巨菌草内生固氮菌Klebsiella variicola GN02的毒理性与固氮能力

为了研究巨菌草内生固氮菌(Klebsiella variicola)GN02的毒理性与固氮能力,通过小鼠经口毒性和大鼠经皮毒性试验,并以克雷伯菌(K.pneumoniae)特异性引物对GN02菌株进行血清型分型。结果表明,GN02菌株无明显的经口毒性和经皮毒性,不是临床上流行肺炎克雷伯氏菌已有分型的强毒力菌株;GN02菌株在不同生长时期巨菌草根茎叶中均具有一定的固氮能力,其在各成熟期固氮率可达15%～27.27%,与其他禾本科植物所报道的固氮菌固氮效率基本相当。总之,GN02菌株安全、无毒,具有一定的固氮能力,可在农业生产中使用。     

甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E nifH基因的克隆与序列分析

【目的】了解甘蔗内生固氮菌变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）DX120E nif H基因的生物信息学,为揭示甘蔗内生固氮菌DX120E的固氮分子机理提供理论依据。【方法】根据NCBI上其他固氮菌株的nif H序列设计引物,对内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E菌进行PCR扩增;运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列进行分析,并对其蛋白结构进行预测。【结果】甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E nif H基因的ORF为882bp,Gen Bank登录号为KF732646.1,与Klebsiella pneumoniae 342、Klebsiella variicola At-22等6种固氮菌的nif H基因氨基酸序列同源性高达95.0%-99.0%。DX120E nifH蛋白与Klebsiella pneumoniae 342的亲缘关系最近,与非克雷伯氏菌固氮菌的亲缘关系较远。生物信息学分析显示,菌株DX120E的nif H基因编码293个氨基酸,起特别重要的氨基酸残基非常保守。该基因在N端有11个氨基酸残基即酪氨酸—甘氨酸—赖氨酸—甘氨酸—甘氨酸—异亮氨酸—甘氨酸—赖氨酸—丝氨酸—苏氨酸—苏氨酸,其属于典型结合ATP的基序结构。nif H蛋白分子量为32.07k D,pI为4.92,为酸性蛋白;其具有2个ASN糖基化位点,1个CAMP磷酸化位点,6个CK2磷酸化位点,6个PKC磷酸化位点。疏水性预测显示该蛋白为亲水性蛋白,无信号肽。【结论】变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）DX120E nif H基因的推导氨基酸序列与克雷伯氏菌固氮菌属具有较高的同源性,该基因在甘蔗生物固氮过程中可能起重要作用。     

巨菌草根内生固氮菌Klebsiella variicola的分离、鉴定及培养条件的优化

采用Ashby和Nfb无氮培养基从巨菌草成熟期根部分离得到1株具有高效固氮性能的内生固氮菌GN02,其在分离的菌落中所占比例最高,且酶活性较高.经16S rDNA序列鉴定,该菌株与克雷伯氏菌属各菌株同源性关系可达99%,结合其形态、生理生化特征,初步鉴定为变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola).在含氮源的KP培养基中菌株GN02的生长情况明显优于无氮源的Ashby培养基.菌株GN02在KP培养基中的最优培养条件为:温度37.1℃,pH 5.6,蔗糖25.6 g·L~(-1),在此条件下其D_(600 nm)能达到1.48,比优化前提高了22.31%.响应面优化所得到的培养条件重复性好,准确、可靠.     

氮对巨菌草内生固氮菌Klebsiella variicola GN02 nifH基因表达的影响

采用DNA电泳、qRT-PCR及Western blot技术分析了在无氮和含氮培养条件下,巨菌草内生固氮菌Klebsiella variicola GN02菌株nifH基因序列长度、基因与蛋白表达量的差异.结果表明,GN02菌株在无氮及含氮条件下均有nifH基因表达,其克隆得到的nifH基因与同属禾本科的甘蔗的nifH基因亲缘关系较近;无氮培养条件下nifH基因和蛋白表达量明显高于含氮条件下的表达量.表明无氮条件能诱导GN02菌株nifH基因表达量的增加,而氮源抑制nifH基因的表达.     

