应用噬菌体生物扩增技术检测牛结核分枝杆菌的方法研究

建立噬菌体生物扩增技术检测牛结核分枝杆菌试验方法,探讨最佳检测条件。比较各种检测方法对测定结果的影响。结果:噬菌体工作浓度为1×108PFU/ml、37℃感染2h,杀毒剂浓度在100mmol/L、室温作用10min为最佳检测条件。指示细胞浓度在1×106条/ml时,形成噬菌斑清晰,便于计数。结论:在选择最佳测定条件下,噬菌体生物扩增法检测牛结核分枝杆菌,快速、简便、灵敏。     

噬菌体生物扩增技术检测牛结核病样品处理方法的探讨

以牛奶、牛口鼻分泌物为例,研究样品的不同处理方法对牛结核病的检出率的影响,以建立噬菌体生物扩增技术检测牛结核病的技术方法。     

鸡大肠杆菌噬菌体生物特性的研究及临床应用

研究采用前期试验分离到的大肠杆菌噬菌体进行试验,通过检测噬菌体生物特性从而指导制定噬菌体临床预防和治疗试验。结果表明,噬菌体在pH值4～9、热稳定性在37℃以下、0～75 min为1个生长周期,最佳感染复数为1,此时噬菌体的效价稳定性最好;通过攻毒预试验和治疗试验,预防组效果不明显,存活率为55%;灌胃口服C、D和E组治疗效果为高剂量组比低剂量组效果好,存活率分别为60%、75%和80%;注射治疗组效果最好,存活率为85%。研究表明,噬菌体有治疗禽大肠杆菌病的作用。     

噬菌体抗体库技术

噬菌体抗体是表面表达有单链抗体（Singlechain Fv,ScFv）或抗体Fab段的噬菌体,用基因克隆技术将B细胞全套可变区基因克隆出来,组装到表达载体内并表达到噬菌体表面成为噬菌体抗体的群体,即为噬菌体抗体库.该技术是丝状噬菌体展示（phage display）与抗体组合文库技术相结合而成.其基本路线为用PCR方法扩增抗体全套可变区基因,重组到噬菌体载体中,并通过与丝状噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白,把Fab段或ScFv表达到噬菌体表面.通过＂吸附-洗脱-扩增＂的富集过程,从中筛选出特异性抗体的可变区基因.     

噬菌体抗体库技术研究进展

噬菌体抗体库技术是利用PCR扩增出抗体的全套可变区基因,将抗体分子DNA片断如Fab或单链抗体(ScFv)与噬菌体外壳蛋白基因PⅢ或PVⅢ连接,使融合蛋白表达于噬菌体颗粒的表面,经过“吸附-洗脱-扩增”过程富集筛选特异性抗体。这一技术将抗体基因型和表型联系在一起,使识别抗原的能力和噬菌体的可扩增性统一起来,较好的模拟了体内的抗体产生的过程,成为一种高效的筛选体系。本文就噬菌体抗体库技术的原理、构建、筛选及其应用研究进展做一综述。     

致病性大肠杆菌噬菌体分离及裂解特性分析

以鸡源致病性大肠杆菌O18为宿主菌,采用双层琼脂平板法从鸡场粪样中分离出1株噬菌体,命名为Bp-YK2。采用经纯化的噬菌体对24株鸡源致病性大肠杆菌进行裂解试验,并利用PCR技术对衣壳基因gene23进行扩增。结果显示,该噬菌体效价为1.55×1010pfu/mL,宽噬率为41.67%;噬菌体衣壳基因gene23与噬菌体Bp7同源性最高,同源性为97%,推测该噬菌体为肠杆菌T4噬菌体。本研究为开发治疗耐药大肠杆菌的噬菌体制剂奠定基础。     

T4噬菌体蛋白的分子改造及其应用前景

T4噬菌体是一种病毒,其基因、结构和生物学特性已清晰,利用各种分子操作技术可以对其进行进一步改造。利用位点特异性诱变,研究T4噬菌体某些基本蛋白的功能;普遍用来进行噬菌体改造的噬菌体展示技术已经成功在T4衣壳平台上展示目的抗原;位点特异性诱变及噬菌体展示技术都可以用于改造噬菌体使其与哺乳动物细胞发生相互作用,也能获得除细菌宿主之外的可被噬菌体感染的细胞;还可在不断发展的噬菌体治疗研究中得到应用。这些噬菌体的改造方法都将会促进疫苗技术、噬菌体疗法和其他生物及医学科学分支的发展。论文对T4噬菌体的蛋白结构、噬菌体展示技术及相关的噬菌体治疗等内容进行了综述。     

