hpaXm和hpaXm-IP基因对棉花角斑病菌V8表型及HR的影响

试验前期通过构建相应敲除载体,采用电转化的方法,分别获得Xanthmonas.citri subsp.malvacearum(简称Xcm)菌株的hpaXm基因缺失突变菌株V8ΔhpaXm和hpaXm-IP基因缺失突变菌株V8ΔhpaXm-IP。通过特殊生长平板及烟草接种试验表明,与V8菌株相比,突变菌株胞外多糖产量以及胞外纤维素酶、脂酶活性不变,V8ΔhpaXm菌株的胞外淀粉酶活性显著降低;3种菌株都不能产生胞外蛋白酶;突变菌株在烟草上形成的坏死斑面积变小。表明hpaXm和hpaXm-IP基因与病菌胞外淀粉酶活性及病菌激发烟草过敏反应的能力有关,与胞外多糖、纤维素酶、蛋白酶和脂酶产生无关。同时预示了hpaXm-IP可能具有牵引HpaXm蛋白泌出的能力,且HpaXm蛋白不是V8菌株中唯一激发烟草HR的活性物质,hpaXm及hpaXm-IP可能会影响V8菌株的致病性,但不是必然的。     

玉米大斑病菌丝氨酸蛋白酶基因StSp8的克隆、原核表达及其表达模式分析

为了探究玉米大斑病菌丝氨酸蛋白酶基因StSp8的结构特征及其功能,本研究以玉米大斑病菌野生型菌株01-23的cDNA为模版,克隆该基因CDS序列并进行生物信息学分析;构建原核表达载体pET30a-StSp8,在大肠杆菌BL21(DE3)中以IPTG诱导表达目的基因,通过SDS-PAGE技术检测目的蛋白的表达情况;利用qRT-PCR技术检测StSp8基因在不同发育时期和侵染时期的表达量变化。结果表明,丝氨酸蛋白酶StSp8的CDS序列由1602个核苷酸组成,编码533个氨基酸;其编码蛋白包含信号肽结构域、Inhibitor-I9结构域和Peptidase-S8结构域;SDS-PAGE结果显示该蛋白大小为57.18kD;表达模式分析发现,该基因在病菌发育的菌丝、分生孢子、芽管、附着胞和侵入钉5个典型的发育时期均有表达,其中芽管时期表达量显著升高;StSp8基因在侵染玉米24 h的表达量最高,72 h表达量下降。该研究不仅明确了StSp8基因的结构特征及在病菌生长发育及侵染寄主过程中的表达模式,也为深入揭示其功能奠定了基础。     

拮抗香蕉枯萎病菌的海洋细菌TC-1发酵条件优化

通过对6种培养基进行筛选得到海洋拮抗细菌TC-1在BPDB培养基发酵的无菌发酵液对香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)的抑菌活性最好。在BPDB培养基基础上,通过正交试验优化培养基成分及用量,得到最佳配方为马铃薯200 g,牛肉膏20 g,葡萄糖20 g,玉米粉7 g、蛋白胨7 g,蒸馏水1 000 mL,pH自然;通过正交试验对发酵条件的装瓶量、培养温度、初始pH、发酵时间和转速5个因素进行了优化,得到最优发酵条件为:装瓶量20%,培养温度27℃,初始pH自然,发酵时间72 h,摇床转速200 r/min;在最佳培养基和最佳发酵条件下,TC-1的无菌发酵液抑菌圈直径为24.3 mm,与优化前抑菌圈直径20.7 mm相比,抑菌活性提高了17.4%。     

棉角斑病对棉花苗、蕾期危害的研究

 近年来,对不同类型棉田角斑病危害调查和以海岛棉为主地病害发生研究,角斑病[Xanthomonas Campestris PV.malvacearum(Smith) Dye]对棉花的危害,以苗、蕾期的顶腐、茎腐最为严重,造成顶梢和茎部黑腐的途径,主要是病菌在棉株组织内的系统侵染。棉子播种试验,毛子播种的棉苗在子叶期就出现病症,脱绒光子的棉苗在真叶3～4片时才出现病害。脱绒光子带有少量的病菌,仍是病害的侵染源,在多雨的气候条件下,可以通过系统侵染和再侵染造成严重危害。     