一株巨菌草内生细菌的鉴定及其促生特性初步分析

以巨菌草为材料,采用组织块分离法、划线分离法筛选内生细菌,采用Salkowski比色法筛选具有分泌植物生长素(IAA)能力的菌株,同时采用钼锑抗比色法测定其溶磷能力、Ashby培养基验证其固氮潜能、CAS方法检测其产生铁载体能力,通过生理生化鉴定和16S rDNA分子生物学鉴定相结合的方法鉴定优良菌株的分类地位。结果表明:从巨菌草中筛选出86株内生细菌,其中菌株YA-6的产IAA能力最高(11.73 mg/L),且具有溶磷、固氮和产铁载体的能力,溶磷量为7.103 mg/L。菌株YA-6菌体杆状,呈革兰氏阴性,结合16S rDNA基因序列相似性分析鉴定属假单胞菌属,与Pseudomonas hunanensis同源性最高(99.36%)。巨菌草内生菌YA-6具有多种促生特性,具有开发为微生物农药的潜力。     

小麦DHAR基因的克隆及生物信息学分析

以电子克隆和RT-PCR克隆获得了1个小麦脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因,并对其编码的蛋白质序列进行了生物信息学分析.结果表明,该基因cDNA序列长1 187 bp,编码263个氨基酸,蛋白质分子量为28 908.2 Da,PI为6.84;具有GST-N家族和GST-C-DHAR结构域,分别属于硫氧还蛋白超家族和GST-C末端超家族;该蛋白序列无信号肽,是亲水性蛋白,定位于细胞质叶绿体中,二级结构中以无规则卷曲(40.30％)和α螺旋(37.64％)为主,并含有少量的片层结构(17.11％);该蛋白序列与大麦、二穗短柄草、玉米、水稻、拟南芥的同源蛋白序列相似性较高,其中与大麦胞质DHAR(BAJ97007.1)蛋白进化距离最近.     

猪LBP基因电子克隆及生物信息学分析

利用电子克隆技术,以人脂多糖结合蛋白（LBP）基因（NM₀04139）为种子序列,克隆猪LBP基因。结果表明:所克隆的LBP基因开放阅读框长为1 446bp,编码481个氨基酸。推导其氨基酸序列与人、小鼠、大鼠、牛、狗的相似性分别为74.2%、64.8%、63.2%、77.1%和74.6%。进化树分析显示,猪与牛LBP基因进化距离最近,与大鼠最远。生物信息学分析表明,所克隆的猪LBP蛋白分子大小为53.036 7ku,理论等电点为6.43;亚细胞定位预测猪LBP属于分泌蛋白,主要在线粒体（44.4%）和高尔基体（22.2%）中表达;N端存在信号肽,且在25～26位氨基酸可能存在裂解位点。N端的疏水性较强,且位于信号肽处,最大疏水性值为2.478,最大亲水性值为1.956;由胞外区（1～6位氨基酸）、跨膜区（7～29位氨基酸）和胞内区（30～481位氨基酸）3个部分组成的膜蛋白,有9个Ser、8个Thr和2个Tyr,可能成为蛋白激酶磷酸化的位点;LBP膜外区蛋白由多个α螺旋,膜内区由多个β折叠构成,α螺旋和β折叠平行交替排列,构成一个弯曲螺旋状结构;在33～256和271～474位氨基酸残基之间分别有1个BPI1和BPI2的保守结构域。     

鹰嘴豆LHY基因cDNA克隆及生物信息学分析

从鹰嘴豆中克隆生物节律钟LHY基因的cDNA全长序列,进行序列信息学分析。通过同源克隆策略,利用RT-PCR技术获得核心片段,结合5＇-RACE和3＇-RACE技术,克隆得到鹰嘴豆生物节律钟基因LHY的cDNA全长序列,其核苷酸序列长度为3 061 bp,包括2 220 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码739个氨基酸。验证后命名为CarLHY基因,获得基因登录号为KJ558378。生物信息学研究表明CarLHY基因cDNA序列与其他植物LHY基因具有较高的相似性;预测CarLHY蛋白不具有跨膜结构;为转录因子,定位于细胞核中;不具备信号肽。对CarLHY蛋白功能结构域预测表明,蛋白质核心结构存在符合转录因子与DNA结合的常见功能域HTH。蛋白系统进化树显示,与大豆分子进化距离最近,其次是黑杨、拟南芥。     

