小麦TaPYL8基因的克隆与抗旱功能分析

脱落酸(ABA)信号通路在植物对干旱胁迫的响应中扮演着至关重要的角色;作为ABA受体,PYL家族蛋白在ABA信号转导中发挥核心作用。小麦TaPYL8是PYL家族的成员。为了明确TaPYL8是否参与小麦干旱胁迫响应,本研究分析了TaPYL8的表达模式,创建过表达TaPYL8拟南芥,并探讨了干旱对拟南芥生理生化及胁迫相关基因表达的影响。结果表明,TaPYL8表达量在干旱胁迫、外源ABA及PEG6000处理后上调。干旱胁迫下,过表达TaPYL8增强了拟南芥的存活率,降低了叶片失水率和MDA含量,提高了SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性及AtSOD、AtP5CS1、AtABF3等胁迫相关基因的表达量。推测TaPYL8通过促进胁迫相关基因表达增强植物抗旱能力。     

偃麦草ErABF1基因克隆及功能分析

抗逆相关bZIP (Basic leucine zipper) 转录因子家族基因主要参与ABA、干旱、高盐等胁迫应答反应,其过表达能够显著增强植物的抗逆性。本研究从偃麦草（Elytrigria repens L.）中分离到一个抗逆相关 ErABF1（E. repens ABA Binding Factor 1）基因,氨基酸序列比对分析发现,该基因与小麦、玉米、拟南芥等bZIP转录因子基因同源性较高,亲缘关系较近;ErABF1基因的表达受到ABA、干旱、高盐、低温的强烈诱导;在2% PEG、200 mmol·L^-1 NaCl胁迫培养基上初步功能分析表明, ErABF1过表达提高了转基因烟草对干旱、高盐的胁迫耐性。     

小麦种子萌发基因TaJAZ1的克隆和功能研究

小麦品种铭贤169是我国黄淮麦区育种研究广泛应用的条锈病诱发材料,但其种子休眠时间过长,不仅影响播种后均匀发芽和生长发育,其收获掉落籽粒也容易导致秋季育种田的生物学混杂。本研究通过筛选其休眠种子与萌发种子的转录组学数据,克隆获得差异表达基因TaJAZ1,并对其生物信息学特性、亚细胞定位、表达模式进行分析,结合解析拟南芥jaz3（与TaJAZ1同源性最高）突变体、TaJAZ1过表达拟南芥和水稻的表型反应。结果表明,TaJAZ1基因编码区全长1 230 bp,可编码409个氨基酸,在不同物种间保守性较强,与野生二粒小麦JAZ1基因的亲缘关系最近;启动子区含有脱落酸响应元件ABRE 和茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif;该基因定位于细胞核和细胞膜,TaJAZ1基因在种子发育中穗发芽时期表达量达到最高,进入成熟时期表达量显著降低;ABA能诱导TaJAZ1基因的表达,ABA处理下过表达拟南芥的萌发率比野生型和jaz3突变体高,ABA信号通路基因AtABI5的诱导量变低;TaJAZ1过表达水稻的萌发率高于受体水稻, ABA处理后,OsABI5的诱导量也降低。以上结果证明,TaJAZ1基因能促进种子萌发,进一步验证其在ABA信号通路中起负调控作用,为改良铭贤169等强休眠性小麦品种提供参考。     

玉米氮胁迫响应NRT基因的鉴定及ZmNRT2.5的克隆和表达分析

硝酸盐转运蛋白(Nitrate Transporters,NRTs)在植物根系NO₃^-吸收或转运中发挥重要作用。为探究玉米NRTs基因在氮素吸收中的功能,从前期转录组数据中鉴定出7个响应氮素处理的差异表达ZmNRTs基因。启动子顺式作用元件分析表明,这些ZmNRTs基因的启动子均含有多个植物逆境或激素应答元件,推测他们可能与玉米非生物胁迫应答或植物激素调控氮素吸收相关。从玉米根系中克隆了对氮素处理响应最大的ZmNRT2.5,该基因CDs全长为1 563 bp,编码520个氨基酸。进化树分析结果表明,ZmNRT2.5与AtNRT2.5同源性最高,含有保守的硝酸盐转运结构域,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,含11个跨膜结构域。实时荧光定量PCR分析表明,ZmNRT2.5主要在根、老叶和叶鞘中表达。低氮处理显著诱导ZmNRT2.5在根中的表达,植物激素脱落酸、赤霉素和乙烯均参与调控ZmNRT2.5的表达。同时,ZmNRT2.5基因的表达受到盐胁迫的显著抑制。     