野油菜黄单胞菌的HpaA基因功能

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.Campestris,Xcc)是使十字花科植物产生黑腐病的重要病原细菌。Xcc通过Ⅲ型分泌系统分泌效应蛋白到植物体内帮助Xcc的侵染和繁殖。Hpa A蛋白是一个广泛存在于黄单胞菌中的效应蛋白,在辣椒斑点病菌(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria,Xcv)中,Hpa AXcv85-10已经被证明是一个Ⅲ型效应蛋白,并且参与其他效应蛋白的分泌过程,但是在Xcc中,对Hpa A的功能还不是了解得很清楚。本研究以Xcc8004菌株的Hpa A蛋白为研究对象,通过分泌蛋白检测和亚细胞定位分别研究Hpa AXcc8004是否也由Ⅲ型分泌系统分泌以及Hpa AXcc8004在植物细胞的作用部位。结果表明,Hpa AXcc8004的分泌依赖于Xcc8004的Ⅲ型结构基因hrc V,暗示着Hpa AXcc8004也是作为Ⅲ型分泌效应蛋白来发挥功能。在拟南芥原生质体细胞中,将Hpa AXcc8004与GFP蛋白融合表达,发现Hpa AXcc8004定位于植物细胞核中。进一步通过同源重组的方法获得了Xcc8004 Hpa A基因缺失突变体,在寄主甘蓝、萝卜、拟南芥上分别接种野生型Xcc8004和Hpa A基因缺失突变体,发现基因缺失突变体毒性显著降低,表明Hpa AXcc8004在上述寄主植物上对于Xcc8004的完整毒性是必须的。在Hpa A的拟南芥转基因植株上,Hpa AXcc8004还可以减弱假单胞菌DC3000和Xcc8004发黄的表型。     

几种杀菌剂对柑橘溃疡病的药效测定

[目的]筛选出对柑橘溃疡病有较好防效的杀菌剂。[方法]选用77%多宁600倍、80%金纳海600倍、3%克菌康800倍、77%多宁600倍＋柔水通3 000倍、80%金纳海600倍＋柔水通3 000倍、3%克菌康800倍＋柔水通3 000倍液等单、混剂,进行田间药效测定。[结果]所有参试药剂对柑橘溃疡病的防效均达48.00%以上,而添加农药增效剂后的防效显著高于单剂（P〈0.05）,其中以80%金纳海600倍＋柔水通3 000倍和3%克菌康800倍＋柔水通3 000倍对柑橘溃疡病的防效最好,其对叶部溃疡和果实溃疡的防效分别达77.00%和79.00%以上。[结论]80%金纳海600倍＋柔水通3 000倍和3%克菌康800倍＋柔水通3 000倍2种混剂在田间表现良好,推荐在生产上用于柑橘溃疡病的防治。     

甘蓝黑腐病菌XC_3374基因功能的初步探究

【目的】初步探究XC_3374基因在甘蓝黑腐病菌Xcc8004中的功能,为深入研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004中L-天冬酰胺酶的功能奠定基础。【方法】从KEGG数据库内获取XC_3374基因的旁侧序列,通过常规PCR对其进行克隆,同时利用自杀质粒pK18mobSacB通过同源双交换的方法构建了其缺失突变体DM3374并检测其表型。【结果】以引物D3374L-F/D3374R-R扩增,野生型菌株能够扩增出1789 bp的DNA片段,而候选突变体菌株能扩增出1367 bp的片段;以内部引物3374F/3374R扩增,野生型菌株能扩增出332 bp的片段,而候选突变体菌株不能扩增出任何片段,表明目标基因已缺失,缺失突变体DM3374构建成功。平板检测法结果表明,XC_3374基因突变后不影响胞外多糖及胞外酶的合成与分泌。在MMX基本培养基上,突变体菌株能够正常生长,形成的菌落大小与野生型菌株基本相同,表明缺失突变体不是营养缺陷性。游动平板检测结果表明, XC_3374缺失突变体的运动能力比野生型稍强,但差别不明显。采用剪叶法检测缺失突变体的致病性,结果表明,野生型Xcc8004和缺失突变体DM3374 病斑平均长度分别为13.000和11.983 mm,两者致病性无显著差异。【结论】XC_3374基因突变体在胞外多糖、几种胞外酶的合成与分泌、致病性等各种表型与野生型基本一致。     

野油菜黄单胞菌8004α-淀粉酶酶学性质研究

对野油菜黄单胞菌的α-淀粉酶进行了定位,确定该酶为胞外酶,且只有一型α-淀粉酶。采用切胶纯化得到纯酶,SDS-PAGE测得其相对分子质量为52ku。研究显示,该酶的最适作用温度为50℃,最适pH值为6.2,通过酶的稳定性研究发现该酶热稳定性较差,而pH值在4.86～10.47具有较好的稳定性。     

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种一个新的致病相关基因的克隆和鉴定

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)是十字花科植物重要的病原菌,能引起十字花科作物发生黑腐病.本课题组采用转座子Tn5gusA5对Xcc野生型菌株8004诱变,获得17280株Tn5gusA5突变体,并从中筛选到一批致病缺陷突变体,采用TAIL-PCR对致病缺陷突变体的Tn5gusA5插入位点进行定位,发现5株突变体的Tn5gusA5插在8004菌株的基因组ORF1857内(未发表资料), 该ORF功能尚未见报道.序列分析表明,ORF1857演绎的编码产物与铜绿假单胞菌(Pseudomonase aeruginosa)的wbpL基因演绎的编码产物具有33%的一致性和45%的相似性,并具有第4家族的糖基转移酶功能域,因此本文暂将ORF1857命名为wbxL基因.对 wbxL基因进行缺失,获得的缺失突变体用剪叶法接种到寄主萝卜叶片时,缺失突变体完全丧失致病性,一段PCR合成的包含wbxL基因的DNA片段能互补缺失突变体,恢复缺失突变体的致病性.这证实wbxL基因是Xcc的一个新的致病相关基因.     