欧洲鳗鲡T7噬菌体单链抗体库的构建、淘选及其在大肠杆菌中的高效表达

为构建欧洲鳗鲡噬菌体天然单链抗体(scFv)库,筛选鳗鲡病原菌特异性scFv,本研究采用PCR扩增健康欧洲鳗鲡重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)基因,通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术扩增完整的scFv基因(VH-Linker-VL)序列,与T7噬菌体载体连接,经体外包装后接种于宿主菌BLT5403,增殖后经PCR扩增获得噬菌体scFv库。进而以嗜水气单胞菌重组外膜蛋白为抗原,对噬菌体scFv库进行4轮生物淘洗,采用阻断ELISA选取抗体活性最高的scFv,构建pGEX-4T-2-OMP-scFv重组表达载体,转化大肠杆菌BL21进行原核表达。结果显示:本研究得到了完整的scFv基因序列,并以此构建的噬菌体scFv原始库容为1.26×10~6pfu,经扩增后初级库滴度为2.8×10~9pfu/mL;淘洗获得的嗜水气单胞菌重组外膜蛋白scFv抑制率最高达到81.7%,并实现了该scFv在大肠杆菌中的表达,SDS-PAGE检测其蛋白分子量约为53 ku。本研究构建的欧洲鳗鲡噬菌体天然scFv库及淘选获得的特异性嗜水气单胞菌scFv,为养殖鳗鲡病原菌的检测与免疫防治奠定了基础。     

检测牛分枝杆菌的噬菌体生物扩增法的建立及初步应用

建立噬菌体生物扩增法(PhaB)检测牛分枝杆菌,将建立的方法用于22株牛分枝杆菌临床分离株及20种常见非结核分枝杆菌(NTM)及5种非分枝杆菌,同时对203头疑患牛结核病奶牛的奶样进行检测,其结果与皮内变态试验、涂片法、罗氏培养进行比较。结果表明,噬菌体工作浓度为1×109PFU/mL、37℃感染2 h为最佳检测条件;杀毒剂浓度为100 mmol/L,室温作用10 min即可完全杀灭受试噬菌体;加热灭活的细菌和指示细菌不被噬菌体感染;牛分枝杆菌、耻垢分枝杆菌和22株牛分枝杆菌临床分离株检测结果均为阳性,16种NTM和5种非分枝杆菌为阴性,4种NTM(偶然、胞内、金色、草分枝杆菌)在高浓度时(>105CFU/mL)检测结果为阳性;该法可检测出60~120 CFU/mL牛分枝杆菌;批内、批间变异系数均小于15%,重复性良好;203头检测奶牛中,PhaB法、涂片法、皮内变态试验和罗氏培养结果分别有14头(6.9%)、17头(8.4%)、21头(10.3%)和12头(6.0%)为阳性,PhaB法与其他3种方法比较,阳性准确性、特异性都在96%以上,敏感性在71%~100%。该法检测牛分枝杆菌具有快速、简便、灵敏、特异性高等特点。     

78个布氏杆菌印度株的物种形成:流行病学的研究

1965—1970年兽医与医学研究工作者在印度不同的地区,用常规方法在动物与人中分离出了78个布氏杆菌菌株并作了布氏杆菌噬菌体与氧化代谢试验。用噬菌体裂解试验鉴定了全部菌株:除4个菌株外余或为流产布氏杆菌或为马耳他布氏杆菌。其中27个菌株鉴定为流产布氏杆菌生物型一,32个菌株为马耳他布氏杆菌生物型一,8个为流产布氏杆菌生物型三,3个中流产布氏杆菌生物型四与马耳他布氏杆菌生物型二各2,2个     

两种方法诊断梅花鹿结核病

2006年1月份,四川省某鹿场饲养的鹿均出现持续性咳嗽,反复下痢,粪便呈黑色糊状,进行性消瘦等症状,当地兽医用多种抗生素治疗,但效果不佳。2月2日,畜主将病死鹿送来做病原分离、鉴定。经流行病学、细菌培养和噬菌体生物扩增法检测,确诊为梅花鹿结核病。现将诊断方法及结果报道如     

抗乙肝病毒人源噬菌体单链抗体库的构建及筛选

为了构建抗乙肝病毒人源噬菌体特异性单链抗体库,从中筛选抗乙肝病毒人源噬菌体单链抗体库特异性单链抗体,试验提取患者外周淋巴细胞总RNA,以总RNA为模板,通过RT-PCR技术分别扩增出H链和L链可变区基因,采用SOE-PCR方法将VH和VL片段随机拼接成ScFv片段,然后将ScFv片段克隆至pCANTAB5E载体,电转E.coil TG1,构建抗乙肝病毒人源单链抗体库,并从中筛选阳性克隆抗体。结果表明:经过5轮筛选,获得2株能与乙肝病毒抗原特异性结合的阳性克隆。说明利用噬菌体抗体技术可不经免疫制备抗乙肝病毒人源噬菌体特异性单链抗体。     

禽流感免疫噬菌体抗体库构建及ELISA检测方法的建立

本研究应用噬菌体抗体库技术筛选禽流感亚型病毒Fab抗体,并建立相应ELISA检测方法。用禽流感亚型混合疫苗免疫小鼠,取其脾脏提取总RNA用于扩增免疫球蛋白轻链和重链基因,克隆至噬菌粒pComb3,然后转化入感受态细胞XL1-Blue中,以10¹² CFU辅助噬菌体VCSM13进行感染后,获得Fab抗体库容量为8×10⁷ CFU。以H5N1病毒为抗原进行4轮亲和筛选,获得特异性结合的克隆,利用获得的特异性克隆进行ELISA检测方法的建立。     