小麦 TaGF14m基因的克隆及其盐胁迫响应分析

14-3-3蛋白家族在真核生物中广泛存在且高度保守,可结合多种靶蛋白参与植物代谢、发育以及胁迫响应等多种生理过程和信号途径。 TaGF14m基因是14-3-3基因家族成员之一。本研究以中国春为材料,对其进行了克隆和分析,并通过在拟南芥中过表达,分析该基因在盐胁迫下的功能。结果表明, TaGF14m基因含有5个外显子和4个内含子,开放阅读框为789 bp,编码262个氨基酸;小麦幼苗叶片中 TaGF14m基因在盐胁迫下上调表达;与野生型拟南芥相比,过表达 TaGF14m的转基因拟南芥在盐胁迫下生长受到明显抑制,根长也显著变短;SOS途径相关基因表达分析显示, TaGF14m基因可能通过SOS途径负调控盐胁迫耐受性。     

玉米自交系苗期冷胁迫miRNA表达谱研究

以冷敏感自交系B73和耐冷自交系W9816为材料,分析供试材料在冷胁迫条件下的miRNA表达谱。冷处理后,有10种miRNA上调表达,包括miR156、miR166b/c/d、miR171d/e、miR398a/b、miR399e和miR408等;有21个miRNA下调表达,包括miR159a、miR166h、miR167a/b/c/d/h/i、miR319b/d、miR393a/c和miR399a/b/c/h等。对部分miRNA的荧光定量检测与测序结果基本一致。基于生物信息学的预测,差异表达的miRNA共有84个靶基因,GO分析表明,这些靶基因参与了基因转录和能量代谢过程,并响应胁迫刺激。结果表明,冷处理差异表达miRNA及其靶基因在玉米冷胁迫响应中具有重要的生理作用。     

小麦CBL基因家族鉴定及表达模式分析

类钙调磷酸酶（CBL）蛋白是植物中独特的Ca²⁺传感蛋白,对植物应对非生物胁迫具有重要作用。为探究小麦CBL基因的功能,利用生物信息学方法从小麦全基因组数据库中共鉴定出68个小麦CBL基因家族成员,并对其进行了理化性质、基因结构、进化树和共线性分析。结果表明,小麦CBL蛋白为酸性亲水性蛋白质,其对应基因分布于18条染色体上,亚细胞定位分布广泛,核中最多;蛋白结构域高度保守,都含有EF hand结构域,且同一类群中的大多数成员具有相似的motif。与水稻进行种间共线性分析发现,二者的CBL基因之间存在较多的共线性关系。以强抗寒冬小麦品种东农冬麦1号和东农冬麦2号为材料,对转录组分析显示出的8个在低温下表达差异显著的CBL进行qRT PCR分析发现,这8个基因在不同小麦品种和不同组织部位都存在明显的差异表达,分蘖节中CBL的表达量在-25 ℃时达到峰值,而叶片中CBL的表达量在-10 ℃时达到峰值,说明CBL基因在低温胁迫调节中起重要作用。     

