.对两种方法制备的PCR模板进行16S rDNA的扩增,PCR产物进行电泳检测.[结果]两种方法均能得到比较清晰的目的条带,但TE煮沸法简化了放线菌基因组DNA PCR模板制备的过程,可用于高通量放线菌PCR模板的快速制备.[结论]该研究为大批量菌株的快速鉴别和系统分类提供了有效的方法.     

一种简便快速制备水稻PCR模板的方法及其应用

目前在水稻分子生物学实验中DNA提取的常用方法有CTAB提取法和SDS提取法。CTAB提取法提取的DNA质量高而且量大，主要用于RFLP、Southem杂交等实验；SDS方法提取的DNA杂质略多，也可以大量提取，适合用于基于PCR的分子标记实验。但这两种DNA提取方法所需成本较高，技术性强，叶片用量大，难以满足水稻育种实践的需要，实用性不强。因此，在水稻分子育种实践中，急需一种叶片用量小、提取程序简单快捷的方法提取DNA，以满足开展分子标记辅助选择育种、分子标记快速检测种子纯度等应用研究的需要。许多分子标记都基于PCR技术，如AFLP、SSR、RAPD、SNP、EST等。目前已开发出大量的水稻SSR标记。由于水稻基因组中存在着丰富的SSR标记而且多态性较好，在水稻群体分子标记连锁图谱构建、基因定位、QTL分析等研究中广泛应用，在水稻种子纯度鉴定和分子标记辅助选择育种方面已有研究报道。本文报道了一种简便的DNA提取方法，既能快速提取DNA。又只需要少量叶片，同时利用SSR标记鉴定了“两优培九”种子的纯度。     

马铃薯疮痂病的实时定量PCR检测方法

应用实时定量PCR技术对马铃薯疮痂病进行检测,在Nec1、TxtAB致病基因上进行引物探针的设计,在Nec1基因上筛选获得最佳探针引物。本方法重复性好,特异性强,灵敏度高,可实现准确定量。     

对虾病毒 DNA／RNA 的实时荧光定量RT PCR 同步检测方法研究

为建立同步检测对虾DNA/RNA病毒的实时荧光定量反转录PCR（RTPCR）方法,提高检验检疫工作效率,探索了一种新的实时荧光定量PCR扩增反应程序。结果显示,应用优化的实时荧光定量RTPCR检测4种对虾病毒（白斑综合症病毒、传染性皮下及造血器官坏死病毒,桃拉综合征病毒、黄头病毒）DNA/RNA,扩增曲线形态典型,扩增效率理想（E值分别为1.06、1.07、0.92、0.92）,标准曲线线性良好（r＝1）,重复性一致（标准差0.05～0.46,变异系数0.26％～1.62％）,灵敏度高,且与实时荧光定量PCR相比差异不显著（平均Ct值误差0.04～0.40,t值0.53～2.50,P＞0.05）,检测时间约1h。优化的荧光定量RTPCR可以用于4种对虾病毒DNA/RNA的快速定量检测。     

猴痘病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank发表的猴痘病毒(AF380138)F3L基因全序列,设计并合成了引物和TaqMan、MGB探针,建立了F3L基因的荧光定量PCR检测方法.应用该方法可从人工合成的猴痘病毒F3L基因片段(48048～48 509 bp)扩增典型的"S"型曲线,25 μL反应体系检测灵敏度可达68拷贝,但不能从鸡痘、山羊痘等病毒中扩增出相应的扩增曲线.结论:本方法可快速、敏感、特异地检测猴痘病毒.     

