沿海地区副溶血弧菌的表型及其主要毒力基因分布特征

为了调查浙江沿海地区副溶血弧菌的分布及其携带毒力基因的特征,在舟山、象山、温州三地实地采样385份,包括海水、泥土和水产品等,共分离到副溶血弧菌菌株278份,其中27株为tdh基因阳性,阳性率为9.7%,trh与ureC基因的阳性率分别为22.3%与11.8%,提示浙江沿海地区广泛存在着致病性副溶血弧菌污染.将不同来源...     

产耐热直接相关溶血素的副溶血性弧菌PCR检测及其表型分析

运用PCR技术成功建立了检测产耐热直接相关溶血素(TRH)的副溶血性弧菌的方法,并应用该方法从1株标准株和其他3种不同来源的37株副溶血性弧菌中的13株扩增出0.5 kb的trh基因特异性扩增带;产TRH的副溶血性弧菌中1株标准株,12株分离自腹泻病人排泄物或呕吐物,1株分离自水产动物养殖用水;并且产TRH与尿素酶阳性的副溶血性弧菌菌株之间的具有一一对应的关系,结果认定尿素酶阳性是产TRH的副溶血性弧菌菌株的表现型。     

不同条件下副溶血弧菌对墨吉明对虾致病性研究

为研究墨吉明对虾的弧菌病防控措施,通过人工注射感染的方式,研究不同数量副溶血弧菌及在不同温度、盐度、pH、不同硝酸氮、亚硝酸氮和氨氮浓度条件下副溶血弧菌对墨吉明对虾的致病性的影响。结果表明：当人工感染副溶血弧菌数量为3.92×10⁶ CFU以上时,24 h内对虾累计死亡率100%,副溶血弧菌数量为3.92×10⁵ CFU时,24 h对虾累计死亡率为50%。温度为32℃时,对虾累计死亡率最高,在一定范围内,随着温度的升高对虾累计死亡率升高。在温度为(24±1)℃时,盐度为10‰时对虾的死亡率最高,盐度为30‰次之,盐度为20‰时最低;在温度为(24±1)℃,盐度为(22±1)‰时,对虾累计死亡率pH 9时最高,pH 7时次之,pH 8时最低;温度为(24±1)℃,盐度为(22±1)‰,硝酸氮浓度为30.0 mg/L时,对虾累计死亡率最高,浓度为20.0 mg/L时次之,浓度为10.0 mg/L时最低;亚硝酸氮浓度为10.0 mg/L时死亡率最高,5.0 mg/L时死亡率次之,1.0 mg/L时死亡率最低;氨氮浓度为1.5 mg/L时死亡率最高, 1.0 mg/L时死亡率次之,0.5 mg/L时死亡率最低。实验证实：当副溶血弧菌数量为3.92×10⁵ CFU以上和数量为3.92×10⁴ CFU爆发72 h之后,弧菌病难以控制;在26~32℃范围内,随着温度的升高对虾累计死亡率升高;盐度与pH对墨吉明对虾的致病性可能与噬菌体有关;硝酸氮对感染副溶血弧菌的墨吉明对虾有胁迫作用;一定范围内亚硝酸氮浓度(1.0~10.0 mg/L)、氨氮浓度(0.5~1.5 mg/L)越高,副溶血弧菌对墨吉明对虾的致病性的影响越强,对虾累计死亡率越高。该试验为墨吉明对虾的弧菌病防控提供了坚实的基础。     

副猪嗜血杆菌hhdB基因的鉴定和分析

为了明确副猪嗜血杆菌致病菌株的毒力相关因子,从广东省不同地区发病猪场送检病猪中分离到9株细菌(H1~H9),并对其hhdB基因进行了鉴定和分析。结果显示,所分离的9株细菌经形态观察、生化特性鉴定和PCR鉴定为副猪嗜血杆菌阳性,并具有卫星现象和不溶血特征。用hhdB基因引物从分离菌株中扩增到了特异性片段,序列分析表明,所获得的hhdB基因序列与GenBank中副猪嗜血杆菌SH0165的hhdB基因同源性为99%,分离菌株hh-dB基因之间序列同源性为97.5%~99.8%,推导的氨基酸序列与少数放线杆菌、杜克雷嗜血杆菌的溶血素激活蛋白具有一定的相似性。RT-PCR扩增到了hhdB基因的目的条带,表明该基因在分离菌株中得到了相应的表达。这将为副猪嗜血杆菌致病菌株毒力特征基因的鉴定以及副猪嗜血杆菌致病机理的研究奠定基础。     