陕西小麦黄色素含量基因 TaZds-A1和 TaZds-D1的组成与分布

面粉或面制品色泽是小麦重要的品质评价指标,ζ-胡萝卜素脱氢酶(ζ-carotene desaturase, ZDS)活性基因是控制小麦籽粒或面粉中黄色素(Yellow pigment, YP)含量的重要基因。为给陕西小麦品质改良提供参考依据,利用2A和2D染色体上的 YP2A-1和 YP2D-1标记,对陕西194份小麦品种(系)分别进行检测,分析 TaZds-A1和 TaZds-D1两位点等位变异的组成和分布特点。结果表明,在陕西小麦中, TaZds-A1位点存在 TaZds-A1a和 TaZds-A1b两种等位变异类型,分别占43.3%和56.7%;而在 TaZds-D1位点,全为 TaZds-D1a等位变异类型。陕西小麦两位点存在 TaZds-A1a/ TaZds-D1a和 TaZds-A1b/ TaZds-D1a两种等位变异的组合类型,在不同地区小麦中的分布不同：在陕西渭北旱塬和关中地区小麦中,两种组合类型的频率相当,约各占一半;在陕南地区小麦中,高YP含量的 TaZds-A1b/ TaZds-D1a组合类型占三分之二。ZDS活性基因的选择将成为以后陕西小麦色泽品质遗传改良研究中的一个重要部分。     

盐胁迫下玉米WRKY转录因子生信及表达分析

WRKY是一类在逆境胁迫响应中起重要调控作用的转录因子。基于盐胁迫下的玉米转录组数据,确定了16个差异表达的WRKY基因家族成员。利用生物信息学方法对各成员理化性质、染色体分布、蛋白保守结构域、系统进化、顺式作用元件及盐胁迫下的相对表达量进行分析验证。结果表明,16个差异表达的WRKY基因家族成员主要分布在玉米的7条染色体上,各成员之间理化性质存在差异。qRT-PCR 验证结果表明,不同基因家族成员对盐胁迫的敏感程度不同,对胁迫处理时间的响应也有所不同。ZmWRKY106、ZmWRKY108、ZmWRKY91、ZmWRKY27在盐胁迫后24 h内均未参与表达,经盐胁迫处理6 h后ZmWRKY63表达量达到最高。各家族成员对盐胁迫的响应及敏感程度不同,可能与各成员间理化性质和结构的差异以及所含的顺式作用元件、内含子和motif类型有关。     

小麦G6PDH基因家族的鉴定与表达分析

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)是磷酸戊糖途径中的关键限速酶,在植物生长发育及非生物胁迫响应中发挥重要作用。本研究利用生物信息学对小麦 G6PDH基因家族成员进行鉴定,并对该家族基因编码蛋白的理化性质、进化关系、亚细胞定位、基因复制事件以及在不同组织和不同胁迫下的表达模式进行分析。结果表明,在小麦基因组中共鉴定到14个 G6PDH基因家族成员,分布在小麦2A、2B、2D、4A、4B、4D、6A、6B和6D染色体上,其中5个基因编码的蛋白为胞质型,9个为质体型。亚细胞定位预测表明,胞质型G6PDH蛋白主要定位于细胞质上,而质体型G6PDH蛋白主要定位于叶绿体上。根据系统进化和保守结构域特征,可将14个小麦G6PDH蛋白分为Cy、P0、P1和P2四个亚组。共线性分析表明,小麦 G6PDH基因家族成员存在17对片段重复基因。RNA-seq分析结果表明,小麦 G6PDH基因家族成员在不同组织中存在明显的表达差异,其中 TaG6PDH1-2A/2B/2D基因在根中的表达量最高; TaG6PDH2-2A和 TaG6PDH2-2B基因在干旱胁迫后1 h以及热胁迫后6 h均上调表达。进一步利用qRT-PCR检测6个小麦 G6PDH基因在干旱和盐胁迫下的表达模式,发现分别有5个基因在小麦根中均上调表达,推测小麦 G6PDH基因在非生物胁迫响应过程中发挥着重要功能。     