集胞藻6803藻胆体藻蓝蛋白多克隆抗体制备及其初步应用

通过PCR扩增出集胞藻6803 C-PC编码基因cpcA,构建表达质粒pET32a(+)-cpcA,转化大肠菌株BL21(DE3)pLysS,用IPTG诱导表达、经His-tag纯化后免疫日本大耳白兔获得多克隆抗体。间接ELISA法揭示该抗体效价可高达1∶1 025 000;蛋白免疫印迹确定该抗体具有高度特异性。应用该抗体进行蛋白免疫印迹检测,结果发现C-PC蛋白在生长光与高光培养条件下的数量,以及与2个光系统间的连结数量均存在显著差异,为进一步研究藻胆体的杆在响应与适应机制中所承担的重要角色奠定了生化基础。     

集胞藻PCC6803蛋白组学研究进展

自集胞藻PCC6803蛋白组学研究工作开展以来,已取得一系列研究成果。这些研究成果主要分为2类：①鉴定了全细胞或亚细胞结构内表达的蛋白质;②发现了许多环境胁迫条件引起的蛋白质差异表达,为理解细胞胁迫反应和蛋白的功能提供了线索。从这2个方面分别对集胞藻PCC6803蛋白组学的研究成果进行简要综述。     

光生物反应器中集胞藻6803的光衰减及其生长动力学研究

[目的]分析集胞藻6803细胞培养体系的光衰减及分批培养条件下藻细胞的生长特性。[方法]以集胞藻6803（Synechocystis sp.PCC6803）为供试藻种,用尤尼柯7200型分光光度计测定藻细胞浓度和用ST-85自动量程照度计测定光强在通过不同光程、不同浓度藻液时的变化。[结果]随着藻细胞浓度和光程的增加,光强迅速下降。在同一光程下,光强随着藻细胞浓度的增加而下降。在培养初期藻细胞浓度较低时,光衰减程度较小;在培养后期,随着藻细胞浓度的增加,光衰减程度逐渐增加。在培养过程中藻体细胞的生长规律与微生物发酵过程中菌体的生长规律相似。藻体细胞生物量曲线与微生物发酵时的菌体生长曲线相似。[结论]Lambert-Beer公式Ln（I/I0）=-KaXL能较好描述藻细胞浓度和光程对光衰减的综合影响;Logistic方程能很好描述藻细胞的生长曲线。     

氯霉素对集胞蓝细菌PCC 6803细胞中羧酶体数目及其相关蛋白丰度的影响

羧酶体是由致密的外壳蛋白包裹着核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶和碳酸苷酶形成的细胞内蛋白质小体,是蓝细菌二氧化碳固定的场所。为解析羧酶体在不同培养条件下的功能,本研究构建了原核表达载体pET28a-CcmK2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达带有组氨酸标签的CcmK2重组蛋白,制备了其多克隆抗体,探讨了不同质量浓度氯霉素对细胞内羧酶体数目和羧酶体相关蛋白丰度的影响。首先,确定了不同质量浓度的氯霉素对集胞蓝细菌PCC 6803生长的影响,发现5.0μg/mL氯霉素能够完全抑制菌株的生长,但是可以维持菌株存活。随后,探讨了集胞蓝细菌在葡萄糖异养和光合自养转换过程中,氯霉素对细胞内羧酶体数目及羧酶体相关蛋白的影响。结果显示:氯霉素的加入抑制了细胞内羧酶体数目对环境碳源的响应;同时,Western blot检测发现5.0μg/mL氯霉素能够抑制细胞内新的羧酶体外壳蛋白CcmK2的合成。这些结果表明,氯霉素可能通过抑制羧酶体外壳蛋白的合成来干扰细胞内羧酶体的形成,细胞内羧酶体对环境碳源的响应存在复杂的调控机制。     

