抗逆相关基因GmDREB导入农杆菌的研究

利用改进的冻融法和电击法成功地将带有编码DREB转录因子GmDREB基因的prdGm-200双元载体分别导入根癌农杆菌EHA101、EHA105和LBA4404菌株中,同时探讨了影响冻融法和电击法转化效率的因素。结果表明:农杆菌细胞OD600约为0.6时冻融法和电击法的转化效率均较高。在利用冻融法转化农杆菌时,新制备的感受态细胞有利于提高转化效率。在进行电击法转化农杆菌时,电场强度和脉冲时间都对农杆菌的转化效率有影响。     

菊花遗传转化受体系统的研究

探讨了不同抗生素对菊花品种“玉人面”叶片不定芽分化和无菌苗生长的影响,并对羧卞青霉素、头孢霉素的抑菌效果及菌株LBA4404、EHA105对菊花的侵染性进行了研究,建立了“玉人面”的遗传转化受体系统。结果表明:叶片不定芽再生、无菌苗生根筛选的抗生素和临界耐受浓度分别为10 mg/L的G418、20 mg/L的卡那霉素;250 mg/L的抑菌抗生素不影响叶片外植体不定芽再生,两种抑菌抗生素均影响菊花苗的生长,总体规律是随抗生素浓度的递增,菊花苗生根数量递增,根长、苗高递减;两种抑菌抗生素均能很好的抑制农杆菌的生长并对“玉人面”有一定的侵染性。     

将TERF1基因导入糖橙的研究

用携带TERF1基因的EHA105和LB4404 2种农杆菌分别转化糖橙实生苗节间茎段.根据已建立的再生体系和转化体系,对已得到的抗性芽经PCR和RT-PCR检测,验证已获得7个转TERF1基因的糖橙株系.此外,还比较了2种农杆菌菌株对糖橙的浸染能力,结果表明,EHA105农杆菌的浸染能力强于LB4404.     

农杆菌介导的海岛棉茎尖再生体系及其遗传转化影响因子的研究

采用根癌农杆菌LBA4404和EHA105介导,对海岛棉的茎尖再生体系及其转化影响因子进行了研究。茎尖培养与棉花体细胞胚胎发生相比,不同基因型的茎尖再生频率差异不明显;在9种不同的激素组合中,以6-BA0.5 mg/L NAA0.1 mg/L与1/2MSB5 IBA 0.1 mg/L对茎尖的再生效果较好;获得较高转化频率的海岛棉培养条件为:海岛苗茎尖在OD600值为0.6~0.8农杆菌菌液中感染20~30 min,共培养3 d后进行转接,在含有不同激素和抗生素的各类培养基中进行抑菌和筛选继代培养,选择压以50~150 mg/L梯度进行;农杆菌以EHA105菌株的转化效果较好;抗性苗用SDS-CTAB法提取其总DNA,进行PCR扩增检测,有7株PCR检测呈阳性反应。由此,初步证明外源抗虫基因已经进入到再生植株的细胞核中。     

Acquisition of Insect-Resistant Transgenic Maize Harboring a Truncated cry1Ah Gene via Agrobacterium-Mediated Transformation

A novel insecticidal gene cry1Ah was cloned from Bacillus thuringiensis isolate BT8 previously for plant genetic engineering improvement. Truncated active Cry1Ah toxin has a toxicity level similar to that of the full-length Cry1Ah toxin. In this study, plant expression vector pMhGM harboring truncated cry1Ah gene was transformed into maize (Zea mays L.) immature embryos by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation at which maize alcohol dehydrogenase matrix attachment regions (madMARs) were incorporated on both sides of the gene expression cassette to improve gene expression. A total of 23 PCR positive events were obtained with a transformation efficiency of 5% around. Bioassay results showed that events 1-4 and 1-5 exhibited enhanced resistance to the Asian corn borer (Ostrinia furnacalis). These two events were further confirmed by molecular analysis. Southern blot suggested that a single copy of the cry1Ah gene was successfully integrated into the maize genome. Western blot and ELISA showed that the foreign gene cry1Ah was expressed stably at high level in maize and could be inherited stably over generations. The results of a bioassay of T1-T4 transgenic maize plants indicated that the transgenic plants were highly toxic to the Asian corn borer and their resistance could be inherited stably from generation to generation. Thus, events 1-4 and 1-5 are good candidates for the breeding of insect-resistant maize.     