小麦质膜Na+/H+逆转运蛋白TaSOS1的表达分析

为探讨小麦质膜Na⁺/H⁺逆转运蛋白TaSOS1在逆境条件下的生物学功能,采用荧光定量PCR（RTPCR）方法,对 TaSOS1基因在4种不同胁迫条件下（200 mmol·L^-1 NaCl、4℃低温、100 μmol·L^-1 ABA和15% PEG6000）的表达水平进行了定量分析。结果表明,在正常条件下,小麦根中 TaSOS1的mRNA表达量要高于叶中的表达量。盐胁迫处理下,根中 TaSOS1特异性上调表达,说明 TaSOS1基因在根中的功能更强,其表达与盐胁迫有关且具有组织特异性;在4℃低温处理下, TaSOS1在叶中上调表达;而在ABA和PEG6000两种处理条件下, TaSOS1的表达没有规律性,推测 TaSOS1的表达途径可能为非ABA依赖型且与盐离子的特异性有关。生物信息学分析的结果表明,小麦质膜Na⁺/H⁺逆转运蛋白TaSOS1与拟南芥和水稻的质膜Na⁺/H⁺逆转运蛋白AtSOS1和OsSOS1具有高度的同源性,由此可以推测小麦TaSOS1具有与AtSOS1和OsSOS1类似的功能,可以把植物体内Na⁺排出体外,以减轻Na⁺对植物的毒害。     

小麦BES1转录因子基因 TaBEH3的克隆及表达分析

BES1(油菜素内酯不敏感1-甲磺酸乙酯-抑制剂1)是一类植物特有的转录因子家族, TaBEH3基因是小麦 BES1基因家族成员之一,为进一步了解该基因的功能,以中国春为材料,克隆了 TaBEH3基因,将其3个同源基因分别命名为 TaBEH3-A、 TaBEH3-B和 TaBEH3-D。序列分析显示,3个同源基因均包含2个外显子,分别编码356、354和358个氨基酸,启动子区含有大量与植物生长发育、激素响应相关的顺式作用元件,其中,分生组织表达元件（CAT-box）和脱落酸响应元件（ABRE）在3个基因中普遍存在。系统进化树分析显示, TaBEH3基因在麦类作物中具有更近的亲缘关系。基于qRT-PCR进行的时空表达分析显示, TaBEH3基因在不同组织和不同器官间均有组成性表达,表明 TaBEH3基因在植物生长发育（特别是花器官的发育和形成）过程中具有重要的作用。 TaBEH3-A、 TaBEH3-B和 TaBEH3-D基因响应ABA激素胁迫处理,且3个基因的表达量变化趋势一致。     

TaHIPP32与 TaHAK1表达及小麦缺钾胁迫耐性的关系

钾是植物生长发育必需的三大营养元素之一。高亲和性钾转运蛋白（HAK）能加强植物在缺钾胁迫时钾的吸收和转运。本课题组前期研究发现,小麦 TaHAK1基因在缺钾胁迫条件下显著上调表达,并筛选得到可能调控 TaHAK1基因表达的上游转录因子基因 TaHIPP32,但这两个基因在缺钾胁迫中的作用机制尚不清楚。本研究首先对 TaHIPP32基因进行了系统发育和亚细胞定位分析,然后利用双荧光素酶验证 TaHIPP32和 TaHAK1基因的互作,并以河南省大面积推广的小麦品种百农207为试验材料,利用大麦条纹花叶病毒诱导基因沉默（BSMV-VIGS）技术分析缺钾胁迫处理下 TaHIPP32基因沉默对小麦植株的影响。系统发育和亚细胞定位分析表明, TaHIPP32基因与水稻 OsHIPP33基因的亲缘关系最近,且其编码的蛋白定位于细胞膜上。双荧光素酶试验表明,TaHIPP32蛋白能够与 TaHAK1基因启动子互作。通过BSMV-VIGS技术瞬时沉默 TaHIPP32基因,发现该基因沉默后,小麦植株对缺钾胁迫更为敏感,植株生长受到抑制,干重显著降低,丙二醛(MDA)含量显著提高;缺钾胁迫处理下,沉默 TaHIPP32基因的植株中, TaHAK1和 TaHIPP32基因的表达均被抑制,且植株体内钾元素从地下部到地上部的转移系数显著降低,说明 TaHIPP32基因通过调节 TaHAK1基因的表达来影响植株体内钾元素的转运。     