中国对虾来源哈维氏弧菌鉴定及生物学分析

从患病中国对虾中分离到优势菌株,对其进行生理生化特性及分子生物学分析。TCBS培养基上菌落呈现绿色(以下称为TCBS-G), 通过形态学、生理生化分析,菌株TCBS-G为革兰氏阴性菌,短杆状,两端钝圆,有鞭毛；Biolog GIII分析表明,该菌株生长代谢利用情况与弧菌吻合,与哈维氏弧菌的相似系数为？。基于16S rRNA、gyrB、HSP60基因序列分析同源性,16S rRNA未将TCBS-G有效鉴定,gyrB、HSP60基因序列与哈维氏弧菌相聚类,聚合置信度可达99%。综合生物学及分子特征,判定TCBS-G为弧菌属(Vibrio pacini)的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)。底物平板试验结果显示TCBS-G菌株胞外产物具有淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和DNA酶活性；且能够扩增出哈氏弧菌溶血素基因的保守特异性片段。     

鱼肠道弧菌疫苗制备及免疫保护效果

本文比较了不同灭活剂及灭活条件对鱼肠道弧菌（Vibrio ichthyoenteri）的灭活效果,确定以0.4%（v/v）福尔马林溶液在25℃下处理30h作为疫苗的最佳灭活条件,用灭活的鱼肠道弧菌疫苗免疫大菱鲆并测定了该疫苗针对鱼肠道弧菌、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、副溶血弧菌（Vibrio prarhaemolyticus）、鳗弧菌（Vibrio anguillarium）等的免疫保护力,结果表明,采用注射免疫方式接种后,针对鱼肠道弧菌的免疫保护率达75%;溶藻弧菌免疫保护率为67.6%;鳗弧菌免疫保护率为50%;副溶血弧菌免疫保护率为57.2%;采用浸浴免疫方式接种后,疫苗针对鱼肠道弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌的免疫保护力分别为25%、22.3％、11.1%、12.5%。     

对虾急性肝胰腺坏死病病原毒素基因在不同环境下表达差异研究

急性肝胰腺坏死病(AHPND)是由副溶血弧菌引起的对虾病害,给世界养虾业造成了严重的经济损失。本文旨在研究主要致病因子Pir毒素基因在不同环境因素处理下的表达差异,初步探究抑制Pir毒素基因表达的可能措施。应用荧光定量RT-PCR技术,采用比较CT值法检测致病菌中Pir毒素基因在不同温度和pH条件下的表达量。结果表明,试验分离株为引发对虾AHPND毒素蛋白Pir的致病株,在18℃、24℃、30℃和36℃条件下,Pir毒素基因的表达量随温度的增加而升高,在pH 7、pH 8和pH 9条件下,Pir毒素基因的表达量随pH的上升而降低,且pH因素对其表达量差别较大。研究结果为探究副溶血弧菌致病力强弱和环境因素的关系提供了基础数据,同时也为养殖生产中AHPND防控策略的制定提供了科学依据。     

转SbPIP1基因小麦植株的获得及发芽期耐盐性鉴定

为了培育耐盐小麦新材料,利用基因枪转化法将海蓬子(Salicornia bigelovii Torr.)水通道蛋白(plasma membrane intrinsicprotein,SbPIP1)基因导入到小麦品种宁麦13和扬麦158中。对两个品种的各2500枚幼胚进行轰击,分别获得抗Basta再生植株237株和108株(筛选标记基因为Bar基因),经PCR鉴定阳性转基因植株分别为30株和7株。用130mg/L Basta除草剂对T1代幼苗进行喷施鉴定,发现T1代幼苗的Basta抗性出现了分离。遗传分析发现76.19%的株系表现为1对基因遗传的3:1分离,为单拷贝的基因导入。发芽期耐盐性分析发现81.22%的转基因株系的盐害指数低于受体宁麦13的盐害指数,耐盐性强于受体宁麦13。这些转基因材料将进一步用于小麦的耐盐分子育种研究。     