临武鸭PRL基因的克隆及生物信息学分析

采用高通量Solexa测序技术获得临武鸭PRL基因全序列,并对该序列进行了生物信息学分析.结果表明:临武鸭PRL基因全序列长度为6 390 bp(GenBank序列号为JQ677091),包含5个外显子和4个内含子,编码229个氨基酸.聚类分析发现,临武鸭与绿头鸭亲缘关系最近,与鹅、鸡、鹌鹑等次之,与鱼类亲缘关系最远.这些研究结果提示,PRL基因全序列适合于动物物种间系统进化关系的分类研究,可为进一步了解PRL基因的特性、物种演化、蛋白质生物学功能等提供理论依据.     

中华蜜蜂蜂毒明肽基因克隆及生物信息学分析

【目的】掌握中华蜜蜂蜂毒明肽基因的生物信息,为进一步深入研究其生理功能及通过生物工程技术生产蜂毒明肽产品奠定基础。【方法】采用PCR技术克隆中华蜜蜂蜂毒明肽基因,并对所获得的基因组序列进行详细的生物信息学分析。【结果】从蜜蜂头部和胸部组织中成功扩增获得511bp的蜂毒明肽基因序列,该序列GC碱基含量仅为24%,包含一个141bp的开放阅读框,编码46个氨基酸残基;该序列与肥大细胞脱颗粒肽的同源性高达58%,存在较明显的信号肽序列和跨膜区结构。【结论】蜂毒明肽是一种小分子抗菌肽,存在较明显的信号肽序列和跨膜区结构,具有生物抗菌肽的典型特性,但需进一步加工切除信号肽序列后才能发挥作用。     

石斛内生菌SH-1 PQQ基因的克隆与生物信息学分析

从石斛内生菌变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1中PCR扩增得到吡咯喹啉醌(PQQ)基因,其大小为5 444 bp,包含了pqqABCDEF 6个基因,并对PQQ基因进行了生物信息学分析,为下一步构建高效基因工程菌,研究其生物合成途径奠定了基础。     

三黄鸡MAVS基因克隆及生物信息学分析

[目的]掌握三黄鸡线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)基因的生物信息学,为MAVS基因诱导表达及禽类固有免疫相关机制研究打下基础.[方法]根据GenBank中已公布的原鸡MAVS基因序列设计1对特异性引物,采用RT-PCR扩增三黄鸡MA VS基因,并应用相关生物软件进行序列分析及其蛋白结构预测.[结果]三黄鸡MAVS基因编码区(CDS)全长1926 bp,编码641个氨基酸,与GenBank中已发表的原鸡MAVS氨基酸序列(NP 001012911.1)比对,三黄鸡MAVS氨基酸序列在第440、488、506和606位存在4个氨基酸差异,分别为440A→T、488P→L、506I→L和606E→K.三黄鸡MA VS基因与原鸡的相似性最高,达99.0%;与日本鹌鹑的相似性次之,为91.0%;与斑马鱼的相似性最低,仅37.6%.三黄鸡MAVS蛋白分子质量为67.79ku,理论等电点(pI)为5.04,属于跨膜蛋白,无信号肽序列;其二级结构中折叠占0.5%,无规则卷曲占88.7%,螺旋占10.8%.[结论]三黄鸡MA VS基因序列表现出高度的保守性,可作为今后研究三黄鸡抗病毒机制的重要指标之一.     