玉米耐旱相关基因dbf1的序列变异分析

玉米dbf1 基因在干旱胁迫下的编码产物与DIP₁蛋白相结合,调控植物激素脱落酸（ABA）响应基因rab17 的表达,从而提高耐旱性。以B73的dbf1 基因组序列为模板,对104个玉米自交系的dbf1 基因进行测序,研究玉米dbf1 基因的序列多态性。多态性分析表明,在全长为2 118 bp的序列中共发现48个SNP和12个InDel。尽管大部分变异位点集中在非编码区,但编码区的1个InDel和3个非同义突变位点的变异可以产生氨基酸序列改变。玉米dbf1 基因的全长序列和编码区序列的变异位点可以分别将该基因划分成33和11种单倍型,并且编码7种蛋白质。在供试材料中,dbf1 基因至少经历了9次重组,中性检测表明,该基因的进化没有偏离中性选择。     

陕西小麦 Glu A3和 Glu B3位点等位变异的检测和分析

低分子量谷蛋白亚基（LMWGS）与小麦品质密切相关。为了给陕西小麦的品质改良提供参考依据,采用STS分子标记,检测了175份陕西小麦品种（系） GluA3和 GluB3位点的等位变异组成。结果表明,陕西小麦 GluA3位点存在4种等位变异,即 GluA3a、 GluA3b、 GluA3c和 GluA3d,分别占12.6%、1.7%、58.3%和27.4%; GluB3位点存在8种等位变异,即 GluB3a、 GluB3b、 GluB3d、 GluB3e、 GluB3f、 GluB3g、 GluB3i和 GluB3j,分别占4.6%、2.9%、45.7%、0.6%、2.9%、8.5%、4.0%和30.8%。在陕西不同地区小麦之间,两个位点等位变异的种类、组合及其分布比例存在差异,这可能与地区间不同的自然地理环境、饮食习惯、育种目标及亲本选择有关。     

玉米BURP家族基因的鉴定和分析

利用玉米基因组数据库,通过生物信息学手段鉴定玉米BURP家族基因的全序列、定位和编码蛋白,通过序列比对进行进化和分类分析,利用玉米高通量芯片表达数据进行组织表达谱分析。结果表明,玉米基因组中含有10个BURP家族基因,分布于玉米的5条染色体上,该10个基因通过选择性剪切编码14个BURP蛋白。启动子分析表明,大部分BURP家族基因的启动子区均含有逆境应答及花粉和种子发育顺式作用元件。各个发育阶段中,多数成员在生殖器官及营养器官中均有较高的表达量,只有ZmBURP3仅在营养器官根、茎、叶中高表达,ZmBURP2仅在生殖器官雄蕊和花粉中高量表达。实时荧光定量PCR结果表明,ZmBURP3、ZmBURP4基因受PEG和NaCl胁迫处理诱导不同程度上调表达。     

小麦淀粉合成酶SSⅡa基因克隆及生物学分析

淀粉合成酶SSⅡa基因是小麦淀粉合成中的关键酶基因。为了从分子水平上了解造成不同小麦品种（系）淀粉含量差异的原因,本研究根据GeneBank中的SSⅡa基因序列AF155217.2设计引物,对8个不同抗性淀粉含量的小麦品种（系）SSⅡa基因进行克隆和多态性分析,并对其氨基酸序列进行结构域预测。结果表明,8个品种的SSⅡa基因序列高度保守,与GeneBank中已发表的序列相似度达98.19%以上,共发现40个单核苷酸变异,导致20个氨基酸发生了变异。蛋白结构域分析发现这些变异位点均位于α-淀粉催化酶氨基N-末端外侧,而在α-淀粉催化酶的催化区域并未发现变异位点。另外,在新春12中,还发现了一个缺失位点,缺失片段为249 bp,该缺失片段包含了糖基转移酶的部分位点。本研究为进一步从分子水平理解SSⅡa基因的结构与抗性淀粉含量之间的关系及开发分子标记辅助选择育种提供了序列信息。     