农杆菌介导小麦遗传转化的影响因素

[目的]对农杆菌菌株、小麦品种、培养基状态及报告基因选择等进行优化筛选,为进一步完善农杆菌介导小麦遗传转化方法提供参考。[方法]用携带质粒pCAMBIA1304的农杆菌菌株LBA4404、EHA105,对温麦19、郑离03和郑离06小麦的幼胚愈伤组织进行遗传转化,从农杆菌菌株、小麦品种、共培养基状态及报告基因选择等方面进行探讨。[结果]农杆菌菌株EHA105转化效率较高,最高达到22.58%;姊妹系郑离03与郑离06的转化率差别极大,郑离06转化率最高而郑离03最低;农杆菌与愈伤组织共培养时,使用MS半固体培养基的转化率高于MS固体培养基;GFP和GUS都可以用作判断转化率的报告基因,GFP优势更明显。[结论]高毒性农杆菌菌株EHA105转化效率明显高于菌株LBA4404;小麦基因型是影响转化效率的重要因素之一;农杆菌与愈伤组织共培养时使用半固体培养基可提高转化率;通过GFP瞬时表达,可有效进行小麦转化效率的研究。     

根癌农杆菌介导转化籼稻影响因素的研究

选用我国籼型杂交稻中的几个重要亲本 ,以携带有双元载体 p CAMBIA1 3 0 1的根癌农杆菌 EHA1 0 5为载体 ,以GUS基因的瞬间表达为依据 ,研究根癌农杆菌介导转化籼稻的影响因素 ,确立对转化频率有重要影响的几个条件。结果表明 :经短期预培养 (4～ 5d)的幼胚是较为理想的转化受体材料 ;在共培养基中添加较高浓度的乙酰丁香酮 (3 0 0～ 4 0 0μmol/ L)可提高 GUS基因的瞬间表达频率 ;以 CC培养基作为共培养后抗性愈伤筛选的基本培养基有利于抗性愈伤组织的筛选培养。按此确立的条件 ,在特青、龙特甫 (B)、珍汕 97(B)、盐恢 559等籼稻品种或亲本中的 GUS瞬间表达率高达 80 % ,抗性愈伤组织转化率高达 70 %     

农杆菌介导瞬时沉默小麦HCP1的研究

【目的】建立农杆菌介导的瞬时沉默小麦HCP1的方法,为简便、快速、高效地研究小麦基因功能提供一种可靠的技术支持。研究HCP1在叶锈菌侵染过程中对H₂O₂的清除作用,为阐明小麦抗叶锈菌侵染中信号转导机制奠定理论基础。【方法】采用农杆菌注射法,将携带有peGFP载体的农杆菌注射到小麦叶片中,观察叶片中荧光强度及分布,分析外源质粒在小麦叶片中的表达情况。通过注射EHA105、LBA4404和C58C1 3种不同的农杆菌菌株,将HCP1的RNAi载体导入小麦叶片细胞中,利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR检测HCP1瞬时沉默效率,并结合Rohringer染色分析,明确不同农杆菌对寄主叶片侵染能力的强弱,从而筛选出最适的试验菌株。在瞬时沉默的小麦叶片上,接种不亲和叶锈菌小种260,利用DAB染色,观察接种叶锈菌后叶片中H2O2的变化,分析HCP1在小麦与叶锈菌互作过程中的功能。【结果】叶片GFP荧光观察结果说明,在注射农杆菌48 h后GFP开始出现较高表达。RT-PCR和qRT-PCR结果表明,注射C58C1菌株的叶片12 h后,HCP1的表达量开始降低,并持续保持较低的表达量。注射EHA105菌株的叶片,在注射后72-96 h,HCP1的表达量迅速降低。而注射LBA4404菌株的叶片中HCP1的表达量基本没有变化。所以在3种不同农杆菌菌株介导的HCP1 RNAi转化中,沉默效率依次为：C58C1≥EHA105＞LBA4404。注射不同农杆菌菌株叶片的Rohringer染色结果发现,EHA105侵染后引起的HR反应较其他两种菌株明显,说明EHA105对小麦叶片具有较高毒性,会引起叶片产生防卫反应,C58C1菌株在具有较高的沉默效率同时,对叶片的毒性较小,因此选取C58C1作为最适的试验菌株;沉默HCP1的小麦叶片接种叶锈菌小种260后,通过DAB染色发现,接种24 h和48 h后叶锈菌侵染诱发的小麦叶片H₂O₂的分布及积累量均多于对照组。【结论】建立了农杆菌介导的瞬时基因沉默体系,选用C58C1农杆菌菌株作为试验菌株,在处理后72 h可达到沉默目的基因的效果。确定HCP1参与了小麦与叶锈菌互作过程中H₂O₂的清除途径。     