分子标记Tamyb10D和TaDFR-B的有效性验证及对小麦抗穗发芽基因型的筛选

为了比较与小麦穗发芽抗性相关分子标记的有效性以及在白粒小麦品种中筛选出抗穗发芽的基因型材料,选择已报道的2个与穗发芽抗性相关的标记Tamyb10D和Ta DFR-B,对2套白粒小麦试材(78,103份)的穗发芽抗性进行综合筛选。结果表明:标记Tamyb10D可有效地用于白粒小麦穗发芽抗性筛选,而标记Ta DFR-B不适用于白粒小麦品种(系)材料的穗发芽抗性筛选的鉴定。通过分子标记Tamyb10D的筛选结果和发芽指数的评价,结合以前用分子标记Vp1B3的检测结果,在103份试材中筛选出5份具有高抗穗发芽基因型材料(GI10%),分别是:阆中白麦子、万县白麦子、陪陵须须白麦、川362和小白玉花,其单倍型分别是:Tamyb10D/Vp-1Bb、Tamyb10D/Vp-1Bb、Tamyb10D/Vp-1Bb、Tamyb10D/Vp-1Bb、Tamyb10D/Vp-1Bc;在另外一套(78份)试材中筛选出10份具高抗有穗发芽基因型材料(GI10%),分别为西农6028、克群、百农3217、开封124、郑州742、西昌5762、小偃5号、克壮、许跃6号和武农99,其单倍型均为Tamyb10D/Vp-1Bc。     

二倍体、四倍体小麦成熟胚组织培养研究初报

以栽培二粒小麦(Triticum dicoccum Schuble)、硬粒小麦(Triticum durum Desf.)以及普通六倍体小麦祖先种野生二粒小麦(Triticum dicoccoides Kom.)、野生一粒小麦(Triticum aegilopides Bal.)4个基因型麦属植物成熟胚(MEs)为外植体,对成熟胚愈伤组织诱导、分化及植株再生的组织培养效果做了初步研究,筛选出适合于非六倍体小麦成熟胚组织培养的基因型.结果表明,不同基因型成熟胚愈伤组织的诱导、分化及植株再生差异显著,具有很强的基因型效应和基因型依赖性.其中栽培二粒小麦的成熟胚表现出较好的组织培养特性,它的愈伤组织诱导率、分化率、成苗率以及组培效率分别为95.00%、90.00%、32.40%、27.70%,显著高于其它基因型.二倍体、四倍体小麦成熟胚组织培养特性的研究以及组织培养基因型的筛选,为遗传转化体系的建立、小麦功能基因的分离和克隆,以及小麦分子育种工作奠定了基础.     

复方中草药对凡纳滨对虾生长及非特异性免疫功能的影响

为了提高凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的生长性能和抵抗细菌性疾病的能力,将黄芪、大黄、甘草和黄芩等比例组成复方,采用连续和间断两种投喂方式评价1%中草药饵料对凡纳滨对虾的生长和非特异性免疫功能的影响。试验共分3个组,分别为D0组（基础饲料对照组）,D1组（1%中草药饲料组）,6D1-6D0组（6天投喂1%中草药饲料-6天投喂基础饲料）。试验期间在不同时间取样测定血淋巴酚氧化酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶的活性,并在14、28天分别进行副溶血弧菌感染凡纳滨对虾。结果表明：D1组对虾的增长率和相对增重率均显著高于6D1-6D0组和D0组(P＜0.05);6D1-6D0组对虾的增长率和相对增重率略低于对照组,但无显著差异(P＞0.05)。饲料中添加复方中草药可显著提高对虾免疫相关酶(PO、LSZ、SOD)活性。养殖第14、28天的弧菌感染试验结果显示：D1组的免疫保护率分别为68.3%和91.6%,6D1-6D0组的免疫保护率分别为27.2%和45.8%。说明中草药可改善对虾对弧菌性疾病的抵抗能力,并随投喂时间的增加而增强。     

牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株NS2-3区基因克隆及序列分析

【目的】对牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株NS2-3区基因进行克隆及序列分析，为阐明本病致病机理，更好的控制BVDV感染、流行提供理论依据。【方法】以牛病毒性腹泻病毒河北分离株（HB-DCZ）基因组RNA为模板，扩增BVDV HB-DCZ株基因组NS2-3片段cDNA。将PCR产物克隆后进行PCR及双酶切鉴定。克隆产物进行序列测定及分析。【结果】HB-DCZ cDNA体外扩增获得特异性条带，大小约为665bp，表明该分离毒株基因组中无插入序列。PCR产物克隆，提取重组质粒，扩增获得特异性的DNA条带，长度约为665bp，用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切，获得两条DNA片段，长度分别为2600bp和702bp左右，与理论值相符。序列测定结果表明，克隆得到的NS2-3重要区扩增片段共665核苷酸，NS2-3重要区的蛋白质由208个氨基酸残基组成。HB-DCZ毒株NS2-3重要区核苷酸序列与已公开发表的BVDV其他毒株相比的同源性依次为184株99.1%，ZM195株97.4%，Osloss株92.3%，C24V株77%，NADL株76.4%。HB-DCZ在NS2-3扩增区域中既没有外源序列的插入，也没有基因重组、重排或缺失，但存在某些核苷酸的替换。【结论】HB-DCZ与Osloss株、国内的184株、ZM195株遗传距离较近，与C24V株、NADL株遗传距离较远。HB-DCZ株应为BVDV Ib基因亚型。     

四川省丁香假单胞猕猴桃致病变种的遗传多样性分析

为明确四川省猕猴桃溃疡病菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)的遗传多样性及群组划分与地理来源的相关性。以四川省不同地理来源的40个Psa菌株为研究试材,用rep-PCR技术进行分子标记,NTSYS软件分析UPGMA聚类。3对rep-PCR检测引物(REP、ERIC和BOX)共获得42个位点,其中38个为多态位点,占90.5%。UPGMA聚类结果显示,以相似系数为0.70阀值时,40个Psa菌株被分为2个类群(Ⅰ、Ⅱ),其中85.0%的菌株属于第Ⅱ类群;在相似性系数为0.80时,第Ⅰ类又可分为2个亚类(Ⅰ-1、Ⅰ-2),第Ⅱ类则分为5个亚类(Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3、Ⅱ-4、Ⅱ-5),菌株无明显的采集地聚类。以上结果表明,四川省各地区的猕猴桃溃疡病菌菌株具有较高的遗传多样性,但其遗传变异与菌株地理来源无明显相关性。     

上海地区水稻已知品种SSR指纹图谱库构建

用24对引物构建上海地区53份水稻品种的DNA指纹图谱,为当地水稻新品种保护、遗传资源评价及亲缘关系分析提供理论依据和技术支持。结果显示,实验中共检测出109条多态性片段,变幅2~9条,平均每对引物4.5417条多态性片段,有效等位基因数为70.8187,平均每个标记2.9508个;Shannon多样性指数(Ⅰ)平均值为1.1296,变幅0.4949~1.8402;多态性信息含量(PIC)平均值为0.5415,变幅0.2656~0.8001。用24个标记建立53份材料的DNA指纹图谱,这些字符串就构成了这53份材料的“身份证号码”,本实验中,各材料的分子身份证号码是唯一的;聚类分析表明,在遗传相似系数0.21处可以将53份材料分为2个类群,分别为粳稻组和籼稻组,但是组内遗传距离较近。由此可见,上海地区水稻品种的遗传多样性相对狭窄。     