小麦 DA1基因家族成员的鉴定及其表达谱分析

泛素受体DA1在控制种子和器官大小上发挥着重要作用。本研究以中国春小麦为材料,采用生物信息学的方法对小麦 DA1基因家族成员进行了全基因组鉴定和分析,共鉴定到12个小麦 DA1同源基因（ TaDA1s）,分别位于2B、2D、4A、4B、4D、5A、5B和5D染色体上,亚细胞定位预测结果表明其位于细胞核中。系统进化分析发现, TaDA1s可分为 TaDA1、 TaDAR1和 TaDAR2三类。除TaDA1-2D1编码的蛋白只含有DA1-like结构域外,其他成员编码的蛋白均含有DA1-like、UIM和LIM结构域。启动子序列分析发现, TaDA1s的启动子区含有较多的响应激素、逆境以及与生长发育相关的顺式作用元件。通过公共的转录组数据和qRT-PCR试验验证, 发现 TaDA1s在不同组织中都有表达,在籽粒发育过程中,不同的小麦 DA1基因呈现不同的表达模式,暗示存在基因功能分化现象;脱落酸（ABA）能够抑制 TaDA1s的表达;在低温和盐胁迫条件下, TaDA1s基因表达有明显的差异。酵母双杂交和荧光素酶互补试验发现,TaDA1-2B、TaDAR1-5A和TaGW2存在转录自激活现象,且TaDAR1-5A与TaGW2有微弱的互作效应。本研究结果为进一步探究 DA1基因家族在小麦中的生物学功能奠定了基础。     

非生物胁迫诱导的玉米蛋白激酶基因ZmCIPK3的cDNA克隆和表达特性

类钙调磷酸酶B亚基互作蛋白激酶(calcineurin B-like calciumsensor interactingProtein Kinase,CIPK)在植物非生物胁迫信号转导中起重要作用。应用分子克隆的方法在玉米(Zea mays)中克隆了一个cDNA全长为1 350 bp的蛋白激酶基因ZmCIPK3(GenBank登录号为EU873319)。其编码的蛋白含有449个氨基酸,分子量为50.89kD,等电点为8.26。推断的ZmCIPK3催化结构域中包含蛋白激酶催化结构域保守的11个亚结构域,蛋白C端具有植物CIPK蛋白家族特有的包含24个氨基酸的NAF结构域。半定量RT-PCR结果表明,在玉米幼苗叶片中,ZmCIPK3响应甘露醇、氯化钠、ABA和4℃低温的诱导,其转录水平在12 h内呈上升趋势。ZmCIPK3是一个新的玉米蛋白激酶基因,响应多种非生物胁迫信号。     

油菜素内酯对低温胁迫下冬小麦 wrab17基因表达的影响

为了探索油菜素内酯（BR）对低温胁迫下 wrab17基因表达模式的影响,以寒地冬小麦品种东农冬麦1号（Dn1）为试验材料,利用qRT-PCR技术克隆得到 wrab17基因的cDNA序列,利用生物信息学方法分析该序列的特征,采用qRT-PCR技术检测低温（5 ℃、0 ℃、-10 ℃、-25 ℃）胁迫下该基因在冬小麦叶片和分蘖节中的表达情况以及BR对 wrab17基因表达量的影响。结果表明, wrab17基因的编码区序列长度为735 bp,包含500 bp的完整开放阅读框,可编码167个氨基酸,属于稳定蛋白质,该蛋白质无跨膜区和信号肽。qRT-PCR分析表明,低温胁迫下对照组和BR处理组的Dn1叶片和分蘖节中, wrab17基因的相对表达量分别在-10 ℃和-25 ℃时最高,且BR处理组 wrab17基因的相对表达量均高于对照组,推测BR可通过提高 wrab17基因的表达量来增强冬小麦的抗寒能力。