棉花U3和U6启动子在CRISPR/Cas9基因组编辑体系中的功能鉴定

【目的】对已克隆的海岛棉U3和U6启动子进行功能鉴定,为构建棉花CRISPR/Cas9多位点基因编辑技术体系提供更多可用的U3和U6启动子。【方法】分别构建以GbU3-2P和GbU6-7P为启动子驱动sg RNA,以抗旱负调控基因GGB为靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体,然后在新海16的棉花叶片原生质体中进行功能鉴定。通过Polymerase chain reaction方法富集构建好的CRISPR/Cas9基因编辑载体的核心片段,并利用PEG瞬时转化法将核心片段转入原生质体中。提取转化后的原生质体基因组DNA,采用酶切/Polymerase chain reaction法分析棉花GGB基因的突变情况并测序验证。最后绘制靶基因突变的频率分布图来计算该CRISPR/Cas9系统的编辑效率和确认突变的真实性。【结果】靶基因测序结果显示靶标位点序列突变的类型全部为碱基替换。【结论】以GbU3-2P和GbU6-7P为启动子的CRISPR/Cas9基因编辑体系可以成功地定点编辑棉花GGB基因的序列,引起基因突变。     

棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立

以棉花幼嫩子叶为外植体材料,分析影响棉花叶肉原生质体分离及目标基因转化的主要因素,以棉花叶肉原生质体为受体,建立稳定、高效的目标基因瞬时表达与鉴定体系。技术体系包括,选择自然生长12 d的棉花幼嫩子叶为外植体材料,混合1.5%纤维素酶、0.4%离析酶、0.5 mol L^–1甘露醇、20 mmol L^–1 KCl、20 mmol L^–1 MES、0.1 mol L^–1 CaCl₂和1.0 g L^–1 BSA等酶液,在28℃黑暗条件下振荡酶解8 h,可游离出浓度达1.0×10⁶ m L^–1以上的纯净棉花叶肉原生质体。利用该方法将棉花锌指蛋白基因GhZFP2整合到pJIT166-GFP质粒载体,构建了GhZFP2:GFP融合载体,采用40% PEG(4000)介导转化,获得高转化率的棉花叶肉原生质体。对目标基因瞬时表达产物检测表明,GhZFP2蛋白清晰定位在细胞核上。     

基于棉花U6启动子的海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑体系的建立

CRISPR/Cas9基因组编辑技术是基因功能研究的一种强有力的工具, 目前已在许多生物体中成功实现内源靶向基因的突变。利用已克隆的海岛棉新海16的2个U6启动子, 分别构建带有新海16内源基因(GbGGB和GbERA1)靶位点DNA片段的CRISPR/Cas9基因编辑载体。以新海16的胚性愈伤组织为供试材料, 制备海岛棉的原生质体。通过PCR方法大量富集构建好的CRISPR/Cas9基因编辑载体的核心片段(包括GbU6::sgRNA和CAMV35S::Cas9两部分), 并利用PEG法转化海岛棉的原生质体。对原生质体基因组DNA进行酶切后PCR, 成功检测到内源靶基因的突变现象。对PCR产物进行克隆测序, 结果显示序列突变的类型主要以碱基替换为主, 少数为碱基缺失。结果表明基于海岛棉U6启动子的CRISPR/Cas9基因编辑系统能在海岛棉中实现靶向基因编辑的功能, 为棉花功能基因组学研究提供了重要的技术基础。     

基于Cas9-Free的拟南芥ALB3基因编辑载体构建及验证

建立一种高效安全的基因定点编辑体系,为研究植物的光合作用途径以及生理代谢过程提供理想材料。针对拟南芥靶基因ALB3设计2个sgRNA,引导Cas9蛋白识别PAM位点,从而实现ALB3基因的大片段敲除;将荧光筛选标记基因mCherry组装到CRISPR/Cas9载体中,构建一种带有荧光筛选标记的CRISPR/Cas9载体;利用农杆菌转化法转化拟南芥,对其后代进行筛选验证,在倒置荧光显微镜下挑选便可获得Cas9-Free的纯合突变种子。测序结果表明,含有可视化筛选标记基因的拟南芥ALB3基因编辑载体序列与预期一致,由此证明载体构建成功;通过倒置荧光显微镜观察,发现阳性转化拟南芥T_0种子含有红色荧光标记,表观观测以及分子鉴定表明T_1植株得到纯合突变后代,条带大小小于野生型,白化突变性状明显。挑选T_1不含荧光的种子进行培育得到的T_2植株,经分子鉴定发现已成功实现Cas9-Free且植株白化。本研究成功构建了一种带有荧光筛选标记且可实现拟南芥ALB3基因敲除的CRISPR/Cas9载体,并获得Cas9-Free的纯合突变植株,为拟南芥基因高效编辑载体的构建以及Cas9-Free基因编辑后代的获得提供了借鉴与参考。     