甘蓝抗枯萎病基因FOC1植物表达载体构建及遗传转化

为研究甘蓝枯萎病抗性基因FOC1的抗性功能,利用前期克隆的FOC1基因,以pBI121质粒为植物表达载体,采用同源重组法构建FOC1基因的过表达载体;将构建好的重组质粒采用冻融法转入根癌农杆菌LBA4404菌株中,并通过农杆菌介导的甘蓝外植体转化法对感病甘蓝进行遗传转化,利用载体特异引物对获得的转基因植株进行PCR鉴定。结果表明,最终成功构建FOC1基因的过表达载体pBI121-35S-FOC1,并已成功整合到受体甘蓝基因组中。     

根癌农杆菌介导的人骨形成蛋白-3成熟肽基因向油菜转化的研究

用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)共培养法,将骨形成蛋白-3成熟肽(hBMP-3m)基因导入甘蓝型自交系油菜(BrassicanapusL.)品种秦油-3号,并获得了hBMP-3m基因整合到油菜基因组中的植株。试验所用外植体为油菜4～5d苗龄的下胚轴;根癌农杆菌为LBA4404,其Ti质粒pCAMBIA-hBMP3m含hBMP-3m基因。切取2mm左右的下胚轴侵染根癌农杆菌后在分化培养基(MS+5.0mg/L6-BA+0.3mg/LNAA)上共培养2d,然后转到附加25mg/L潮霉素和500mg/L羧苄青霉素的分化培养基上。切下分化出的茎芽,插入附加25mg/L潮霉素的生根培养基(MS+0.4mg/LIBA)中,形成完整的植株。经PCR检测和Southernblot分析,证实hBMP-3m基因已插入到油菜细胞基因组中。     

苹果叶盘法基因转化中抗生素种类和浓度的筛选

以苹果品种嘠拉试管苗为试材,研究了卡那霉素(Km)、潮霉素(Hm)对继代苗生长和离体叶片再生的影响,以确定叶盘法基因转化的选择压和转化体的筛选浓度;同时研究了不同浓度的头孢霉素(Cef)和羧苄青霉素(Carb)对苹果离体叶片再生的影响及对农杆菌EHA105和LBA4404的抑菌效果;以确定侵菌共培养后合适的抑菌抗生素种类和浓度。结果表明:Km10mg/L、Hm4.0mg/L完全抑制了叶片不定芽的分化,可作为苹果叶盘法转化时抗性芽的选择压;Km50mg/L、Hm5.0mg/L达到继代苗的半致死浓度,可作为转化后抗性苗的筛选浓度;由于抗性芽再生的选择压与抗性苗筛选浓度相差较小,Hm相对于Km更适合作为苹果基因转化的选择标记;培养基中附加Cef300mg/L能完全抑制农杆菌生长,对叶片不定芽的再生影响不大;而附加Carb则需400mg/L以上才能抑制农杆菌生长,同时严重抑制了叶片再生。因此,宜选用Cef作为苹果基因转化的抑菌抗生素。     