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因过量表达对集胞藻PCC6803脂肪酸合成的影响

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（phosphopantetheinyl transferases,PPTase）是细菌脂肪酸合成中的关键酶。本研究利用同源重组手段构建集胞藻PPTase基因（slr0495）过量表达重组质粒,在集胞藻PCC6803中进行表达研究,并在DNA和RNA水平进行验证,利用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）检测不同条件下突变藻株脂肪酸组分及含量。结果表明：在温度为30 ℃、光照强度为50 μmol ·m^-2 · s^-1培养条件下,过量表达slr0495基因突变藻株中C12:0、C16:0和C18:0的含量分别为1. 31 mg · g^-1、8.07 mg · g^-1和1.35 mg · g^-1,比野生型藻株分别提高了23.58%、25.31%和13.45%;在温度为20 ℃、50% NaNO₃浓度、光照强度为50 μmol · m^-2 · s^-1培养条件下,与野生型相比,突变藻株中C16:0和C18:0含量分别提高了44.71%和41.51%。以上结果表明,过表达slr0495基因增加了集胞藻PCC6803中长链饱和脂肪酸的含量,并且在低温（20 ℃）和缺氮（50% NaNO₃）双重胁迫培养条件下中长链饱和脂肪酸含量得到进一步提高。本研究为探究slr0495基因功能以及在逆境中基因产生的应激反应提供了理论依据,为微藻高产多不饱和脂肪酸代谢研究奠定了基础。     

鱼腥蓝细菌PCC 7120异形胞的分离

鱼腥蓝细菌PCC 7120是一种光合自养型丝状蓝细菌.缺氮条件下,菌丝上5％～10％的营养细胞分化为异形胞,发挥固氮作用.异形胞是研究生物固氮和细胞分化的理想材料.为研究异形胞生理功能及其发育过程中的基因表达变化,需要从菌丝中分离高质量的异形胞.用2 mg/mL溶菌酶与0.1％ Triton X-100同时处理菌丝30 min,得到了完整性好、纯度高的异形胞.     

单交换法构建鱼腥蓝细菌ftsZ的gfp原位标记菌株

利用单交换法将gfp整合到鱼腥蓝细菌PCC 7120基因组上,构建ftsZ-gfp的翻译融合菌株,并观察了FtsZ蛋白的亚细胞定位.结果表明:通过同源重组,gfp与基因组中唯一完整的ftsZ融合,既保证了ftsZ基因的正常表达又能准确反映ftsZ蛋白的亚细胞定位,并且实验周期短、操作方便,是研究蛋白质亚细胞定位的一种简单有效的方法.     

鱼腥蓝细菌实时观察微型培养系统的建立和应用

为克服传统方法不能实现对特定菌丝或细胞的连续定点观察的难题,利用低熔点琼脂糖培养基将菌丝包埋在玻底培养皿中,制备了鱼腥蓝细菌PCC 7120菌株实时观察的微型培养体系.结果表明:在该培养体系中,菌丝能进行正常的生长、分裂和分化;利用该系统可以观察细胞分裂蛋白FtsZ和DNA双链损伤修复蛋白RecN在细胞分裂过程中的动态变化,实现对同一菌丝进行长时间的连续定点观察.     

鱼腥藻PCC 7120 基因alr0267敲除及其功能的初步研究

【目的】敲除鱼腥藻PCC 7120的alr0267基因,并对其功能进行初步研究。【方法】克隆获得鱼腥藻PCC 7120 alr0267基因部分片段,通过构建敲除载体,使其与目的基因发生单交换同源重组,从而将鱼腥藻PCC 7120中的alr0267基因敲除,并对敲除体进行纯化和PCR鉴定,然后对alr0267敲除体和野生型固氮异形胞进行形态观察和统计,同时采用实时荧光定量PCR,在培养不同时间(0,3,8,24h和10d)检测野生型和alr0267基因敲除体中与异形胞功能相关基因all0813、all2736、alr2887的相对表达量。【结果】鱼腥藻PCC 7120 alr0267基因被成功敲除;在缺氮条件下培养6~12d,敲除体异形胞营养细胞数的均值明显少于野生型;实时定量PCR分析表明,野生型中all0813、all2736、alr2887基因表达量均在培养24h达到最大,敲除体中这3个基因最大相对表达量的出现时间均有所延迟。【结论】alr0267基因敲除导致异形胞分化频率增加,同时影响异形胞的正常发育。