抗原表位鉴定方法的研究进展

抗原表位是抗原分子中能与相应淋巴细胞表面的受体结合的特殊化学基团,一般由几个氨基酸残基序列或其空间结构组成。它是引起免疫应答的物质基础,其性质决定了抗原的特异性。抗原表位的鉴定方法主要有肽扫描技术、氨基酸定点突变技术、X-ray衍射或核磁共振技术、质谱技术、噬菌体展示肽技术及生物信息技术预测等,文章将从这几方面入手对近几年来鉴定抗原表位的方法作一综述。     

兽药的生物等效度

在介绍生物等效度概念基础上 ,对生物等效度的适用范围、生物影响因素、试验方法选择和生物等效度与残留的关系等做了较为详尽的说明 ,可供我国兽药的研制开发、生产使用和法规管理人员参考     

鸡大肠杆菌宽谱噬菌体的分离及裂解性研究

为了解鸡宽谱大肠杆菌噬菌体的裂解特性,本试验以30株大肠杆菌为宿主菌,从8份粪便中成功分离出5个噬菌体,并从中筛选出1个强裂解性宽谱大肠杆菌噬菌体,命名为Z-SN5,宽噬率为70%,热稳定性相对良好,60℃作用1 h,尚有活性;耐碱性强于耐酸性,在pH值=7时活性最高,经PCR鉴定后,成功扩增出目的基因片段。本试验为今后研究噬菌体治疗鸡大肠杆菌病奠定基础。     

噬菌体抗体库技术及其研究进展

随着分子生物学和细胞生物学技术的发展，抗体的研究已进入基因工程抗体时代。20世纪90年代初，抗体库技术特别是噬菌体抗体库技术的问世，成为抗体技术的重大突破，标志着利用噬菌体表面展示技术制备人源化、多功能化、高亲和力特异性抗体成为可能。噬菌体抗体库技术是用PCR扩增出     

海南省南美白对虾锡那罗州弧菌的分离鉴定

为了有效防治海南儋州南美白对虾病害,试验首先采用常规方法鉴定从病虾肝胰腺分离的优势菌株的形态、培养特性、生理生化反应等,并用聚合酶链式反应(PCR)扩增16S r DNA序列;其次,用人工感染试验检测分离菌株的致病性;最后,通过体外裂解试验测定噬菌体(噬菌28TM)对分离株的裂解能力。结果表明:该分离株HYRJ2013为锡那罗州弧菌(Vibrio sinaloensis)。肌肉注射HYRJ2013菌株感染南美白对虾,出现与自然发病虾相似症状,测得其半数致死量(LD50)为6.68×107cfu/m L。噬菌体(噬菌28TM)可裂解该菌株,用于生物防治。说明锡那罗州弧菌是南美白对虾的条件致病菌。     

鸡肠炎沙门氏菌噬菌体的分离与生物学特性研究

研究旨在探索治疗以及控制沙门氏菌感染的新途径。试验以鸡肠炎沙门氏菌作为繁殖菌,从锦州某鸡场粪便样品中分离得到1株噬菌体,经斑点法和双层平板法对其进行验证,初步确定为沙门氏菌噬菌体,并命名为SP-1。试验设计特异性引物,对噬菌体进行PCR鉴定、产物测序、基因序列遗传进化分析,并对其进行热稳定性、pH值敏感性的测定。结果显示：PCR扩增出预期片段大小为784 bp;同源性分析显示,该噬菌体为肠炎沙门氏菌噬菌体。研究表明,噬菌体SP-1在30～50℃、pH值5～11之间均具有较好活性,且具备作为治疗鸡肠炎沙门氏菌噬菌体制剂候选毒株的潜在应用价值。     

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白纳米抗体的筛选及反应原性检测

本研究旨在获得高效特异性的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3(P80)非结构蛋白的纳米抗体。用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,测得抗体效价后分离全血中的淋巴细胞。通过噬菌体展示技术构建羊驼重链抗体可变区噬菌体展示文库。经过连续3次吸附-洗脱-扩增的生物筛淘,从中挑选出与BVDV-NS3蛋白结合的噬菌体。对经菌液PCR、琼脂糖凝胶电泳鉴定到的单域抗体(VHH)克隆进行基因测序和同源性比对。用ELISA方法验证筛选出的纳米抗体的反应原性,找到与BVDV-NS3蛋白亲和力高的纳米抗体。结果表明,获得插入率为92.8%、库容为1.84×1014 CFU/mL的噬菌体展示文库。ELISA结果和氨基酸序列分析显示,成功得到1条与BVDV-NS3蛋白具有良好反应性且与VHH同源性较高的纳米抗体序列。本研究利用大肠杆菌成功表达BVDV-NS3抗原蛋白,建立BVDV纳米抗体噬菌体展示文库,筛选到针对BVDV重要抗原蛋白相应的纳米抗体且与VHH同源性较高。试验结果为牛病毒性腹泻/黏膜病的防控、诊断、治疗及纳米抗体药物的研制提供参考。