靶向BnSVP的CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建

基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术是一种新兴的分子修饰工具,可实现基因组特定位点碱基的缺失、插入或替换,造成基因功能丧失,现已广泛应用于基因功能的研究。为深入探讨甘蓝型油菜中Bn SVP的生物学功能,以中双11号基因组(甘蓝型油菜参考基因组,v4.1)中的4个Bn SVP为靶标基因,并针对不同染色体上的Bn SVP基因,应用CRISPR-P 2.0软件共设计了12条特异sg RNA种子序列,以实现4个Bn SVP同源基因的全部或部分敲除;以p YLCRISPR-Cas9P35S-H为基本载体,以At U3b或At U3d为sg RNA转录启动子,采用Golden gate cloning技术分别组装构建了6个双靶点CRISPR/Cas9植物表达载体。测序结果表明,6个CRISPR/Cas9植物表达载体各sg RNA表达盒DNA序列正确,双靶点组装顺序无误。研究结果为进一步原生质体瞬时表达和农杆菌介导的油菜遗传转化奠定了基础,同时也为应用CRISPR/Cas9基因组编辑系统研究植物多拷贝同源基因的功能提供参考。     

热研4号王草原生质体的制备

开展原生质体融合育种以及利用原生质体瞬时表达系统进行分子生物学实验的前提和基础是建立高效、有活力的原生质体制备体系。为建立热研4号王草原生质体制备体系,本研究以热研4号王草叶片为原生质体制备的外植体,将切成细丝的热研4号王草幼叶置于含2.0%纤维素酶+0.5%果胶酶Y-23+0.5%崩溃酶+0.6 mol/L甘露醇+40 mmol/L KCl+6 mmol/L MES,p H 5.7+20 mmol/L Ca Cl2+0.15%BSA的酶液中,在避光条件下置于50 r/min的摇床酶解6~8 h,获得了大量有活力且均匀一致的原生质体。经过荧光素双醋酸酯(fluoresceindiacetate,FDA)染色和Western blot检测目的蛋白表达,结果发现采用酶解法制备的热研4号王草原生质体活力可达75%,且可用于表达拟南芥外源蛋白。本研究可为下一步利用热研4号王草开展分子生物学研究奠定基础。     

山丹原生质体的分离条件探究

本研究旨在建立山丹高效原生质体分离体系,为山丹种质资源的有效利用提供科学依据。以山丹鳞茎胚性愈伤组织为材料,通过酶解法获得山丹原生质体,进一步采用3因素4水平L16(34)正交试验,对原生质体分离条件进行优化研究。结果表明:(1)在预处理条件下(0.015 g/mL纤维素酶+0.005 g/mL果胶酶+0.65 mol/L甘露醇)得出最佳酶解时间为6 h,产量为3.47×106个/g。(2)对正交试验结果进行极差分析,确定原生质体产量主次因素为纤维素酶浓度果胶酶浓度甘露醇浓度,同时得到最佳酶组合为0.02 g/mL纤维素酶、0.008 g/mL果胶酶,最佳渗透压浓度为0.6 mol/L甘露醇,原生质体产量最高为3.47×106个/g,活性为60.32%。(3)在最佳酶组合处理下,采用暗处理可将原生质体活性提高到76.15%;在15 min、1000 r/min时,原生质体产量最高,为3.51×106个/g;在10 min、800 r/min时,原生质体活性最高,为61.2%。试验获得了山丹原生质体最佳分离条件,建立原生质体分离体系,可为山丹种质资源的有效利用提供参考。     

