提高耐热链霉菌转化泰乐菌素能力的分子改造与育种

BIB0830是将泰乐菌素转化为乙酰异戊酰泰乐菌素(AIV)的耐热链霉菌(Streptomyces thermotolerans)工业菌株。以pIJ8600为载体分别构建了acyB1-B2基因整合型表达载体pBIB425和带红霉素突变启动子ermEp*的红霉素抗性ermE基因整合型表达载体pBIB304。通过大肠杆菌(Escherichia coli)-链霉菌属间接合转移分别将pBIB425、pBIB304和pBIB308(耐热链霉菌的nsdA基因中断载体)导入工业菌株BIB0830,抗性筛选分别得到接合子BIB425、BIB304和BIB308。经PCR验证均为阳性克隆。摇瓶发酵结果表明,与出发菌株BIB0830相比,BIB425和BIB308泰乐菌素转化率分别提高了14%和22%,而BIB304则无明显影响。     

肉桂地链霉菌接合转移体系的构建及nsdA基因中断对其次级代谢的影响

以pSET152和pHL212为出发质粒，通过供体大肠杆菌ET12567（pUZ8002）和S17-1属间接合转移肉桂地链霉菌（Streptomyces cinnamonensis），首次构建并优化了肉桂地链霉菌的接合转移系统。利用PCR介导的基因置换技术快速构建了肉桂地链霉菌nsdA基因 （negative regulator of Streptomyces differentiation）中断载体，通过接合转移导入肉桂地链霉菌工业菌株BIB2005，筛选得到一株遗传稳定表型为AmR、KmS的接合子BIB309。PCR分析结果显示该接合子即为nsdA中断突变株。与出发工业菌株相比，在摇瓶水平上nsdA中断突变株BIB309莫能菌素产能提高了2.7倍。     

orfX基因整合表达在阿维链霉菌工业育种中的应用

阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）基因组中含有orfX基因，通过增加orfX基因剂量可以提高阿维菌素的产量。本研究以pIJ8600为出发质粒，构建了含红霉素启动子（ermEp*）和orfX结构基因DNA片段的整合型表达载体pWJ827。通过接合转移将pWJ827导入阿维菌素的工业菌株BIB9903中，得到稳定高产的重组菌株BIB0827。高效液相（HPLC）分析结果表明，与出发菌株BIB9903相比，BIB0827发酵产物阿维菌素产量提高了1.5倍，达到3350μg/mL。传代稳定性实验证明，BIB0827传代10代后依然稳定，在工业生产上有较大的应用价值。     

一株产抗生素链霉菌的研究初报

从土壤中筛选出一株能产生抗生素的放线菌,经鉴定为放线菌科链霉菌属。抗菌谱分析表明,该菌株对革兰氏阴性细菌抗性较弱,对革兰氏阳性细菌有较强的抗性,对含芽孢细菌抑菌效果尤为明显。其活性成分能耐受100℃、120min水浴,且具有一定的耐酸能力。     

透明颤菌血红蛋白基因(vgb)表达对委内瑞拉链霉菌秦岭变种生长代谢及瑞拉菌素效价的影响

委内瑞拉链霉菌秦岭变种(Streptomyces venezuelae var.qinlingensis)是瑞拉菌素(Zuelacmycin)的产生菌,为进一步探讨透明颤菌血红蛋白基因(vgb)表达对秦岭变种以及瑞拉菌素产率的影响,利用红霉素抗性基因启动子在委内瑞拉链霉菌秦岭变种中表达vgb基因,并在5 L发酵罐中研究了工程菌株与原始菌株的生长代谢特性及瑞拉菌素的效价.结果表明:在高溶氧条件下vgb基因表达并未对菌丝体生长和氨基氮的消耗产生明显的影响,但提高了对还原糖的消耗,工程菌株发酵瑞拉菌素的效价比原始菌株降低8%;在低溶氧条件下,vgb基因的表达可促进菌丝体的生长和次级代谢,并提高了还原糖的消耗,工程菌株发酵瑞拉菌素的效价比原始菌株提高45%.本研究首次利用VHb蛋白基因表达提高了委内瑞拉链霉菌秦岭变种对氧的利用率和瑞拉菌素的效价,为进一步推动瑞拉菌素工业化生产提供基础资料.     

橄榄绿链霉菌A1所产43kD木聚糖酶XYNA的纯化及其酶学性质

橄榄绿链霉菌A1(Streptomyces olivaceoviridisA1)所产木聚糖酶XYNA经阴离子交换层析和分子筛层析分离,得到纯化的XYNA.XYNA的分子量约为43 kD.其最适温度为60℃,最适pH5.6.XYNA在55℃下以4-O-Me-D-glucurono-D-xylan的Km值和Vmax分别是332 g/kg和15.72μmol/(mL@min).SDS、EDTA对XYNA有轻微的抑制作用.XYNA无纤维素酶活性.胃蛋白酶、胰蛋白酶处理30 min,对酶活性无影响.XYNA成熟蛋白N端10个氨基酸序列为Ala-G1u-Ser-Thr-Leu-Gly-Ala-A1a-Ala-Ala.     