NtSKP1-GFP植物表达载体的构建及亚细胞定位

用PCR技术扩增NtSKPl基因的编码区,定向克隆至表达载体pCAMBIA1302上构建用于瞬时表达NtSKPl蛋白的重组质粒.重组质粒经PCR和测序鉴定后用冻融法转入农杆菌LBA4404,进而经农杆菌LBA4404介导转入烟草悬浮细胞,激光共聚焦显微镜观察确定其亚细胞定位.测序结果表明,插入片段与预期序列完全一致,与载体形成了一个完整的基因表达盒;亚细胞定位结果表明NtSKPl蛋白在胞浆和核部位均有分布.     

农杆菌介导大豆子叶节转化系统的优化

 【目的】研究影响大豆（Glycine max L.）子叶节外植体遗传转化的因素。【方法】以农杆菌转化系统为平台,用直接筛选法和延迟筛选法确定卡那霉素的筛选方法和浓度,以GUS基因的瞬时表达计算子叶节区GUS阳性率。【结果】延迟7 d进行Km选择、筛选压力为75 mg•L-1时选择效果最好;菌株培养阶段和侵染浓度分别在OD600为0.6和0.5时子叶节区GUS阳性率最高;黑农35、绥农14和合丰35为易感的大豆基因型;农杆菌菌株EHA101对大豆的转化能力好于LBA4404和AGL1;共培养培养基中添加的硫醇类化合物对T-DNA的转移有极强的影响效应。【结论】本实验方法可以优化农杆菌介导的大豆子叶节转化系统。     

根癌农杆菌介导的玉米自交系A188愈伤组织再生条件的优化

以A188玉米自交系的愈伤组织为材料,研究了影响农杆菌介导玉米转化和再生的各种因素,建立了该自交系的遗传转化体系。结果表明,1.0～1.5 mm的幼胚最易诱导出胚性愈伤组织;在侵染液和共培养基中加入乙酰丁香酮能显著提高转化效率;合适的菌液浓度(OD600=0.4)、共培养时间(3 d)、共培养温度(24℃)有利于提高转化效率。     

Study on Transformation of Oriental Hybrid Lily by Agrobacterium-mediated

An efficient procedure was described for the transformation of the monocotyledonous oriental hybrid lily, Lilium cv. Siberia. by Agrobacterium-mediated genetic transformation via leaves regeneration, The leaves of leaflets which derived from bulbs were sliced into 1.0 cm long and were co-cultivated with A. tumefaciens strain LBA4404/pB2AE12, which harbored a vector carrying the neomycin phosphotransferase, DREB2A genes in the T-DNA region. The suitable genetic transformation condition was determined as follows： the bacterial concentration reached 0.5-0.6 （OD600）, 15 min infection time, 20 mg.L^-1 acetosyingone, and 10.6 mmol.L^-1 NH4NO3 medium was used for co-cultivation 3 days, delayed 7 days for selecting by 30 mg.L^-1 kanamycin containing regeneration medium. Efficient shoot regeneration was observed on MS medium supplemented with 1.0 mg.L^-1 naphthaleneacetic acid, 0.5 mg.L^-1 benzyladenine and 0.1 mg.L^-1 Kinetin after about 6 weeks culture. The presence ofDREB2A gene in the genomic DNA of regenerated plants was detected by means of PCR analysis.     