澳洲坚果MYB1基因克隆及生物信息学分析

[目的]从澳洲坚果(Macadamia integrifolia)叶片中克隆MYB1转录因子基因(MiMYB1)并进行生物信息学分析,为揭示R2R3-MYB家族转录因子成员在澳洲坚果中的抗逆作用机制提供参考依据.[方法]利用PCR从澳洲坚果品种桂热一号叶片中克隆MiMYB1基因,采用ProtParam、TMHMM Server v.2.0和SMART:Main page等在线分析软件对MiMYB1蛋白进行生物信息学分析,运用DNAMAN 7.0进行蛋白氨基酸多序列比对分析,并从NCBI中选取126个拟南芥R2R3-MYB家族成员,以Geneious Pro v4.8.4中的邻接法(Neighbor-joining,NJ)构建系统发育进化树.[结果]从澳洲坚果品种桂热一号叶片中克隆获得的MiMYB1基因序列全长1205 bp,包含1062 bp的开放阅读框(ORF),共编码353个氨基酸,GenBank登录号为MN254975.MiMYB1蛋白具有2个SANT保守结构域,属于R2R3-MYB家族,是无跨膜结构、无信号肽且定位于细胞核的不稳定亲水性蛋白.MiMYB1氨基酸序列(MN254975)与荷花NnMYB39氨基酸序列(XP_010277911.1)的亲缘关系最近,相似性为71.81%;与哥伦比亚锦葵HuMYB102-like(XP_021293847.1)、榴莲DzMYB102-like(XP_022777375.1)、木薯MeMYB102-like(XP_021596793.1)和高山栎QsMYB102-like(XP_023877052.1)的MYB氨基酸序列相似性分别为67.47%、68.63%、64.44%和67.28%.MiMYB1蛋白与126个拟南芥R2R3-MYB家族成员的系统发育进化分析结果显示,MiMYB1与AtMYB41的亲缘关系最近,与AtMYB41、AtMYB74和AtMYB102同属于S11亚族,具有相似的生物学功能,即与植物抗逆性功能相关.[结论]MiMYB1是典型的植物R2R3-MYB转录因子,在澳洲坚果的抗逆反应中发挥作用.     

白背飞虱海藻糖酶Treh-2基因克隆及生物信息学分析

利用同源克隆及RACE方法,从白背飞虱Sogatella furcifera中克隆获得海藻糖酶基因(Treh-2)全长cDNA序列(GenBank登录号:JX204291),该基因全长为2 065 bp,包含73 bp 3,UTR和150 bp5,UTR,开放阅读框(ORF)为1 842 bp,编码613个氨基酸.该基因预测蛋白分子质量为70.45 ku,等电点为5.65,有5个预测糖基化位点,有1个信号肽结构.进化分析结果显示,白背飞虱海藻糖酶Treh-2与其他昆虫海藻糖酶Treh-2同源性较高,与灰飞虱相比,同源性为95％,与褐飞虱相比较,同源性为93％.海藻糖酶Treh-2基因克隆和比较分析为进一步深入研究白背飞虱迁飞能力与能量代谢具有重要意义.     

黑木耳多巴色素异构酶基因的克隆与生物信息学分析

以黑木耳菌株Mn150 DNA为模板,设计特异性引物,对多巴色素异构酶基因进行克隆,该基因生物信息学分析结果表明,多巴色素异构酶基因序列长度为355 bp,编码112个氨基酸,分子质量为13.05 kDa,分子式为C584H921N181O153S4,等电点为10.35,为亲水性蛋白.该蛋白含有1个4-Oxalocro...     

玉米内生联合固氮菌的分离与鉴定

试验对玉米内生固氮菌进行分离、鉴定,并研究内生细菌与玉米的联合固氮活性。结果表明,从玉米中分离出5株具有联合固氮活性的菌株,分别为1株弯曲假单胞菌NFR19(Pseudomonas geniculata),2株产酸克雷伯氏菌NFL28与NFSt18(Klebsiella oxytoca),1株节杆菌NFR7(Arthrobacter sp.),1株纤维化纤维菌NFR10(Cellulosimicrobium cellulans)。研究首次分离出具有固氮活性的纤维化纤维菌,并证实节杆菌具有固氮活性。从环境中筛选新的玉米内生固氮菌资源,促进玉米生长,为玉米内生联合固氮细菌的应用奠定基础。     

刺五加GAPDH 基因全长cDNA 的克隆与生物信息学分析

采用cDNA末端RACE技术,从刺五加叶片中克隆到GAPDH基因cDNA的全长序列,并运用生物信息学方法对该基因的cDNA序列、保守区、氨基酸序列、亲缘关系等特征进行分析,并预测其编码蛋白质的结构和功能.研究结果表明,刺五加GA PGH基因的cDNA全长为1 437 bp,开放阅读框全长为1 023 bp,编码一个具有340个氨基酸残基的蛋白,蛋白分子质量为37.070 ku,理论等电点(pI)为7.71.刺五加GAPDH蛋白不存在跨膜结构域,定位于细胞质中,属于亲水蛋白.