纤维素热解产物内醚糖的微生物同化与乙醇发酵测试

以纤维素的热解产物1,6-缩水-β-D-吡喃葡萄糖（Levoglucosan,简称内醚糖）为唯一碳源对89株微生物（大部分为产酒菌株）进行了同化和乙醇发酵测试,并对319份土样进行了分离纯化培养。筛选结果表明,在89株微生物中,一株Sporobolomyces酵母、一株Rhodotorula酵母、4株Rhizopus霉菌、2株Monascus霉菌有同化内醚糖的能力,但它们利用内醚糖的能力都较弱,在培养3天后,2%内醚糖的利用率低于30%;在319份土样中,发现77份土样有微生物生长,并从中分离到70株酵母和10株细菌。通过内醚糖同化比较测试,发现Y215号菌的同化能力最强,在培养3天后,2%内醚糖的利用率达到了64.12%,经鉴定为斯达油脂酵母（Lipomyces starkeyi）。然而,在所有测试和分离的微生物中,没有发现既能同化又能发酵内醚糖为乙醇的菌株。本研究为通过遗传工程方法构建发酵内醚糖为乙醇的工程菌株提供了较好的菌种资源。     

山东地区乳房炎和非乳房炎牛奶中金黄色葡萄球菌的分离鉴定与耐药分析

为了解山东地区不同类型牛奶中金黄色葡萄球菌流行情况和耐药特征,对37个牧场的乳房炎和非乳房炎奶样进行细菌分离鉴定及MIC测定试验。采用常规方法与PCR技术进行金黄色葡萄球菌的分离鉴定,微量肉汤稀释法进行MIC测定,卡方检验进行数据差异显著性分析。①共分离到150株金黄色葡萄球菌,检出率为11.26%(150/1332),且乳房炎奶样显著高于非乳房炎(P=0.009);②12种药物的MIC与EUCAST分布趋势大致相同;③分离菌株对青霉素(91.38%)耐药最严重,且乳房炎/非乳房炎奶样差异显著(P=0.047);④116株分离菌株中多重耐药(≥3)菌株为34(29.31%)株,乳房炎/非乳房炎奶样差异不显著(P=0.611);⑤威海对6种药物的耐药率在60%以上,其他地区仅对1~2种药物的耐药率在50%以上。乳房炎奶样的金黄色葡萄球菌检出率显著高于非乳房炎;分离菌株对青霉素严重耐药且乳房炎奶样多重耐药问题突出;不同地区均呈现不同程度的耐药。     

棉花黄萎病菌与品种互作的格局分析

 以23个棉花品种(系)接种18个黄萎病菌株的抗感表现(病情指数)为分析对象,在聚类分析的基础上用双标图方法研究了寄主 病原的互作格局。结果表明：23个棉花品种分为6个抗病性不同的品种组,18个菌株聚为5个致病力不同的菌株群。5031和50312组成的品种组G1对所有菌株群具有最高抗性,可作为抗黄育种的高抗质源。来自河北成安的VD25与来自江苏常熟的XS4、XS6和XS7组成的菌株群S4与G5品种组存在互作,其致病力最强,是棉花黄萎病的优势菌株群,在抗黄育种和抗黄鉴定中应予以高度重视。S2和S3菌株群与56%的参试品种构成的3个品种组间存在互作,是潜在的优势菌株群。具平均抗病性的G2品种组是黄萎病菌的优良寄主。     

向日葵核心种质资源基础类群划分研究

向日葵是一种重要的油料作物,同时也是一种潜在的能源植物,其核心种质资源基础类群的划分可为向日葵远缘杂交提供理论依据。采用形态学标记与RAPD标记相结合的方法,利用UPGMA聚类法对50份向日葵核心种质资源材料亲缘关系进行了深入研究。形态学标记法结果显示,50份供试种质资源可分为三大类群,其中第Ⅰ类群27份种质,第Ⅱ类群22份种质,第Ⅲ类群只包含1份种质,进一步研究表明,供试种质资源的种质地理分布以及用途与聚类结果关联性较强。同时,分子标记的UPGMA聚类结果也验证了上述结论;RAPD分子标记聚类法也将供试材料分为三大类群,其中第Ⅰ类群26份种质,第Ⅱ类群23份种质,第Ⅲ类群包含1份种质,形态学与RAPD聚类结果的吻合率为96.30%;形态学标记结果与RAPD标记分类结果可靠。