利用PCR介导的基因置换技术构建阿维链霉菌bkdF-突变株

PCR介导的基因置换技术是一种利用λ噬菌体Red重组系统在微生物中进行基因中断的新方法。实验利用该方法快速构建基因中断载体，并成功地置换了阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）bkdF基因。先合成1对长度分别为58和59nt的引物，其5’端的39nt序列分别与bkdF基因两侧同源，3’端则分别与安普霉素抗性标记盒（aac（3）Ⅳ＋onT）两侧序列一致。以该引物扩增的PCR产物电转化能表达λRed重组酶且含有目标质粒的大肠杆菌（Eschcrichia．coli）菌株BW25113／pU790／pXW1224，获得了阳性重组质粒pXW1230。将该质粒中的大小为4．0kbBglⅡ目的片段插入基因置换载体pHZl35l，再接合转移至阿维链霉菌BJBM9903，筛选得到表型为Apma^RThio^S的接合子。PCR验证并对发酵产物进行HPLC和MS分析，证实该接合子为敞dkdF^-突变株。     

链霉菌Snea253菌株的变异分析及对根结线虫活性影响

为明确委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)自发突变对南方根结线虫活性的影响。本研究利用继代培养法选育Snea253突变株,对形态分化及相关基因进行分析,并测其代谢产物的生物活性。获得6株菌落形态差异大的自发突变菌株,其中不产色素的3株突变菌株Snea253-G、Snea253-B和Snea253-F杀线虫活性分别为61.0%、45.5%和35.0%;产色素的3株突变株Snea253-A、Snea253-H和Snea253-J杀线虫活性分别为48.7%、37.2%和37.9%。ssgA、bldC、bldD、whiB、whiE和whiI基因克隆测序结果显示各突变株基因序列没有差异,可能此6个基因没有直接参与控制Snea253菌株的自发突变。链霉菌自发突变不但使其形态发生变异,而且也影响了其代谢产物的生物活性,研究为从形态上筛选优良菌株提供了相关理论依据。     

航天搭载对硅链霉菌菌株生理生化特性的影响

研究航天搭载对硅链霉菌菌株生理生化特性的影响。通过神舟九号飞船搭载硅链霉菌进行实验,对航天诱变菌株的生理生化特性进行分析,为我国微生物肥料行业整体的技术进步奠定基础。结果表明:(1)搭载诱变菌株和CK菌株可以利用10种碳源,也可以利用10种氮源;(2)搭载诱变菌株和CK菌株都可以水解淀粉,但都不产生H2S;(3)在4～45℃条件下,搭载诱变菌株与CK菌株均可以生长,并且生长状况差异不显著;但在55℃条件下,2种菌株均不能生长;(4)搭载诱变菌株在pH=6～10条件下生长良好,而CK菌株在pH为7、8、9条件下生长良好。搭载诱变菌株和CK菌株相比较,在碳源利用、氮源利用、水解淀粉、不产生H2S和温度耐受方面均无明显差别,表现出相似性,但在耐pH方面,与CK菌株相比,搭载诱变菌株生长的pH范围更广,有更好的耐受性,显示了搭载诱变菌株具有更强的抗逆性。     

高压静电场和氮离子复合处理对链霉菌的影响

分析了不同剂量氮离子(N+)和高压静电场(HVEF)处理金色链霉菌的存活率和突变率关系,进而确定了最佳处理参数:N+能量10kev·cm-1,注入剂量1.82×1015N+ions·cm-2、2.86×1015N+ions·cm-2,电场剂量(时间、场强)20s×0.5kv·cm-2、60s×2kv·cm-2。用上述优选的HVEF和N+剂量对金色链霉菌进行复合处理,发现在部分复合处理条件下,菌株正变率比使用等剂量N+单因子处理的正变率要高。通过对出发菌株SL2、N+注入选育的高产菌株M226以及N+和HVEF复合处理获得的高产菌株D1114的3种保护酶POD、SOD、CAT的活性进行检测,发现D1114菌株3种酶的活性均最高,其次是M226,说明这3种酶在诱变处理中扮演着重要角色,并且HVEF和低能N+复合处理的效果较N+单一诱变效果要好。     

分子标记在油菜育种中的应用

油菜是世界上重要的油料作物之一,为了提高油菜的产量,各国都致力于油菜的育种工作。随着分子生物学的迅速发展,分子标记技术广泛地应用油菜育种。本文从遗传和物理图谱构建、基因的定位与克隆、数量性状位点的遗传分析、遗传多样性的评估、分子标记辅助选择等方面,综述了分子标记在油菜育种中的应用。     