谷胱甘肽还原酶基因的表达载体构建及对马铃薯的转化

 利用 ｐＧＲ２０２和 ｐＢｉｎ１９两种质粒经过 ｐＢＩ ２２２的改建，含有 ＣａＭＶ３５Ｓ启动子和 Ｎｏｓ终止子的 ＣＮ区ＤＮＡ片段与 ｐＢｉｎ１９的 Ｂｉｎ区 ＤＮＡ片段的不对称连接和目的基因 ＧＲ的 ｃＤＮＡ重组于真核表达双元载体三步亚克隆，筛选出一正向插入的谷胱甘肽还原酶基因的真核表达双元载体质粒ｐＢｉｎ－ＣＮ－ＧＲ。再利用此质粒转化的农杆菌ＬＢＡ４４０４进行马铃薯的遗传转化．并分化出卡那霉素抗性苗。过氧化物同工酶和酯酶同工酶谱带显示转化材料与对照之间存在显著的差异．表明转化材料的基因表达发生了变化。对转化影响因素的研究发现培养基的组成成分、选择压（Ｋｍ）添加浓度及加入时机是影响转化率的重要因素。     

甘露聚糖酶基因在烟草中的表达

构建了携带湖北大学生命科学学院分子微生物与基因工程实验室克隆的甘露聚糖酶基因的重组植物表达载体pLM50,转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,LBA4404),再用农杆菌介导的叶圆盘法对烟草(Nicotiana tabacumL.)叶片进行遗传转化,在含卡那霉素的MS筛选分化培养基上筛选。结果获基因转化烟草植株4株;经PCR、Western blot等方法检测,证明man基因在烟草转化植株中得了表达。     

农杆菌介导马铃薯转化体系的优化及转基因马铃薯的耐盐性研究

通过农杆菌介导的方式将獐茅液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(AlNHX)表达在马铃薯中,并对影响马铃薯转化的几种因素(抗生素浓度、农杆菌菌液浓度、共培养时间等)进行优化。结果表明:最适农杆菌菌液浓度是OD600=0.6,最适侵染时间是5min,最适共培养时间是2d,马铃薯转化中最适头孢霉素浓度是400mg/L;经PCR检测确认的转基因马铃薯植株在含0.7%NaCl的培养基中可以生长,而野生型马铃薯无法在此培养基中正常生长。在盐胁迫条件下,转基因马铃薯的Na~+、K~+含量及K~+/Na~+的比值均高于野生型马铃薯。研究证实马铃薯植物的的耐盐性可以通过农杆菌转化导入獐茅液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因而得到提高。     

农杆菌介导水稻幼胚转化获转基因植株

本研究以根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４（ｐＴＯＫ２３３）为供试菌株,以水稻幼胚为供试材料,对影响农杆菌介导基因的转化效率的因素进行了研究,确立了农杆菌介导的水稻高效转化体系。采用所确立的转化体系转化了Ｒａｄｏｎ、中国９１、０２４２８ ３个水稻品种（系）幼胚,结果表明,ｇｕｓ Ａ基因的瞬时表达率均在７０％左右,最高为７６％;ｇｕｓ Ａ基因稳定表达率均在２０％以上,平均为２３％。转基因植株的ＧＵＳ活性检测及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析表明,外源基因事于水稻基因组中,进行了有效地表达,且能稳定地遗传给后代,外源基因在后代遗传符合孟德尔遗传规律。     

蝴蝶兰·文心兰遗传转化体系的初步研究

[目的]优化蝴蝶兰和文心兰的遗传转化条件。[方法]以培养3周的蝴蝶兰原球茎和文心兰愈伤组织为试材,以大肠杆菌为生长培养基,研究3种农杆菌菌株的侵染力,以及菌液浓度、侵染时间、酚类诱导物(AS)和共培养时间对转化的影响。[结果]以蝴蝶兰原球茎为农杆菌介导的外植体进行遗传转化的优化条件为:预培养时间3d,菌液侵染浓度OD600=0.3,菌液侵染时间10min,pH值5.4,菌液侵染后,与农杆菌共培养5d并添加100μmol/LAS,此条件下的瞬间表达率最高。将蝴蝶兰遗传转化的条件运用于文心兰,得到的转化率较低。3种农杆菌菌株中,EHA105菌株侵染力最强,其次是AGL1,LBA4404最弱。[结论]该研究为进一步研究蝴蝶兰和文心兰的遗传转化体系提供理论依据。