CRISPR/Cas9植物基因编辑系统敲除棉花GhSBP基因表达载体的构建

基因编辑技术是研究基因功能的一个有效工具。CRISPR/Cas9系统是基于细菌Ⅱ型免疫系统改造而成的一种全新的基因编辑系统。因其相对于ZFNs、TALENs更加简单高效,适用于普通分子生物学实验室。各种植物特异的CRISPR/Cas9载体被构建并快速应用于多种植物中。本实验以棉花GhSBP基因为编辑对象,构建了CRISPR/Cas9系统敲除GhSBP基因的表达载体,并利用农杆菌介导法转化棉花,以期获得敲除GhSBP基因的棉花转基因株系。     

洋葱愈伤原生质体分离和纯化研究

建立高效原生质体分离和植株再生体系是进行体细胞杂交的基础性工作。以洋葱多次继代的愈伤组织为研究试材,对原生质体分离纯化技术进行研究。结果表明：2.0%纤维素酶Onozuka R-10+0.1%果胶酶Y-23+0.5%离析酶 R-10+0.60 mol/L甘露醇+CPW+0.1% MES的酶液,酶解6 h,洋葱原生质体分离效果最好。纯化时,适当降低离心力的短时间离心有利于原生质体纯化过程中产量和活力的保持,以600 r/min离心5 min效果为好。     

山丹丹原生质体的分离条件探究

[目的]本研究旨在建立山丹丹高效原生质体分离体系,为山丹丹种质资源的有效利用提供科学依据。[方法]以山丹丹鳞茎胚性愈伤组织为材料,通过酶解法获得山丹丹原生质体,进一步采用3因素4水平L16(3⁴)正交试验 。[结果]结果表明：(1)在预处理条件下(0.015 g/mL纤维素酶+0.005 g/mL果胶酶+0.65 mol/L甘露醇)得出最佳酶解时间为6 h,产量为3.47×10⁶个/ mL；(2)对正交试验结果进行极差分析,确定原生质体产量主次因素为：纤维素酶>果胶酶浓度>甘露醇浓度,同时得到最佳酶组合为0.02 g/mL的纤维素酶浓度、0.008g/mL的果胶酶浓度和最佳渗透压浓度为0.6 mol/L甘露醇,原生质体产量最高为3.47×10⁶个/ mL,活力为60.32%；(3)在最佳酶组合处理下,采用暗处理可将原生质体存活率提高到76.15 %；在15 min、1000 r/min时,原生质体产量最高,为3.51×10⁶/mL；在10 min、800 r/min时,原生质体活力最高,为61.2 %。 [结论] 该试验获得了山丹丹原生质体最佳分离条件,建立原生质体分离体系,为山丹丹种质资源的有效利用提供研究奠定基础。     

Design of Excitation Control System of A.C.Excited Generator

Dual-passage excitation control method based on dynamical synchronous reference frame is analysed according to the base theory of A.C. excited generator. Using the dual-CPU project basing on the high speed DSP, excitation control system of A.C. excited generator is realized. Considering the characteristic of this control system, taking full advantage of the high speed and the convenient peripherals of DSP, the hardware and software of the control system are designed appropriately. Dual-passage excitation control system is realized using the dual-CPU method. Dual-passage excitation control strategy based on dynamic synchronous reference frame is proved with the experiment.     

青葙高效再生体系的建立

以青葙茎段为外植体建立高频再生体系,探讨不同激素配比对青葙不定芽诱导、继代增殖和不定根诱导的影响。结果表明:青葙茎段外植体诱导培养基为MS+6-BA(2mg/L)+IBA(0.5mg/L),诱导率为100%;继代增殖培养基为MS+6-BA(2mg/L)+IBA(0.01~0.02mg/L),不定芽增加3~5个;不定根诱导培养基为1/2MS+NAA(0.5mg/L)+IBA(0.5~1.0mg/L),诱导率高达100%;组培苗移植到盛有细沙的花盆中,成活率为100%。     

黄瓜离体器官再生体系的优化

优化通过器官直接再生方式的黄瓜离体再生体系,为遗传转化奠定基础。以‘长春密刺’黄瓜的子叶节为外植体,探讨在黄瓜再生过程中,适宜的无菌苗获得培养基、适宜的外植体类型、无菌苗的适宜苗态、不定芽诱导培养基和芽伸长培养基中适宜的激素组合与比例。结果表明,最适的无菌苗获得培养基为1/2MS+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂(pH=5.8);不同外植体的再生率为子叶节>下胚轴>子叶;子叶完全出壳但未展平的无菌苗比其他苗态的再生率高,子叶展平后,再生率迅速下降;当6-BA（6-苄基氨基嘌呤）和ABA（脱落酸）浓度一定时,最适的AgNO₃为2 mg/L;当AgNO₃浓度一定时,6-BA和ABA浓度的最佳组合为1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ABA;不定芽诱导的最适培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ABA+2 mg/L AgNO₃,出芽率为90%,每外植体出芽数为3.5;芽伸长培养基中加入0.10 mg/L 6-BA,能够促进再生芽的伸长。本研究成功优化了黄瓜的再生体系,得到了健壮的黄瓜成株。     