畜禽粪便堆肥高温保氮菌 Aliibacillus thermotolerans BM62的筛选及复壮

氨氧化细菌可以将 NH 3氧化成 NO 2-，从而减少堆肥过程中的氨挥发，是畜禽粪便堆肥中的理想保氮微生物。本实验在堆肥高温期样品中分离得到一株高温微好氧氨氧化细菌，经鉴定此菌株为芽孢杆菌科( Bacillaceae)的一个新属，命名为 Aliibacillus thermotoleransBM62。在后续研究中由于反复迭代等原因，发现其氨氧化能力有所衰退。菌株 BM62可适应堆肥高温阶段微好氧环境进行氨氧化作用，该特性使其在堆肥保氮中具有较高的理论研究价值和实际生产意义，因此对该菌株氨氧化能力的复壮研究十分必要。本实验以 Aliibacillus thermotolerans BM62为研究对象，以来源环境堆肥为基础，添加不同营养因子(牛肉膏、蛋白胨)作为复壮培养基，考察不同复壮载体对菌株复壮效果的影响。实验结果表明，菌株 BM62在不加任何外源有机物的堆肥原环境复壮培养基的复壮效果最佳，经复壮培养后，该菌株氨氧化活性为 34.7～ 36.5mg/L，与其退化前氨氧化能力(35.0mg/L)相当。     

DNA分子标记技术在小麦遗传育种中的应用综述

在简述DNA分子标记的种类和特点的基础上,综述了分子标记技术在小麦遗传育种研究中主要应用于遗传图谱构建、基因标记和定位、品种鉴定和指纹图谱绘制、物种亲缘关系和遗传多样性研究及分子标记辅助育种等方面的现状,并对分子标记技术的发展和应用前景进行了展望。     

红花化学成分及分子育种研究进展

红花是我国重要的一种药食同源的经济作物,花瓣具有活血通经,散瘀止痛的功效,而红花油更是优质的保健食用油.通过查阅国内外学术界关于红花的研究文献,对红花的研究现状进行综述,并提出了今后的研究方向,以便于对该药材资源进行更好的研究、开发利用.     

利用Wx基因分子标记辅助选择培育面条专用优质小麦

利用“中国春”及其缺体-四体对wx-B1基因的STS标记进行了定位,并对一些小麦品种及3个高代糯麦株系做了鉴定,结果与Wx蛋白的SDS-PAGE一致.用该STS分子标记和其它方法,从组合江苏白火麦×关东107的F2分离群体中筛选出8种WX基因型,其中3种基因型为自然界中所没有.采用桥梁亲本法,同时利用wx-B1基因的STS标记和显微镜检辅助选择,经过3代杂交转育获得了含wx-Blb的接近京411的4A单体代换系,为优质面条专用小麦品质育种提供了广泛的遗传材料.利用WX基因分子标记辅助选择,可以加快育种进程.     

奶牛分子育种专题学习网站的建设构想

阐述了建设奶牛分子育种专题学习网站的意义和构想,规划了网站的主要内容和发展方向,为相关专业的研究者和从业人员提供参考。     

油料作物种子维生素E含量和组分改良的分子育种研究

作为重要的脂溶性天然抗氧化剂,维生素E的存在对预防油脂多不饱和脂肪酸过氧化、增强油脂营养品质具有重大意义。近十年来,随着人们对高等植物维生素E生物合成途径认识的不断深入,油料作物种子油脂中维生素E品质的多元化改良成为可能。本研究首先简要介绍了天然维生素E的类型和生物合成途径,然后概述了油料作物种子中维生素E和脂肪酸之间相互关系的研究进展以及油料作物种子维生素E品质改良的分子育种研究进展,最后展望了油料作物种子油脂脂肪酸和维生素E综合品质改良育种的前景。     

Surfactant protein of the Streptomyces subtilisin inhibitor family inhibits transglutaminase activation in Streptomyces hygroscopicus

Transglutaminase (TGase) is widely used in the food industry for improving protein properties by catalyzing the cross-linking of proteins. In Streptomyces, TGase is secreted as a zymogen, and an activation process has been observed in liquid culture. However, the activation mechanism remains unclear. In the present study, the TGase activation process in Streptomyces hygroscopicus was investigated by biochemical approaches. In a liquid culture, Pro-TGase was secreted and gradually was converted into active TGase during the growth period; however, in a cell-free system in which cells were removed from the liquid culture, TGase activation stalled unexpectedly. Subsequently, the TGase activation process was found to be inhibited by a TGase-activating protease inhibitor (TAPI). N-Terminal amino acid sequencing and a homology search of the purified TAPI revealed that it is a member of the Streptomyces subtilisin inhibitor (SSI) family. Furthermore, it was found that TAPI (0.1 mg/mL) decreased the surface tension of water from 72 to 60 mJ/m2 within 5 min, suggesting that it possesses surface activity. This is the first report that an SSI member functions as a surfactant protein. On the basis of these findings, a model for TAPI-regulated TGase activation process was proposed. This study provides novel insights into the TGase activation process in Streptomyces.