几种杀菌剂对柑桔溃疡病的生物活性

为筛选防治柑桔溃疡病的有效药剂,按大田推荐使用浓度,用抑菌圈法测定17种非铜药剂和5种含铜药剂对柑桔溃疡病的毒力,并研究7种非铜药剂田间防治效果。结果表明,代森锰锌、福美双、福美双.溴菌腈、农用链霉素、金核霉素和琥胶肥酸铜.乙磷铝.硫酸锌抑菌作用最强,其次为福美双.福美锌、大蒜素、络氨铜.络氨锌和盐酸吗啉胍.乙酸铜,过氧乙酸、噻唑锌、春雷菌素、中生菌素、琥珀酸铜和噻菌铜有微弱的抑菌作用,百菌清、多菌灵、苯醚甲环唑、叶青双、复硝酚钠和井冈霉素无抑菌作用。大田试验结果表明,30%金核霉素WP 500 mg/L和72%农用链霉素WP 200 mg/L处理对柑桔溃病的防效分别为76.34%和74.94%,显著优于其它药剂处理;80%代森锰锌WP 2000 mg/L、50%福美双WP 400 mg/L和50%福美双.溴菌腈WP 500 mg/L处理对柑桔溃病的防效分别为70.36%、66.55%和69.37%,与对照含铜药剂20%噻菌铜SC 67 mg/L处理无显著差异;大蒜素和叶青双对柑桔溃病防效较差,6%大蒜素EC 120 mg/L和20%叶青双WP 400 mg/L处理对柑桔溃病的防效分别为41.84%和21.8...     

优化白菜类蔬菜遗传转化体系的研究

采用农杆菌介导法将双元载体质粒pBI35S-AMF分别导入"上海青"白菜和"油青"菜心,对影响转化频率的抑菌剂和感染菌株等主要因素进行比较,优化了白菜类蔬菜的遗传转化体系.结果表明,在白菜类蔬菜的遗传转化体系中,选择氨苄青霉素作为转化农杆菌的抑菌剂为好,其抑菌浓度以300 mg/L为宜;预培养时间和共培养时间分别以3 d和2 d为适;LBA4404/pBI35S-AMF菌株的感染效率远高于EHA105/pBI35S-AMF.对KanR转化植株做进一步的分子检测结果显示,Southern印迹杂交阳性率为82.2%,转化频率达2.8%,且外源片段为多拷贝插入.多批次的转化结果证实,该体系的转化频率稳定.     

甘蓝黑腐病菌XC3374基因功能的初步探究

【目的】初步探究XC₃374基因在甘蓝黑腐病菌Xcc8004中的功能,为深入研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004中L-天冬酰胺酶的功能奠定基础。【方法】从KEGG数据库内获取XC₃374基因的旁侧序列,通过常规PCR对其进行克隆,同时利用自杀质粒pK18mobSacB通过同源双交换的方法构建了其缺失突变体DM3374并检测其表型。【结果】以引物D3374L-F/D3374R-R扩增,野生型菌株能够扩增出1789bp的DNA片段,而候选突变体菌株能扩增出1367bp的片段;以内部引物3374F/3374R扩增,野生型菌株能扩增出332bp的片段,而候选突变体菌株不能扩增出任何片段,表明目标基因已缺失,缺失突变体DM3374构建成功。平板检测法结果表明,XC₃374基因突变后不影响胞外多糖及胞外酶的合成与分泌。在MMX基本培养基上,突变体菌株能够正常生长,形成的菌落大小与野生型菌株基本相同,表明缺失突变体不是营养缺陷性。游动平板检测结果表明,XC₃374缺失突变体的运动能力比野生型稍强,但差别不明显。采用剪叶法检测缺失突变体的致病性,结果表明,野生型Xcc8004和缺失突变体DM3374病斑平均长度分别为13.000和11.983mm,两者致病性无显著差异。【结论】XC₃374基因突变体在胞外多糖、几种胞外酶的合成与分泌、致病性等各种表型与野生型基本一致。     

黄单胞菌葡萄糖转运系统相关基因的敲除及功能分析

分别敲除了植物病原体野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris pv. campestris 8004）的3个葡萄糖转运蛋白和2个葡萄糖脱氢酶,获得了5株相应基因敲除的突变体。在营养丰富的培养基中,这5株突变体的生长曲线、胞外纤维素酶活性和胞外多糖量与野生型相比并无显著差异。在以葡萄糖为唯一碳源的M63培养基中,XC_2460基因的敲除显著影响了黄单胞菌的生长;在以CMC作为唯一碳源的M63培养基中,XC_2460基因的敲除使突变体的胞外葡萄糖累积量达到野生菌株的167倍。这些结果首次显示阻遏葡萄糖的跨膜转运是改进纤维素分解菌株积累葡萄糖量的有益途径。