仙茅属植物SRAP-PCR反应体系的优化

通过单因子和双因子实验对仙茅属植物SRAP-PCR反应体系中主要成分(Mg2 、dNTP、引物、模板和Taq DNA聚合酶)进行优化,并比较了琼脂糖凝胶电泳与非变性PAGE电泳的检测效果.建立了适合仙茅属植物SRAP分析的反应体系:25 μL体系中内含1×PCR buffer、2.0 mmol/L Mg2 、250 μmol/L dNTP、0.2 μmol/L引物、40 ng模板、1 U Taq酶.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率较高且带型清晰,能更准确反映仙茅属植物间的差异.优化的反应体系可以用于仙茅属植物的SRAP分析.     

广西特有植物小花异裂菊ISSR-PCR反应体系的建立

以小花异裂菊的叶片为材料,采用正交和单因素试验研究Mg2+、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA浓度对ISSR-PCR扩增效果的影响。建立了适宜于小花异裂菊的ISSR-PCR反应体系,即25μL的体系中含Mg2+1.5 mmol/L,dNTP 0.20 mmol/L,TaqDNA聚合酶1.5 U,引物0.8μmol/L,模板DNA 50 ng,10×Buffer 2.5μL。该体系稳定、可靠,为利用ISSR分析小花异裂菊遗传多样性等工作奠定了良好的基础。     

叶用莴苣TRAP 反应体系的建立

以叶用莴苣为试材,采用正交设计和单因素试验2种方法研究叶用莴苣TRAP反应体系中Mg^2＋、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物等4个因素的浓度变化对扩增结果的影响,建立最佳反应体系。结果表明：TRAP-PCR反应最优体系是在20μL反应体系中含DNA模板60～100 ng、10×PCR buffer（Mg^2＋free）2μL、Mg^2＋终浓度2.0 mmol/L、Taq DNA聚合酶含量1.0 U、dNTPs终浓度0.2 mmol/L、引物终浓度0.75μmol/L。该体系对叶用莴苣种质的扩增结果稳定,条带清晰度高且多态性丰富,可用于对叶用莴苣种质资源的遗传多样性分析和亲缘关系鉴定。     

Reliability Research on D.C. Broad Control System of Cadmium Nickel Accumulator

Based on the D.C. board working principles of cadmium nickel accumulator, in this paper several operating connection modes are analyzed when D.C. board is working under the system fault status. An improved method of control circuit which can reliably cut out faults in unreliable operating mode is proposed.     

苦瓜ISSR-CR反应体系的建立

以苦瓜（Momordica charantia L．）为试材，研究了PCR反应体系的主要成分及退火温度、循环次数对苦瓜ISSR扩增结果的影响。结果表明：在20μl的反应体系中，Mg^2＋的用量为1．2—1．6mmol／L，dNTPs浓度为0．2mmol／L，引物的浓度为0．25μmol／L，Taq DNA聚合酶的用量为1u，模板DNA的用量为30～50ng，在46．4—51.7℃的退火温度下35个循环，能得到清晰、多态性高的ISSR带谱。     

亚洲棉再生体系研究进展

亚洲棉具有优良的遗传学特性,是进行棉属基因组学和遗传工程研究的主要材料,但其作为遗传工程基础的再生体系目前尚未完善。虽然早在20世纪70年代已开展了许多研究,但是由于亚洲棉自身特点其再生体系很难建立,仅停留在愈伤组织的诱导阶段,直至最近才取得了少量突破性的进展,获得了再生植株。亚洲棉愈伤组织是四个栽培种中较容易诱导的,但是诱导出的愈伤组织生长状态不佳,其分化和再生困难,解决的办法主要是调整激素的种类与浓度,适当改变培养方法和培养条件。